Epilaci indukuje vlasů a pigmentace kůže prostřednictvím EDN3/EDNRB závislé na regenerační odpověď z melanocytů kmenových buněk

Epilaci indukuje vlasy a kůže hyperpigmentace v C57BL/6J myší

Obecně platí, že vlasové folikuly na hřbetní kůži myší zobrazení synchronizované první vlasy cycle15., Vlasové folikuly na celé hřbetní kůže jsou obvykle v anagenní z postnatální den 1-12, v catagen ze dne 16-19, a v telogenní poté až příští anagen11, 22, 23. Pro vizualizaci změn pigmentace kůže během postnatálního cyklu vlasů jsme depilovali oblasti hřbetního kmene a hlavy myší c57bl/6J v postnatálním dni 11 (P11) (fáze anagen VI v prvním cyklu vlasů), P21 (fáze telogen) nebo P30. Jak je znázorněno na obr. 1A, celá kůže byla homogenně černá Na P11 a homogenně Růžová na P21., Zajímavé však je, že u P30 byla pokožka hlavy stále růžová, zatímco zadní kůže byla černá (obr. 1A). Tyto údaje naznačují, že i když McSCs na pokožku hlavy vlasové folikuly diferencují na zralé melanocyty během prvního vlasů cyklu, nejsou aktivovány k regeneraci melanocytů v čase zpět, když vlasové folikuly jsou již v anagenní druhé vlasového cyklu. Proto jsme testovali, zda by epilace mohla v tuto chvíli aktivovat McSCs v pokožce hlavy., Tato epilace léčba výrazně indukované expresi zánětlivých faktorů, ale jejich úroveň je mnohem nižší, než toho, které bylo vyvoláno hojení zranění, což naznačuje, že epilace vyvolává pouze mírné formě poranění kůže (Obr. S1). Je zajímavé, že když vlasy z C57BL/6J myší byly vydepilovaná v P21 (jak již bylo zmíněno, v telogenní fázi prvního vlasy cyklus), pigmentace pokožky se výrazně zvýšil (6.06 ± 1, 5 krát, n = 9) již 7 dní později, na P28 (Obr. S2A, B) a epilační oblast vytvořily pigmentovaný ostrov (obr. 1B)., Obdobně, epilace-indukované regeneruje vlasy byly hyperpigmentovaných (2.68 ± 0.87 složit, n = 5) ve srovnání s chloupky non-vydepilovaná ovládací prvky (Obr. 1C, D). Tyto výsledky naznačují, že v pokožce hlavy může epilace vyvolat předčasnou repigmentaci kůže a hyperpigmentaci vlasů.

protože chloupky fyziologicky regenerují na zadní straně myší c57bl/6J během prvního postnatálního vlasového cyklu (obr. 1A), přemýšleli jsme také o tom, zda epilace vyvolá změny v regeneraci vlasů na zádech. Ve skutečnosti, 7 dní po epilaci u P21, byla epilovaná oblast hyperpigmentována ve srovnání s nepilovanou (obr. S2C, D), stejně jako jednotlivé regenerované chloupky (obr. S2E)., Tyto údaje naznačují, že hyperpigmentace vyvolaná epilací není omezena na pokožku hlavy. Vzhledem k těmto pozorováním jsme se také zeptali, zda účinky hyperpigmentace vyvolané epilací budou stále fungovat u starých myší. Je zajímavé, regeneruje vlasy v zadní části 1,5 roku staré myši se stal výrazně hyperpigmentovaných 30 dnů po epilaci (1.07 ± 0.08 složit, n = 3), ve srovnání s unepilated, spočívající chloupky (0.84 ± 0.03) (Obr. 1E, F). Kromě toho, HPLC analýza ukázala, že epilace indukuje eumelanin syntézy (1.79 ± 0.09 složit, n = 3) místo pheomelanin syntézy (0.97 ± 0.,12krát, n = 3) v zadních chlupech(obr. Galaxie). To naznačuje, že epilace indukuje aktivaci McSCs generovat buď více zralé melanocyty, nebo zvyšuje syntézu melaninu v zralé melanocyty v vlasové cibulky ve věku myší.

Epilace-zranění stimuluje McSC proliferaci a indukuje generace dermální a epidermální melanocyty a vyjádření melanogeneze-příbuzných genů

Vzhledem k tomu, že melanogeneze je spolu se anagen24, zkoumali jsme, zda epilace-vyvolané pigmentace v pokožce hlavy je způsobena anagenní indukce. Jak je znázorněno na obr., 2A, epilace-indukované vlasové folikuly začal anagenní okamžitě, zatímco v non-vydepilovaná ovládání myší, vlasové folikuly zůstaly v telogenní pro delší časové období. Proto klidový vlasový folikul McSCs reagoval na epilaci aktivací. Sedm dní po epilaci byly pigmentované melanocyty pozorovány nejen u zralých vlasových žárovek, ale také v dermis, otvorech vlasových folikulů a interfolikulární epidermis (obr. 2A)., Obdobně, melanocyty-specifické markery, jako jsou PMEL17 a TYR byly zjištěny v epilaci vyvolané pigmentové regionech, ale ne v ovládání vlasových folikulů (Obr. S4A). Kromě toho, western blot údaje ukázaly, že hladiny melanogeneze-příbuzné proteiny TYRP1 (4.22 ± 0.96 složit, n = 6) a TYR (9.75 ± 2.76 složit, n = 6) byli oba významně zvýšil o epilaci (Obr. S4B a S9). Výsledky naznačují, že epilace nejen aktivuje McSCs, ale také indukuje regeneraci melanocytů k naplnění interfolikulárních oblastí.,

V zadní kůže, 7 dní po epilaci na P21, celkový počet melanocytů v každé vlasy žárovka (20 ± 1.9) byla významně zvýšena ve srovnání s fyziologickou regeneraci (15.7 ± 1.4) (Obr. 2B)., V regenerovaných vlasových žárovkách indukovaných epilací bylo také více melanosomů než ve fyziologicky regenerovaných vlasových žárovkách(obr. 2C a obr. S4C, D). Tyto údaje naznačují, že epilace vyvolala hyperproliferaci McSC během prvního postnatálního vlasového cyklu. Opravdu, 3 dny po epilaci, McSCs proliferaci sazba byla vyšší (86.2 ± 3,5% buněk byly Ki67-pozitivní po epilaci ve srovnání na 45,6 ± 3,4% buněk pozitivních na Ki67 v kontrolách) (Obr. 2D)., Zajímavé je, KIT-pozitivní buňky nebyly nalezeny v epidermis, ale existovaly ve vlasech boule 1 den po epilaci a jasně přítomen v epidermis 3 dny po epilaci (Obr. 2E a obr. S5). Počet Kit+ buněk v vydepilovaná epidermis (2.32 ± 0.72/sekce, n = 4) se výrazně zvýšily ve srovnání s fyziologickými epidermis (0.77 ± 0.68/sekce, n = 4) (Obr. 2F). Odpovídajícím způsobem, 7 dní po epilaci, byly v epidermis také nalezeny pigmentované buňky (obr. 2E, F)., Kromě toho, kvantitativní RT-PCR 7 dnů po epilaci odhalil indukce mnoho melanogeneze-příbuzných genů, včetně Tyr (2.84 ± 1.13 přeložte přes kontrolní, n = 3), Tyrp1 (3.89 ± 0.72 složit, n = 3), Mitf (3.47 ± 0.38 složit, n = 3), Sox10 (2.13 ± 1.13 krát, n = 3), Pax3 (3.18 ± 0.43 složit, n = 3) a Ednrb (3.28 ± 0.62 složit, n = 3) (Obr. S6A). Společně tyto výsledky naznačují, že epilace indukuje proliferaci McSCs, migraci do epidermis a stimulaci programu melanogeneze.,

Epilaci indukuje EDN3 výraz v vlasové folikuly a pokožku

Mezi geny indukované epilaci, EDNRB byl zvláštní zájem, protože jeho dobře známé zapojení v regulaci melanocyty lineage1, 12. Nedávno bylo hlášeno zvýšení exprese jeho ligandů Edn1 a Edn2 během fyziologického anagenu vlasů, ale jeho výraz ligand Edn3 nebyl ovlivněn12. Proto jsme přemýšleli, zda epilace zadních vlasů vyvolá tyto ligandy., V potvrzení výše uvedených výsledků, jsme zjistili, že během fyziologické regenerace, výraz Edn1 a Edn2 byly zvýšeny v zadní kůže na P26, ale Edn3 výraz neprokázaly žádné změny (Obr. 3A a obr. S11). Překvapivě však epilace nejen vyvolala expresi Edn1 a Edn2, ale také exprese Edn3(obr. 3A), jehož kódovaný produkt, EDN3, byl dříve prokázán, že se podílí na vývoji melanocytů 1, 25, 26. Proto jsme naši studii zaměřili na EDN3 a jeho signalizační dráhu. Zjistili jsme, že hladina edn3 proteinu byla významně zvýšena v epilované kůži (D0, 0.,94 ± 0,2 krát; D3, 1.81 ± 0.09 složit; D5, 4.57 ± 0.67 složit; n = 6), ale zůstala nízká v ovládacích kůže (D0, 1.25 ± 0.47 složit; D3, 0.83 ± 0.14 složit; D5, 1.21 ± 0,2 krát; n = 6) (Obr. 3B a obr. S12). Imunohistochemie ukázala, že v den epilace 1 byl protein EDN3 zvýšen v dermální papile, epidermis a sekundárních zárodcích vlasů. V den 7 byl také zvýšen v otvorech vlasových folikulů(obr. 3C). Regiony s vysokou epilace-indukované EDN3 úrovně byly v úzkém kontaktu s McSCs v sekundárním vlasy klíčků (sHG) nebo s vlasy žárovka melanocytů., Pomocí dospělých heterozygotní Ednrb lacZ /+ myší, pak jsme zjistili, že EDNRB je vyjádřena v pigmentovaných melanocytů z vlasových kořínků a v sHG, podobné expresi Dct-lacZ v vlasových folikulů (Obr. 3D). Kromě toho údaje o imunitě ukázaly, že β-gal pozitivní buňky byly spoluznačeny Kit-pozitivními buňkami v sHG a mitf-pozitivními buňkami ve vlasové žárovce (obr. 3e), což naznačuje, že EDNRB je exprimován v McSCs a melanocytech., As expected, 7 days after epilation, western blot analysis and immunostaining data showed that Ednrb-lacZ expression is significantly increased in melanocytes (Figs S6B,C and S13). These results suggest that epilation induces EDN3, which then stimulates its receptor EDNRB to regulate McSCs and melanocytes.

EDN3 je dobře známá pro své účinky na stimulaci růstu a diferenciaci melanocytů precursors1, 25, 26., V poslední době, zvýšená exprese transgenní EDN3 bylo hlášeno, aby se zabránilo šedivění vlasů způsobené opakovaně epilation27, což naznačuje, že EDN3 také ovlivňuje McSCs. Prozkoumat účinek EDN3 na McSCs, izolovali jsme DCT+ buněk z E16.5 wildtype epidermis a stimulovat je s EDN3 nebo BQ788 (EDNRB inhibitor). Jak je znázorněno na obr. S7A, stimulace s EDN3 výrazně zvyšuje proliferaci sazba DCT+ buněk (z 43.7 ± 2% a 61,4 ± 7.5%, n = 5), ale tento účinek EDN3 byl zcela blokován BQ788 (26.4 ± 1.56%, n = 5)., Na základě skutečnosti, že pro nepigmentovaná buněk, DCT je specifickým markerem McSCs a že neexistují žádné zralé melanocyty v E16.5 epidermis4, 28, výsledek naznačuje, že EDN3/EDNRB je nutné pro McSC šíření.

Ednrb je nutné pro epilaci-indukované vlasů a pigmentace kůže

vyhodnotit význam EDNRB signalizace pro epilaci vyvolané hyperpigmentace kůže, použili jsme homozygotní Ednrb lacZ/lacZ (Ednrb−/−) myší. Takové myši jsou z velké části bez pigmentových buněk, ale zachovávají pigmentované skvrny na základně hlavy a ocasu., Čtrnáct dnů po epilaci v oblasti hlavy, regenerační vlasy byly hyperpigmentovaných v wildtype myší (2.41 ± 0.55 složit, n = 5), ale ne v Ednrb−/− myší (Obr. 4A, B). V unepilated Ednrb−/− myší, melaninu z vlasové hřídele byly nižší (0.51 ± 0.06, fold, n = 5) ve srovnání s těmi v kontrolní wildtype myší (1.02 ± 0.14 složit, n = 5) (Obr. 4B). Kromě toho byla repigmentace kůže významně zvýšena u myší wildtype, ale jen mírně u myší Ednrb−/− (obr. 4C). Kůže melaninu vyvolané epilaci byly výrazně nižší v Ednrb−/− myší (1.85 ± 0.,79 fold, n = 9) ve srovnání s těmi u myší wildtype (5,1 ± 0,62 fold, n = 9). Tyto výsledky naznačují, že delece Ednrb narušuje epilaci indukovanou hyperpigmentaci vlasů a repigmentaci kůže. Kromě toho je ztráta EDNRB spojena s šedivěním vlasů. Melanin úrovně pigmentované vlasy hřídele Ednrb−/− myší byla snížena mezi jednoho měsíce věku (0.96 ± 0.1 složit, n = 4) a až 12 měsíců věku (0.37 ± 0.12, fold, n = 4), v kontrastu s jejich úrovní v vlasy hřídele wildtype myší (1.96 ± 0.17 složit, n = 4 na jeden měsíc; 2.15 ± 0.43 složit, n = 4, na 12 měsíců) (Obr. S7B).,

posoudit, zda EDNRB signalizace je nutné pro epilaci vyvolané hyperpigmentace v zadní kůže, jsme se provádí intradermální injekcí BQ788, po epilaci of wildtype myší. Jak je znázorněno na obr., 4D, zatímco kontrola intradermální injekce NaCl po epilaci povoleno pro kožní hyperpigmentace (z 0,23 ± 0.06 krát až 1,0 ± 0.15 složit, n = 3), injekce BQ788 výrazně snížil epilace-vyvolané pigmentace kůže (0.76 ± 0.1 složit, n = 3). Toto zjištění naznačuje, že farmakologické narušení EDNRB může blokovat epilaci indukovanou hyperpigmentaci kůže v zadní kůži. Společně tyto údaje naznačují, že pro epilace indukovanou hyperpigmentaci je nutná signalizace EDNRB.,

EDNRB ovlivňuje McSC šíření v vlasové folikuly a reguluje melanogeneze-related gene expression

prozkoumat, jak nedostatek Ednrb snižuje pigmentace kůže, jsme histologicky analyzoval pigmentace vlasových folikulů na pokožce hlavy (které, jak již bylo zmíněno, zůstává pigmentovaná v Ednrb−/− myší v kontrastu k zadní). Jak je znázorněno na obr., 5A, 5. den po epilaci, vlasové cibulky a vlasy šachty z Ednrb−/− myši byly normálně přítomné v pokožce hlavy, ale byly hypopigmented ve srovnání s wildtype myší, což naznačuje, že ztráta EDNRB nemá vliv na vlasy cyklu, ale snižuje melanocyty čísla nebo syntézu melaninu v žárovce. Po 7 dnech po epilaci byl melanosomový počet ednrb – / – myší mnohem nižší než počet myší wildtype (obr. 5B)., Kromě toho, melanocyty-specifické markery, jako jsou PMEL17 a TYR nemohl být detekován v dermis, otvory vlasových folikulů, nebo interfolikulární epidermis Ednrb−/− myší 5 dnů po epilaci, i když jsou přítomny v nízkých koncentracích v vlasové cibulky (Obr. S7C). Dále markerová sada McSC a pigmentované melanocyty zůstaly nezjistitelné i 7 dní po epilaci (obr. 5C a obr. S7D). Tyto výsledky naznačují, že EDNRB je nutný pro regeneraci epidermálních melanocytů indukovaných epilací.,

analyzovat, jak ztráta EDNRB snižuje melaninu úrovni vlasové cibulky, pak jsme kvantifikované melanocyty čísla v každé vlasy žárovka wildtype a Ednrb−/− myší 7 dnů po epilaci., Počet MITF-positivních buněk na epilaci byl nižší u každého vlasového folikulu z Ednrb−/− myší (11.7 ± 2.2) ve srovnání s vlasových folikulů v wildtype myší (15.7 ± 1.43) (Obr. S7D). Tento výsledek naznačuje, že ztráta EDNRB by mohla blokovat proliferaci melanocytů lineage buněk vyvolanou epilací. V poslední době, Takeo et al. zjistil, že během fyziologické regenerace vlasů je nutná signalizace EDNRB také pro proliferaci a údržbu Mcscs29. Nicméně, zda EDNRB ovlivňuje proliferaci McSC indukovanou epilací, nebylo dosud známo., Od EDN3 je vyjádřena v dermální papily blízko takových památek, zralé melanocyty v vlasové cibulky, které jsme testovali, zda EDN3/EDNRB signalizace ovlivňuje McSC šíření v ardenách nebo stimuluje syntézu melaninu v folikulární melanocyty. V pokožce hlavy, anti-KIT a Ki67 immunostaining data ukázala, že 3 dny po epilaci, McSC šíření v každé vlasy boule Ednrb−/− myší (52 ± 5.2%) byl nižší než v odpovídající boule wildtype myší (86.2 ± 3.5%) (Obr. 5D). To naznačuje, že EDNRB je také vyžadován pro epilaci indukovanou proliferací McSC ve vyboulení vlasů.,

abychom získali další informace o základních mechanismech, izolovali jsme melanocyty pro kultivaci in vitro. Jak je znázorněno na obr. 5E, pigmentace Ednrb−/− primární melanocytů z pigmentovaná hlava vlasové folikuly P6 Ednrb−/− myší byla nižší (0.47 ± 0.1 složit, n = 5) než u wildtype primární melanocytů (1.0 ± 0.1 složit, n = 5). Podobné výsledky byly získány v buněčných peletách nebo při přímém měření obsahu melaninu (obr. 5F). Poté jsme analyzovali, zda signalizace EDNRB ovlivní expresi genů souvisejících s melanogenezí. Jak je znázorněno na obr., 5G, 7. den po epilaci, výraz melanogeneze-související genů byla snížena v Ednrb−/− skalp, včetně exprese Pax3 (0.47 ± 0.07 složit, n = 3), Tyr (0.55 ± 0.05 složit, n = 3) a Tyrp1 (0.5 ± 0.02 složit, n = 3). To naznačuje, že signalizace EDN3/EDNRB se podílí jak na proliferaci melanocytů, tak na melanogenezi během regeneračních reakcí McSCs indukovaných epilací. Společně tato zjištění naznačují, že epilace indukuje genovou expresi související s melanogenezí prostřednictvím signalizace EDN3 / EDNRB a zase vede k hyperpigmentaci kůže a vlasů.