Úvod
Bacillus thuringiensis a dalších 7 druhů výtrus tvořící Gram pozitivní bakterie, včetně B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, a. B. mycoidesare, jsou primárně detekován v půdě. Vzhledem k tomu, že tyto bakterie jsou velmi podobné v genotypu a fenotypu, jsou bakterie klasifikovány jako skupina B.cereus v taxonomii (Park et al., 2007). B., cereus a B. thuringiensis jsou v potravinách vysoce detekovatelné, protože jsou pozorovány v surovinách ze zemědělské půdy během pěstování a distribuce. Kromě toho tyto dvě bakterie obvykle nejsou v klinické diagnostice diskriminovány. B. cereus je druhé riziko prioritní skupina alimentárních onemocnění v čerstvé zemědělské produkty, a jeho znečištění je jedním z hlavních problémů v zelenině (Felício et al., 2015). Zejména B., thuringiensis byl používán jako pesticid při pěstování určité plodiny, a to je dobře-známý jako mikrobiální insekticidy, které byly použity ke snížení množství chemických pesticidů (Azmi et al., 2015).
B. thuringiensis produkuje insekticidní proteiny, které jsou hlavním typem Krystalické (Plakat) bílkoviny (Kutasi et al., 2016). Naopak aktivně rostoucí vegetativní buňky, které postrádají produkci krystalů, vedou k netoxickým účinkům. Δ-endotoxiny obsahují hlavně Cytolytika (Cyt) a Cry (Elleuch et al., 2015; Rao et al., 2015)., Nicméně, Cyt a Cry mají různé sekvenční homologie, i když se skládají z podobných způsobů působení na buněčnou lýzu, což vede k trvalému poškození hmyzu midgut (Adang et al., 2014).
strukturální variace čtyři δ-endotoxiny (Cry1, Cry2, Cry3, a Cyt2Ah) byla pozorována pomocí X-ray krystalografie (Dehury et al., 2013). Tyto geny jsou identifikovány v transgenní bavlně a jiné zelenině, které jsou výrazně účinné při kontrole škůdců., Návrh biomarkeru pro přeložený produkt se liší podle různých kategorií cry proteinu; proto bude detekce složitá. Genové sekvence 16S rRNA založené na univerzálních primerech vykazovaly vysokou podobnost (>99%) mezi B.cereus a B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), které nelze klasifikovat pomocí genetických a fenotypových testů (Peng et al., 2015). Dále se od roku 2000 diskutuje o tom, zda by celá skupina B.cereus měla být považována za komplexní druh různých bakterií (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz a Marjańska, 2017). Tam jsou také návrhy, že fylogeneze tyto bakterie se lépe hodí k jejich ekologické vlastnosti (psychrotolerance, virulence), než taxonomické příslušnosti (Drewnowska a Swiecicka, 2013; Bartoszewicz a Marjańska, 2017). Abychom tento problém vyřešili, zaměřili jsme se na XRE k detekci B.thuringiensis, který řídí hlavní typ produkce krystalových bílkovin.
tyto dvě bakterie jsou velmi podobné biochemickým výsledkům (Böhm et al., 2015) a genetické vlastnosti (Osman et al., 2015). Cho et al., (2015) také uvádí, že genetické a fenotypové vlastnosti mezi těmito bakteriemi jsou stěží rozlišitelné. Dále, Pfrunder et al. hlásil, že druhy skupiny B.cereus nelze spolehlivě identifikovat pomocí klasického biotypování (Pfrunder et al., 2016). Na základě toho nemusí biochemické experimenty stačit k diferenciaci. Místo toho byla přítomnost insekticidního krystalového proteinu použita jako rozlišující charakteristika k odlišení těchto bakterií (Ekino et al., 2014; Wei et al., 2018).,
některé faktory, které tyto dvě bakterie odlišují, jsou založeny na jejich patogenitě ve vzorcích. B. cereus způsobuje gastrointestinální poruchu, zatímco B. thuringiensis byl také zapojen do epidemií průjmu. Jak bylo oznámeno, rozlišovací charakteristikou B. thuringiensis je přítomnost insekticidní krystal bílkoviny (δ-endotoxin) šifrované cry genů (Osman et al., 2015; Albright et al., 2016). Vzhledem k tomu, že metoda identifikace pomocí biomarkeru pro diferenciaci B., skupina cereus je složitá a časově náročná, vysoce účinný biomarker je naléhavě potřebný k nahrazení předchozích, které daly nižší účinnost a někdy dokonce vykazovaly falešné výsledky. Na základě dvou konkrétních genů, transkripční regulátor a crystal protein genů pro B. thuringiensis (Porcar a Juárez-Pérez, 2003; Han et al., 2006), aktuální studie byla provedena prohlédnout a porovnat účinnost navržen biomarkerů (XRE), že stávající crystal protein marker (cry2) při identifikaci B. thuringiensis od B. cereus skupiny kmenů (Bcg) a non-B., kmeny skupiny cereus (jiné než B) v potravinách. cry2je nejběžnější krystalový protein přítomný v B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma et al., 2014).
Materiály a Metody
Kultur Bakterií Příprava
Všechny 120 kmenů, včetně 111 Bcg a 9 non-B, byly získány z bakteriální sbírek ve Spojených Státech a Jižní Koreji (Doplňující Tabulka 1). Mezi sbírkami byl B.thuringiensis ATCC 10792 (Typ kmen) použit pro optimalizaci experimentálních podmínek konvenčních PCR a PCR v reálném čase., Všechny kmeny byly rozmrazeny při pokojové teplotě (25°C) a pruhované na živném agaru (Difco, MI, Spojené státy americké). Po kultivaci po dobu 24 h při 35°C v inkubátoru, čisté kolonie byl vybrán a naočkovat v tryptic soy bujónu (Difco, MI, Spojené Státy) a přes noc kultur byly použity pro další experimenty.
návrh primeru a izolace DNA
příslušné primery zaměřené na XRE pro diferenciaci B., thuringiensis (Tabulka 1) byly navrženy podle následující sekvence Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gene – 3664610-3665047) za použití Primer Express® Software (Verze 3.0.1) od Applied Biosystems nachází v CA, Spojené Státy a syntetizovány Bioneer Corporation z Daejeon, jižní Korea. Výkon navrženého XRE byl porovnán s cry2 (Ben-Dov et al., 1997). Po 24 h obohacení v TSB byl alikvot 1 mL bakterií podroben extrakci genomové DNA pomocí Prepman ® Ultra preparation preparation Reagent (Applied Biosystems, CA, Spojené státy americké)., Koncentrace DNA byly měřeny fluorescencí Eppendorf Biospectrometr® (Eppendorf, Hamburk, Německo) a upraveny na 10 ng/µL. Vzorky DNA byly před použitím uloženy při -20°C.
Tabulka 1. Oligonukleotidové primerové sekvence používané v této studii.
Konvenční PCR a Real-Time PCR Assay
konvenční PCR byly připraveny s C1000 TouchTM Thermal Cycler z Bio-Rad nachází se v Hemel Hempstead, Spojené Království., Reakční zkumavky pro PCR použity Accu-Power® Pyro Hot Start Taq PCR Pre-Mix od Bioneer Corporation nachází se v Daejeon, Korea a objemem 20 µL, 1 µL každého primeru (10 pmoL/µL) a 2 µL DNA. Amplifikační podmínky pro konvenční PCR pro transkripční regulátor (XRE) byly: počáteční denaturace při 95°C po dobu 5 min, následovalo 35 cyklů denaturace při 95°C po dobu 30 s, žíhání na 49°C po dobu 30 s a elongace při 72°C po dobu 30 s a závěrečná elongace při 72°C po dobu 5 min., Upřesnění podmínek pro crystal proteinů (Cry 2), byly: počáteční denaturace při 95°C po dobu 5 min, následovalo 35 cyklů denaturace při 95°C po dobu 30 s, žíhání při teplotě 55°C po dobu 30 s a elongace při 72°C po dobu 1 min, a závěrečná elongace při 72°C po dobu 5 min. Po zesílení DNA, 1,5% (W/v) agarózový gelový roztok obsahující roztok nukleové kyseliny RedsafeTM 20 000 × (Intron Biotechnology, Inc.) byla připravena a gelová elektroforéza byla provedena za použití Sub-buněčného modelu 192 z Bio-Rad umístěného v Hemel Hempstead, Spojené království., Kapely byly vizualizovány pomocí systému Smart View pro UVCI-1100 Imager od společnosti Major Science se sídlem v CA ve Spojených státech. Přesnost (AC) byla použita pro vyhodnocení metodou PCR s použitím primerů XRE a cry2 v detekci B. thuringiensis z Bcg a non-B. Negativní dohody (NA) znamená, že stejný negativní výsledek pro non-B. thuringiensis pomocí PCR s XRE a cry2. Pozitivní dohoda (PA) znamená stejný pozitivní výsledek pro B.thuringiensis pomocí PCR s XRE a cry2. Přesnost (AC) se měří pomocí následující rovnice, AC = ×100% (Ma et al., 2014).,
experimenty PCR v reálném čase byly prováděny systémem StepOneTM real-time PCR z aplikovaných biosystémů umístěných v CA ve Spojených státech. Reakční objem 20 µL sestávající z 10 µL tavné hlavní směsi s vysokým rozlišením Doctortm (HRM), 2 µL DNA, 0,5 µL primeru F/R (10 pmoL/µL) (Tabulka 2). Podmínky zesílení qPCR byly: počáteční denaturace při 95°C po dobu 10 minut a 40 cyklů při 95 ° C po dobu 15 s a 60°C po dobu 1 minuty. Poté byla při následné analýze tavicí křivky nastavena teplota na zvýšení z 60 na 95°C při 0,3°C/cyklu, aby se otestovala specificita primeru.,
Tabulka 2. Detekce skupiny B. cereus a non-Bacillus sp. cílení biomarkerů XRE a cry2 pomocí PCR.
Vyhodnocení Real-Time PCR Assay
výkon XRE a cry2 byla hodnocena pomocí 50 B. thuringiensis kmenů, zatímco exkluzivita byla testována pomocí 70 necílové bakterie, včetně 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg, a 9 non-B (Chelliah et al., 2017). Standardní křivka byla provedena pomocí 10násobného ředění DNA extrahované z B.thuringiensis ATCC 10792., Koncentrace DNA byla upravena z 10 ng/µL 100 fg/µL, což odpovídá 2,6 × 106 2,6 × 10 CFU, a amplifikace byla provedena pomocí PCR v reálném čase s kopie. Pro negativní kontroly byla použita destilovaná voda. Negativní výsledky nebo žádné amplifikační křivky byly zváženy, když hodnoty prahové hodnoty cyklu (Ct) byly vyšší než 40.
Detekce B. thuringiensis v Obohacených Vzorcích Potravin
Salát (Lactucasativa), Kimbab, a špenát (Spinaciaoleracea) byly zakoupeny od místní trh v Chuncheon, jižní Korea., Vzorky byly testovány na nepřítomnost cílových bakterií podle ISO 7932 (2004). Aliquot 50 g každého druhu jídla byl připraven ve sterilním sáčku na stomacher od Nasco Whirl-Pak umístěném ve WI ve Spojených státech. Přes noc B. thuringiensis kultury byly ředí v 0,5% peptonu vody a používá se pro přípravu uměle kontaminované vzorky s očkováním úrovně od 103 až 105 CFU/g (Chon et al., 2012; Kim et al., 2013). Alikvot 1 mL suspenze vzorků potravin byl přenesen do nové sterilizované trubice a použit pro extrakci DNA.,
Výsledky a Diskuse
Detekce B. thuringiensis Pomocí cry2 Gen
Pro 120 kmenů, amplifikačních produktů přibližně 700 bp byly získány pomocí primerů cry2 (Tabulka 1). Jak je uvedeno v Tabulce 2 a na Obrázku 1, při použití PCR cílení cry2, 6 B. cereus kmenů a 36 B. thuringiensis kmenů (72%) byly zesíleny. Žádná jiná skupina B. cereus nebo skupina B nebyla zesílena. To ukázalo přesnost 82% cry2 pro detekci skupin B. cereus. U 120 testovaných kmenů dal 100 kmenů NAs nebo PAs, což naznačuje celkové procento přesnosti 83.,3% (Doplňková Tabulka 1). Zatímco Riojas et al. (2015) uvádí, multiplex PCR non-ribosomal peptide syntázy (NPR) genu cry1 identifikovat, B. cereus a B. thuringiensis se specifičnost 24,5% v B. cereus a 15% v B. thuringiensis.
Obrázek 1. Konvenční výsledky PCR za použití 2 primerů (XRE a cry2) zaměřených na 2 geny (transkripční regulátor a geny krystalového proteinu) specifické pro B.thuringiensis se 120 kmeny. (A) jsou výsledky PCR 120 kmenů používajících XRE a (B) jsou výsledky PCR pomocí cry-2., Lane M, 100 bp žebřík; T1-T16 znamená počet 8-pás trubice a podrobnosti o každém jízdním pruhu je uveden v doplňkové tabulce 1.
To bylo hlásil, že B. thuringiensis kmen může syntetizovat jeden nebo více krystalů proteiny, protože jeden nebo více crystal toxin geny byly nalezeny pro B. thuringiensis. Hlavním důvodem rozmanitosti toxinových genů je přenos plazmidů v B. thuringiensis (Adang et al., 2014). Je to častý proces přenosu plazmidů buď konjugací nebo mobilizací (Makart et al., 2017)., Dále výměny cry geny generovat B. cereus s novým vazba výkřik, který vede k podobnosti B. cereus a B. thuringiensis (Fiuza, 2015). Kromě toho, s jiným zdrojem izolace, cry geny vykazovaly rozdíl v rozmanitosti a distribucích. Například v každém stanovišti lze nalézt nový cry gen, který vykazuje odlišnou insekticidní aktivitu.
detekce B. thuringiensis pomocí genu XRE
potenciální kódovací sekvence (CDS) byly předpokládány jako transkripční regulátory., CD obsahuje helix-turn-helix (HTH) motiv v XRE-jako protein rodiny a MerR rodina transkripční regulátory, dříve odpovídající XRE genové sekvence v pBMB28 z B. thuringiensis YBT-020 a pCT281 z B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, který souvisí s transkripčním regulátorem typu HTH, SinR, byl totožný s odpovídajícím prvkem pG9842 B.cereus G9842 (GenBank: CP001187). Proteiny HTH se spolu s faktory sigma účastní široké škály signálních drah, například jako represory, které inhibují sporulaci (Murawska et al.,, 2014), tvorba biofilmu (Colledge et al., 2011) a sekrece proteázy (Pflughoeft et al., 2011). Na rozdíl od Cry1Ab21 a δ-endotoxin zakódované v toxigenic plasmidu pIS56-63, které jsou zodpovědné za konjugaci a sporulace (Martínez-Núñez et al., 2010; Deng et al., 2014) navíc s 53 různými kódovanými domnělými bílkovinami.
výsledky PCR s XRE ukázaly, že žádný z 58 B.cereus nebo non-B nedal zesílení (Tabulka 2 a Obrázek 1). Celkově z 50 kmenů B. thuringiensis 47 vykazovalo pozitivní výsledky (94%). To ukázalo přesnost 97.,3% XRE pro detekci B. thuringiensis mezi testovanými skupinami B. cereus. Pro 120 testovaných kmenů, 117 kmenů dal NAs nebo PAs, což naznačuje, že celkové procento přesnosti 97,5% (Doplňující Tabulka 1).
Standardní Křivky a Zesílení Účinnosti
real-time PCR byla provedena použitím DNA extraktů z čisté kultury B. thuringiensis typ kmen ATCC 10792 cílení XRE gen. Vyvinutý test PCR v reálném čase byl účinný pro detekci koncentrací od 2, 6 × 10 do 2, 6 × 106 CFU/reakce, které pokrývaly 6 řádů., Rovnice čísla kopie protokolu versus hodnota Ct pro B. thuringiensis byla y = -3.853 x+21.244 s hodnotou R na druhou 0.993, což naznačuje vysokou linearitu (Obrázek 2).
Špičatý Vzorků Potravin Detekce
v Poslední době, B. thuringiensis byly hlášeny být detekován v potravinách, jako jsou mléko, čerstvé ovoce a obilovin, které byly pěstovány a sklizeny z půdy mimo zemi., Spotřeba surové a minimálně zpracované zeleniny je považována za přirozenou a zdravou, ale byly vzneseny obavy týkající se zbytkových chemických pesticidů v čerstvé zelenině (Chiu et al., 2016). Tak, spotřebitelé obrátili svůj zájem na bio zeleninu (chemické zdarma zeleniny), a předpokládá se, že bio-pesticidy, včetně B. thuringiensis, může odpovídat za 20% světových pesticidů na trh do roku 2020 jako náhrada za chemické pesticidy (Watts a Williamson, 2015)., V této studii byl výkon PCR zaměřeného na XRE v reálném čase hodnocen pomocí 3 druhů uměle kontaminovaných vzorků potravin (salát, kimbap a špenát). Čerstvé jednodenní kultury B. thuringiensis byly naočkovány do každého vzorku potravin. Real-time PCR může úspěšně detekovat B. thuringiensis v koncentraci 4,8 × 103, 3.4 × 103, a 1,5 × 103 CFU/g, hlávkový salát, kimbap a špenát, respektive (Obrázek 3). U vzorků kimbap však byly hodnoty Ct vyšší, protože obvykle obsahují složitější materiály, jako je klobása, vejce nebo mrkev ve srovnání se zeleninou.,
Závěr
Od B. cereus skupiny jsou velmi podobné v biochemických i genetických profilů, nový biomarker, byla vyvinuta pro identifikaci a rozlišování B. thuringiensis od úzce souvisí skupiny. Výkon XRE byl porovnán s genem cry2 a byly také testovány uměle kontaminované vzorky. Ve srovnání s cry2 bylo pozorováno, že gen XRE je účinně přesný při identifikaci B. thuringiensis. Dále vyvinutý PCR v reálném čase pomocí XRE úspěšně identifikoval B., thuringiensis a mohl by být použit k kvantifikaci čísel buněk generovanou standardní křivkou.
Autor Příspěvky
finanční Prostředky
Tato výzkumná práce byla podporována Ministerstvem Zemědělství, Bezpečnost Potravin a léčiv (Grant Č. 14162MFDS085) z korejské Republiky a Kangwon National University v roce 2015. SW byl vděčný za finanční podporu z Číny stipendijní Rady (CSC No: 201408260054). Autoři by rádi poděkovali Hyun-Ah Lee v centrální laboratoři Kangwon National University za technickou podporu., RC je vděčný za finanční podporu od National Research Foundation of Korea (NRF) 2018007551.
Prohlášení o střetu zájmů
autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.
Doplňkový Materiál
Drewnowska, J. M., a Swiecicka, I. (2013). Eko-genetická struktura populací Bacillus cereus sensu lato z různých prostředí v severovýchodním Polsku. PLoS One 8: e80175. doi: 10.1371 / deník.pone.,0080175
PubMed Abstraktní | CrossRef Plný Text | Google Scholar
ISO 7932 (2004). Mikrobiologie krmiv pro potraviny a zvířata-horizontální metoda pro výčet předpokládaného Bacillus cereus-technika počtu kolonií při 30 stupních C 2004. Ženeva: FAO.
Google Scholar
Murawska, e., Fiedoruk, K. a Swiecicka, i. (2014). Modulární genetická Architektura toxigenního plasmidu pIS56-63 ukrývající cry1Ab21 v Bacillus thuringiensis subsp. kmen thuringiensis je 5056. Pola. J. Mikrobiol. 63, 147–156.,
PubMed Abstraktní | Google Scholar
Watts, M., a Williamson, S. (2015). Nahrazení chemikálií biologií: postupné odstraňování vysoce nebezpečných pesticidů Agroekologií. Tchaj-wan: PAN International, 1-210.
Google Scholar
Napsat komentář