Integrální Membránové Proteiny
Integrální membránové proteiny (Imp) působí jako brány do buňky. Všechny buňky a organely jsou uzavřeny v nepropustné lipidové dvojvrstvě a IMPs, které studujeme, jsou vloženy do těchto membrán. Jsou to vstupní a výstupní cesty pro mnoho iontů, živin, odpadních produktů, hormonů, léků a velkých molekul, jako jsou proteiny a DNA. Jsou také zodpovědní za velkou část komunikace mezi buňkami a jejich prostředím., Buňky mohou vytvořit obrovskou škálu těchto proteinů, přibližně 30% genů v kódu lidského genomu pro membránové proteiny, a přesto o těchto molekulách víme relativně málo.
Membránové proteiny jsou bohužel notoricky obtížné zvládnout a studovat, protože jsou navrženy tak, aby sedět uvnitř hydrofobní prostředí lipidové dvojvrstvy. Mají tendenci být nestabilní, když jsou extrahovány z jejich rodného prostředí, a musíme přidat detergenty, které pokryjí hydrofobní povrch., Za účelem pochopit a ovládat funkce těchto proteinů je nezbytné mít informace o jejich trojrozměrné struktury, které se obvykle získá pomocí X-ray krystalografie. Obtížnost manipulace s těmito bílkovinami však ztěžovala řešení struktur a dosud je známo méně než 300 struktur membránových proteinů, méně než 0,5% všech známých struktur. Pro vyšší eukaryoty je příběh ještě ostřejší, s pouze 20 struktury lidských IMPs a méně než 50 savčí IMPs vyřešen., Membránové proteiny jsou proto jedním z nejdůležitějších zbývajících hranic strukturálního biologického výzkumu. V SGC nyní aplikujeme naše nejmodernější metody s vysokou propustností k překonání úzkých míst ve výzkumu membránových proteinů, abychom mohli spolehlivě dodat čisté vzorky membránových proteinů a struktury těchto fascinujících a lékařsky kritických molekul.
lékařský význam
lékařský význam této obrovské rodiny proteinů nelze přeceňovat., Mutace membránových proteinů se podílejí na mnoha běžných onemocněních, včetně srdečních chorob, kde jsou často zapojeny nefunkční iontové kanály. Léky zaměřené na vápníkové kanály mohou kontrolovat problémy, jako je vysoký krevní tlak a angina pectoris. Membránové proteiny se podílejí na rakovině, kde chyby v signálních drahách mohou vést k dělení buněk mimo kontrolu. Často jsou specifické membránové proteiny nadprodukovány v rakovinných buňkách, a proto jsou cílem farmakoterapie. Nemoci mozku, jako je migréna, deprese a Alzheimerova choroba, jsou spojeny s problémy s transportéry a kanály., Cystická fibróza je způsobena mutacemi v genu transmembránového regulátoru vodivosti cystické fibrózy (CFTR), který kóduje chloridový iontový kanál.
vzhledem k tomu, že mnoho membránových proteinů sedí na povrchu buněk, jsou snadno dostupné malým molekulám, které cirkulují v krvi. Není proto divu, že více než 50% léků s malými molekulami se váže na membránové proteiny. G-protein vázané receptory a kanály jsou zvláště důležité v tomto ohledu, ale ABC transportéry a solute carriers jsou také cíle pro farmakoterapii., Naše chápání mnoha jiných chorob, a naše schopnost léčit tyto nemoci by výrazně těžit z více strukturálních a funkčních informací o proteinech zapojených. Doufáme, že řešením struktur těchto proteinů, pochopením základní biochemie a interakcí se substráty a inhibitory, můžeme poskytnout účinnější léčbu mnoha nemocí.
proteiny SGC a integrální membrány
SGC má rozsáhlé zkušenosti s řešením struktur rozpustných lidských proteinů pomocí vysoce účinných systémů s vysokou propustností., V posledních dvou letech jsme tyto metody přizpůsobili řešení struktur pro proteiny lidské membrány. Máme promítán 186 lidské membránové proteiny z různých rodin, výběr řadu konstruktů pro každý protein, identifikující vhodné čisticí prostředky pro čištění a pak škálování až purificaiton a krystalizace těchto proteinů. Krystalizovali jsme 3 membránové proteiny a vyřešili jsme naši první strukturu, proces, který trval méně než dva roky od prvního klonu ke struktuře.,
Jsme vyřešili první struktura lidský ABC transportér, třída proteinů, které jsou zapojeny do malé molekuly dopravy, multi-drug resistence a onemocnění, jako je cystická fibróza a diabetes. Naším prvním úspěšným cílem je lidský mitochondriální ABC transporter, ABCB10, který je zakotven ve vnitřní membráně mitochondrií. ABCB10 je během erytroidní diferenciace nadměrně exprimován, což je proces, který tvoří červené krvinky. je přehnaně exprimován v kostní dřeni, srdci a játrech., Nyní existují důkazy, že když je exprese ABCB10 snížena v buňkách, jsou náchylnější k oxidačnímu stresu a že ABCB10 může být zapojen do ochrany srdce během srdečního záchvatu.
Technologie pro studium IMPs
vyvíjíme generické metody, které umožňují vysokou propustnost stanovení struktury lidských membránových proteinů. Vybrali jsme systém exprese baculoviru/hmyzích buněk, který poskytuje lipidovou kompozici blízkou složení lidských buněk a je osvědčenou platformou s vysokou propustností., Pro každý cílový protein jsme se vytvořit sérii konstruuje různé délky a různé afinity značky, včetně celé délce genu a série truncations odstranit potenciálně neuspořádaných regionů. Vysoká propustnost výraz obrazovce se používá k identifikaci proteinů, které mohou být použity k čištění miligram množství SKŘÍTKŮ ke krystalizaci. Každý protein je nejprve očištěn v dodecyl maltoside (DDM) čisticím prostředkem a následně testovány na stabilitu v řadě různých detergentů k identifikaci optimálních podmínek pro stabilitu a krystalizací.,
zavedli jsme metody pro vysokou propustnost nanodrop krystalizace a manipulace křehkých membránových proteinových krystalů. Vyvinuli jsme efektivní systémy pro screening membránových proteinových krystalů pro difrakční kvalitu jako metodu optimalizace krystalizačního conditonu. Také jsme optimalizovali náš sběr dat a analýzu difrakčních dat pomocí intenzivních synchrotron microfocus beamlines, k dispozici na zdrojích, jako je Diamond Light Source Ltd, v Oxfordshire., Kdekoli je to možné krystalizace se provádí s navázanými ligandy a inhibitory zachytit jediný nativní konformaci a poskytne klíčové poznatky do funkce a drug design. Plánujeme také vytvářet fragmenty protilátek proti našim vyčištěným proteinům pro použití jako afinitní činidla a krystalizační pomůcky.
Napsat komentář