Protilátky jsou imunoglobuliny (Ig) jsou glykoproteiny produkované plazmatickými buňkami (B-buňky) v reakci na cizí antigenní molekuly (immunogens). Primární funkce protilátek vázat se specificky na tyto cizí antigeny je zakázat a/nebo je označit pro zničení imunitního systému, čímž chrání hostitele před infekcí. Existuje několik tříd protilátek., První část tohoto shrnutí se zaměřuje na konvenční full-size protilátky, IgG a IgM protilátky, které jsou silně využívány v mnoha výzkumných, diagnostických a terapeutických biomedicínské aplikace.
základní jednotka konvenční protilátky je čtyři polypeptidové jednotka skládající se ze dvou identických těžkých řetězců a dvou identických lehkých řetězců drží pohromadě pomocí disulfidové vazby. Světelné řetězce jsou kratší, s nižší molekulovou hmotností než těžké řetězce., Obecný tvar protilátka je Y, s flexibilní závěs (interdomain) region v centru Y flexibilitu interdomain závěs regionu je důležité pro bivalentní vazba protilátky , což umožňuje dvě vazebné kapsy k interakci s antigenní místa na proměnné vzdálenosti. Každý polypeptidový řetězec má konstantní oblast, která se významně neliší mezi protilátkami, a variabilní oblast, která je specifická pro každou konkrétní protilátku. Společný zápis pro proměnnou oblast světelného řetězce je VL a pro konstantní oblast světelného řetězce je CL (Obrázek 1)., Notace je podobná pro proměnné těžkého řetězce (VH) a konstantní oblasti (CH) s CH1, CH2 a CH3 označující různé domény konstantní oblasti těžkého řetězce. Sacharidy jsou obvykle připojeny k CH2 doménám těžkých řetězců. Fragment crystallizable (Fc) region obsahuje pouze konstantní regiony z těžkých řetězců (CH), ale fragment antigen-binding region (Fab) zahrnuje jak konstantní domény a variabilní domény obou těžkých a lehkých řetězců (VH a CL). Fragment proměnná oblast FV region obsahuje pouze dvě proměnné domény (Obrázek 1)., Viz myší protilátka pro diskusi o imunoglobulinových isotypech, podtřídy, a počet imunoglobulinových domén.
každá kompletní protilátka má dvě kapsy vázající antigen, umístěné v oblastech FV, a může se vázat na dva antigeny (bivalentní vazba)., Pokud jsou však oba antigeny příliš blízko (≤3 nm) nebo příliš daleko od sebe (≥29nm), může se protilátka vázat pouze na jeden antigen (monovalentní vazba). Tam je významnou afinitu změna mezi monovalentní a bivalentní vázání s 1500-krát změnit v Kd hodnoty .
struktura specifických protilátek je k dispozici ze Strukturálních Protilátek Databáze (SAbDab), kurátor databáze veřejně dostupných protilátek struktur, stejně jako strukturální modelování nástroje, který je aktualizován každý týden z Protein Data Bank (PDB) .,
Konvenční full-size protilátky byly využity v oblasti výzkumu bílkovin detekce pomocí Western blot analýzy , imunohistochemie , a enzymoimunoanalýzy (ELISA) po celá desetiletí. Full-size protilátky byly také vyvinuty pro diagnostické aplikace, jako jsou těhotenské testy a detekce bakterií a virů v krvi, jako je ELISA, který detekuje HIV. Navíc, konvenční full-size protilátky se běžně používají v léčbě onemocnění., Například Infliximab je jednou z mnoha dostupných protilátek, které rozpoznávají faktor nekrózy nádorů alfa (TNFa) a používá se při léčbě Crohnovy choroby a revmatoidní artritidy . Trastuzumab nebo Herceptin je protilátka, která se váže na receptor epidermálního růstového faktoru 2 a používá se při léčbě metastatického karcinomu prsu . Existuje také několik terapií na bázi protilátek, včetně Muromonabu , podávaných příjemcům transplantací, aby se zabránilo odmítnutí aloštěpu.,
ačkoli konvenční protilátky v plné velikosti mohou být použity pro terapeutické aplikace, existují výhody a nevýhody použití kompletní protilátky. Důležitou výhodou konvenčních protilátek je skutečnost, že oblast Fc zabírá imunitní odpověď těla a může cílit na vázané antigeny pro zničení. Tato oblast Fc může být také nevýhodou v některých klinických aplikacích, protože imunitní odpověď, kterou obvykle vyvolává, může být škodlivá pro zdraví pacienta., Navíc protilátky plné velikosti nemohou dobře proniknout do určitých tkání kvůli jejich relativně velké velikosti . V některých případech může při použití protilátek v plné velikosti pro diagnostické aplikace doména Fc způsobit významnou nešpecifickou vazbu, která může poškodit detekční aplikace.
pro mnoho aplikací jsou vhodnější fragmenty protilátek. Fragmenty protilátek mohou být produkovány chemickými nebo genetickými mechanismy., Chemická fragmentace využívá redukční činidla k přerušení disulfidových vazeb v oblasti závěsu a trávení protilátky proteázami včetně pepsinu, papainu a ficinu. Genetická konstrukce fragmentů nabízí schopnost vytvářet množství molekul obsahujících fragment, z nichž každá má jedinečné vazebné a funkční vlastnosti.
Chemické a proteázy trávení full-size IgG nebo IgM protilátek výnos antigen vázající fragmenty (Fab; Obrázek 1) a Fc fragmenty, skládá se pouze z těžkého řetězce CH2, a CH3 domén., Biochemické metody generování fragmentů protilátek produkovat užitečné nástroje pro diagnostické a terapeutické aplikace, ale to je poměrně pracné a vyžaduje velké množství protilátek výchozí materiál.
fragmenty vázající antigen produkované biochemickým trávením zahrnují Fab, (Fab‘) 2, Fab ‚ a FV, z nichž všechny postrádají oblast Fc. Monovalentní F(ab) fragmenty mají jeden antigen-vazebné místo, zatímco dvojmocné (Fab‘)2 fragmenty mají dvě antigen-vázající regiony, které jsou spojeny disulfid dluhopisů., Dva jednotlivé F (ab) fragmenty jsou produkovány, když je protilátka v plné velikosti trávena enzymem papain. F (ab‘)2 fragment, který si zachovává část oblasti závěsu, je produkován trávením pepsinu IgG nebo IgM protilátek. Redukce F (ab‘)2 fragmentů produkuje 2 monovalentní Fab‘ fragmenty, které mají volnou sulfhydrylovou skupinu, která je užitečná pro konjugaci s jinými molekulami. FV fragmenty jsou nejmenší fragment vyrobený z enzymatického štěpení protilátek třídy IgG a IgM (Obrázek 1)., FV fragmenty mají místo vázající antigen vyrobené z oblastí VH a VL, ale postrádají konstantní oblasti oblastí Fab (CH1 a CL) (Obrázek 1, pravý panel). VH a VL jsou drženy společně ve FV fragmentech nekovalentními interakcemi. Fragmenty mohou být generovány prostřednictvím komerčně dostupných sad, například fragmentační sady F (ab‘)2 od G-Biosciences .,
Genetické inženýrství metody umožňují výrobu jediného řetězce variabilní fragmenty (scFv), které jsou FV typ fragmenty, které se skládají z VH a VL domén spojeny inženýrství flexibilní linker peptid (viz Obrázek 1) . Manipulace orientace v-domén a délky linkeru vytváří různé formy FV molekul . Pokud je linker dlouhý nejméně 12 zbytků, jsou fragmenty scFv primárně monomerní (jak je znázorněno na obrázku 1) ., Linkery, které jsou zbytky 3-11 s dlouhým výtěžkem scfv molekuly, které nejsou schopny složit do funkční domény FV. Tyto molekuly se spojují s druhou molekulou scFv, která vytváří bivalentní diabody . Pokud je délka linkeru menší než tři zbytky, molekuly scFv se spojují do triabodií nebo tetrabodií . Například Tao y et al generoval VH-VL diabody s krátkým ggggs linker a scFv s dlouhým gttaasgssggsssga linker ., Multivalentní scfv mají větší funkční vazebnou afinitu k jejich cílovým antigenům v důsledku toho, že mají dvě další cílová místa vázající antigen ,což snižuje rychlost fragmentu protilátky. Minibody jsou fúzní proteiny scFv-CH3, které se shromažďují do bivalentních dimerů . Malé scFv fragmenty s dvěma různými variabilní domény mohou být generovány na výrobu bispecifické bis-scFv fragmenty schopné vazby dva různé epitopy současně . Genetické metody jsou také používány k vytvoření bispecifické Fab dimery (Fab2) a trispecific Fab trimers (Fab3) ., Tyto fragmenty protilátek jsou schopny současně vázat 2 nebo 3 různé antigeny.
kromě konvenční protilátky, camelid a žralok (squalidae) druhy obsahují podmnožinu zvláštní Těžkého Řetězce Protilátek (hcAb) složený výhradně do těžkého řetězce homodimers chybí lehkých řetězců . Fab části těchto protilátek, nazývané VHH v velbloudech a VNAR u žraloků, jsou nejmenší oblasti vázající antigen přirozeně nalezené ., Nanobodies jsou rekombinantní domény odvozené od VHH schopné vázat antigeny, často klonované z knihoven VHH phage, jako jsou ty proti proteinům betacoronarivus s. Byly studovány jejich vazebné termodynamiky a struktury (a odkaz na ně)., Nanobodies jsou velmi stabilní a může být snadno vyráběny v obrovském množství, použitím běžných jednoduchých bílkovin výraz systémů, jako jsou bakterie (funkční konvenční full-size protilátky jsou obtížné vyjádřit správně v bakteriálním systému), což představuje slibný nástroj pro výzkumné a terapeutické účely, a to zejména v oblasti super-resolution mikroskopie, hmotnostní spektrometrie, a cílené degradace proteinů . Nanobody mohou být také dodávány uvnitř živých buněk prostřednictvím konjugovaných s peptidy, nebo in vivo, nebo vyjádřeny přímo in vivo a rozpoznávají své cíle in vivo., Nanobodies proti RFP nebo GFP, když konjugované s far-red Atto barviva, dosáhl 118-násobným zvětšením fluorescenční signály přes GFP nebo RFP, a byly použity pro generování celého těla myší neuronální konektivity . Byly také použity ke stabilizaci aktivního stavu proteinů ve strukturálních studiích . Výraz systém s více zřetězených nanobodies proti různým kmenům chřipky je posuzována jako prostředek k vytvoření univerzální vakcíny proti chřipce ., Rekombinantní Anti-IgG sekundární nanobody mají velký potenciál nahradit široce používané polyklonální sekundární protilátky produkované za použití zvířat .
Nanobodies mají jedinečnou schopnost procházet přes krev-bariéra mozku ; nicméně, nanobodies mají tendenci být zpracovány a vymazány velmi rychle z těla . Nanobodies lze použít pro metody, jako je imunoprecipitace, například RFP-Trap MA z Chromotek, nebo spojený s fluorescenčními proteiny pro sledování intracelulárních cílů v živých buňkách v reálném čase .,
O 10% skotu imunoglobulinů obsahují neobyčejně dlouhý třetí těžkého řetězce, komplementarity určování regionů (CDR 3H) s velkým počtem zbytky cysteinu . Tyto cysteines dvojice tvořit disulfidové vazby, které vede ke stonku-a-knoflík jako struktura v antigen vazebné domény . Tato výjimečně dlouhá doména CDR3H s dlouhým stonkem přispívá k rozmanitosti specificity bovinní protilátky.,
Intrabodies, nebo intracelulárních protilátek, viz protilátek nebo jejich fragmentů (obvykle scFv design) vyjádřil přímo uvnitř buněk nebo u zvířat in vivo prostřednictvím expresního vektoru. Například Dong JX et al vyvinul několik nanobodií proti neuronálním proteinům pro intracelulární expresi jako introbodies . Jedním důležitým aspektem/námitka je snížení intracelulární prostředí, která snižuje afinitu protilátky nebo protilátky fragment, jehož vazba s antigenem je závislá na intradomain disulfidové vazby., Další úvahou je, že introbodies mají tendenci agregovat. Kabayama H et al navržen tak, intrabodies s čistým engative poplatek i na nejnižší cytoplazmatické pH 6.6 pro generování ultra-stabilní cytoplazmatické protilátky . Introbodies se používají jako alternativy k farmakologickým inhibitorům k cílení na specifické endocytární účastníky., Pro případy, vyjádření single-chain variable fragment (scFv), odvozené od 3B12A monoklonální protilátka proti TDP-43 jaderný exportní signál v HEK293A buňky nebo po v děloze elektroporace jeho vyjádření vektoru podporoval proteolýzy TDP-43 agregáty v kultivovaných buněk a embryonálních myší mozek ., Virus-zprostředkované dodání do nervového systému scFv protilátky proti RNA recognition motif 1 TDP-43 snížena microgliosis v myším modelu akutní zánět a zmírnit kognitivní poruchy, motorické vady, TDP-43 proteinopathy, a zánět v transgenních myší exprimujících TDP-43 mutace spojené s amyotrofickou laterální sklerózou . Potenciál introbodií jako terapeutické modality se teprve objeví.
fragment protilátky může být také spojen se značkou importu buněk , jako je značka IPTD, aby se usnadnil její vstup do buněk.,
fragmenty protilátek nabízejí určité výhody oproti protilátce v plné velikosti pro některé aplikace. Toto téma bylo přezkoumáno Nelsonem . Jednou z výhod fragmenty více než full-size protilátky je, že protilátky, fragmenty jsou menší než konvenční protilátky a obecně nedostatek glykosylace, což umožňuje jejich výrobu v prokaryotické expresní systémy, které poskytují úsporu času a nákladů., Navíc, fragmenty jsou dostatečně malé, aby proniknout do některých tkání, že full-size protilátky jsou schopny proniknout, což pomáhá v mnoha léčebných a imunohistochemické postupy . Kromě toho, nedostatek Fc domény je podstatnou výhodou pro primární protilátky používané v imunohistochemie a další aplikace detekce, protože mají výrazně snížené nespecifické vazby na Fc receptor. Jeden scFv, který se běžně používá v diagnostice, je protilátka NC10 proti chřipkové neuraminidáze., MOC – 31 protilátka proti adhezi epiteliálních buněk molekuly Ep-CAM je scFv běžně používané v jako terapie rakoviny. Diabodie, triabodie a tetrabody mají potenciální využití v aplikacích, jako je radioimunoterapie a diagnostické in vivo zobrazování . Nicméně, fragmentů, které postrádají Fc domény jsou degradovány v těle mnohem rychleji než konvenční protilátky , a jsou schopni vyvolat Fc-zprostředkované cytotoxické procesy, pokud jsou konjugované k efektoru skupinu , která vyžaduje další optimalizaci protilátek pro fragment-based therapeutics.,
přestože různé fragmenty protilátek nabízejí určité výhody, v experimentech se běžně nepoužívají. Ve více než 60.000 článků ručně kurátorem Labome jen několik článků citované aplikace protilátek Fab fragmentů. Fragmenty protilátek Roche Anti-digoxigenin Fab (11093274910) a fragmenty protilátek proti fluoresceinu Fab ( 11426338910) jsou generovány u ovcí a produkovány trávením papainem. Anti-digoxigenin Fab fragmenty byly použity pro in situ hybridizací, protože RNA sondy jsou označeny digoxigenin ., Byly také použity k provedení analýzy skládání proteinů ke studiu procesu skládání jediné molekuly kalmodulinu pomocí spektroskopie síly s jednou molekulou . F(ab) fragmenty anti-myší sekundární protilátky jsou často používány k zablokování endogenní myší Ig během immunostaining, například, AffiniPure Fab fragment Donkey antimouse IgG od Biozol (JIM-715-007-003) .,
Invitrogen Alexa Fluor 546-konjugované kozí anti-králičí IgG F(ab‘)2 fragment byl použit k provedení imunohistochemie vyšetřovat úlohu sFLT-1 v udržování avaskulární světločivná vrstva v myších modelech a Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab‘)2 fragment rabbit anti-goat IgG (H+L) byl použit v imunohistochemie zkoumat mechanismus tip odkaz regenerace ve sluchové vláskové buňky .,
Fc receptory (Peace) jsou molekuly, vyjádřené především na/v vrozený imunitní buňky, které rozpoznávají a váží se na Fc oblasti protilátky, a tím zahájit na bázi buněk imunitní odpovědi. Rozmanité funkce Peace odrážet širokou škálu ochranných nebo modulační role protilátek, včetně zprostředkování neutralizace a clearance cílových substrátů, stejně jako programování adaptivní imunity ., Biologické funkce Peace jsou regulovány immunoreceptor tyrosin-based activation motivy (ITAMs) a immunoreceptor tyrosin-based inhibitory motivy (ITIMs), které působí jako receptor rozhraní s aktivační a inhibiční signální dráhy, resp. Signalizace ITAMs tak může vyvolat aktivaci buněk, fagocytózu a endocytózu, zatímco signalizace ITIMs má inhibiční účinek na aktivaci buněk . Peace byly popsány pro všechny třídy imunoglobulinů a některé z nich jsou popsány níže.,
tato rodina zahrnuje fcyri, FcyRII, FcyRIII a jejich isoformy. Jsou zodpovědné za buněčně zprostředkovanou cytotoxicitu (ADCC) závislou na protilátkách a fagocytózu zprostředkovanou buňkami (ACDP) .
dalším receptorem, který váže IgG, je neonatální Fc receptor (FcRn), který se podílí na přenosu pasivní humorální imunity z matky na její plod. FcRn také chrání IgG před degradací in vivo a vysvětluje jejich dlouhý poločas v séru ., Tento jev vedl k rozvoji lepších terapeutických protilátek zavedením změny v Fc oblasti, aby podporovaly Fc-FcRn interakce.
zahrnují FceRI s vysokou afinitou, který je schopen vázat monomerní IgE, a lektin typu C s nízkou afinitou, který přednostně interaguje s komplexním IgE. FceRI zprostředkovává okamžitou reakci přecitlivělosti mnoha alergických reakcí stimulací degranulace a uvolněním řady zánětlivých mediátorů na žírné buňky a bazofily ., FceRII existuje jak v membráně vázané formě, která přináší downregulating signál pro syntézu IgE , stejně jako rozpustné fragmenty, které vytvářejí protichůdné buněk na syntézu IgE . Jeho role v transcytóze IgE-alergenových komplexů v lidských dýchacích cestách a střevním epitelu je aktivně zkoumána jako potenciální cíl alergického zánětu dýchacích cest v důsledku potravinových alergií .
jediný člen skupiny receptorů IgA, fcari, je exprimován pouze v buňkách myeloidní linie., Hraje roli jak v prozánětlivých, tak protizánětlivých reakcích v závislosti na stavu vazby IgA. Zatímco vazba sekreční IgA (SIgA) přítomná v místech sliznice má protizánětlivé účinky včetně prevence invaze patogenů, vazba sérového IgA vede k zánětlivým reakcím. FcaRI také reguluje životaschopnost neutrofilů v závislosti na zánětlivém mikroprostředí .
TRIM21 lze odlišit od ostatních FCR, protože vykazuje širokou specificitu protilátek. Může vázat IgG, IgM a IgA . To je také vyjádřeno buňkami většiny histogenních linií ., TRIM21 se podílí na interferenci virové replikace zprostředkované protilátkami tím, že cílí na komplexy cytosolic virus-protilátka pro proteazomální degradaci.
Závaznou Fc domény Peace může mít nežádoucí účinky monoklonálních protilátek na bázi analytických metod jako imunohistochemie (IHC), fluorescence activated cell sorting (FACS) a chromatin immunoprecipitation (Čip). Nespecifická vazba na FCR může zavést šum na pozadí, který může vést k detekci falešných pozitiv., Řešení tohoto problému zahrnují použití (i) izotypů ovládací prvky pro vtokové, (ii) sérum obecně soutěžit o receptory se podílejí na nespecifické vazby, nebo (iii) čištěná IgG blokovat Fc receptory, konkrétně . Innovex FC Receptor blocker # NB309 lze použít k blokování parafinových nebo zmrazených sekcí během experimentů IHC nebo IC nebo BD Biosciences #553142, miltenyi Biotec FC receptor blok pro průtokovou cytometrii. Například, Chopra, S. et al blokován FcyR vazby s 5 µg/ml TruStain fcX (anti-myší CD16/32, klon 93) z BioLegend během průtokové cytometrie a buněčné třídění .,
Dr. Macarena Fritz Kelly z São José dos Campos, SP, Brazílie, přispěl sekci o Fc receptory v září 2018.
Napsat komentář