Střední řetězce mastných kyselin, snížení koncentrace cholesterolu v séru prostřednictvím snížení střevní žlučových kyselin vstřebávání v C57BL/6J myší

Zvířata a diety

Samců C57BL/6 J myší (4 týdny starý, n = 80) byly zakoupeny od Institute of Laboratory Animal Science, Čínské Akademie Lékařských Věd (Licence Ne. SCXK: JING2009-0007) A je umístěn v místnosti řízené teplotou (22 ± 2 °C, 40% až 60% vlhkost) s cyklem 12-h světla/tmy., Výbor pro péči o zvířata a použití čínské všeobecné nemocnice PLA schválil všechny experimentální postupy.

Myši byly krmeny bazální stravou (AIN-93 G stravy, zakoupit od Vojenské Akademie Lékařské Vědy) během prvního týdne pro přizpůsobení. Deset myší bylo náhodně vybráno a krmeno bazální stravou jako normální kontrola a zbývající myši byly krmeny dietou bohatou na cholesterol (CR) upravenou ze stravy AIN-96G. Vzorky krve byly odebrány z mandibulárního žilního plexu o dva týdny později., Myší séra TC úrovní, které byly 2 standardní odchylky větší než normální kontrolu (což představuje 67% myší krmených ČR stravy) byli náhodně rozděleni do tří skupin (n = 12 v každé skupině). Každá skupina byla krmena různé diety po dobu 16 týdnů (Tabulka 1): bohaté na cholesterol a střední řetězce triglyceridů (CR-MCT), cholesterol-bohaté a dlouhé řetězce triglyceridů (CR-LCT) nebo CR. Nisshin Oillio (Tokio, Japonsko) daroval MCT (C8:0 a C10:0) a LCT (triglyceridy s dlouhým řetězcem, sójový olej). Cholesterol byl zakoupen od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)., Pekingský Institut výživových zdrojů (Peking, Čína) změřil složení mastných kyselin diet CR-MCT a CR-LCT (Tabulka 2). Tělesné hmotnosti a příjem potravy byly sledovány každý týden.,

Krev, ileum, žluči a stolici odběr vzorku

Pět myší byly vybrány náhodně z každé skupiny po 16 týdnech krmení pro záznam příjem stravy a vylučování stolicí pomocí samostatné metabolické klece pro 3 dny., Výkaly byly lyofilizovány, zváženy, rozdrceny a skladovány při teplotě − 80 °C pro další analýzu. Všechny myši byly postil přes noc (cca 12 h) před odběr z aorta ventralis v anestezii (xylazinu hydrochlorid). Sérum bylo odebráno po odstředění vzorků krve. Mikrokapsle byla použita k propíchnutí stěny žlučníku a extrakci žluči a každý vzorek žluči byl centrifugován na 16 000 g po dobu 30 minut. Supernatant byl shromážděn a uložen při-80 °C., Ileové tkáně byly vyříznuty a opláchnuty ledově studeným fyziologickým roztokem a části byly okamžitě uloženy při-80 °C pro další analýzu.

měření sérových lipidových profilů

sérový TC a triglycerid (TG) byly stanoveny na konci experimentu pomocí komerčních souprav od Wako (Osaka, Japonsko). High-density lipoprotein-cholesterolu (HDL-C) a low-density lipoprotein-cholesterolu (LDL-C) byly měřeny pomocí sedimentu metody a komerční kit od Abcam (Cambridge, UK). Sérová celková žlučová kyselina (TBA) byla měřena pomocí komerční sady od Blue Gene (Šanghaj, Čína)., Všechny pokyny výrobce byly přísně dodržovány.

Analýza žlučových kyselin stolicí a žlučí pomocí HPLC-MS

metody pro přípravu a stanovení žlučových kyselin ve stolici a žlučových cest byly prováděny podle naší předchozí studie a zprávy od Steiner et al. . Na Shimadzu LC-20 AD vysokoúčinná kapalinová chromatografie systém (Shimadzu, Kyoto, Japonsko) spolu s Applied Biosystecm 3200 Q TRAP mass spectrometer s ionizace elektrosprejem (ESI) zdroj (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) byl použit. Systémy HPLC a MS byly řízeny pomocí analytika 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Výše uvedené materiály byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Primární žlučové kyseliny, včetně CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA a GCDCA, a sekundární žlučové kyseliny, včetně DCA, LCA, UDCA, TLCA, DORS a GDCA, ve žluči a stolici byly určeny retenční časy.

kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR)

vzorky z tkáně tenkého střeva (přibližně 100 mg) byly promyty ledově studenými PBS a homogenizovány. Celková RNA z tkání a buněk byla izolována pomocí trizolového činidla (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, no. R6812). Primery byly navrženy pomocí Primer Express 3.,0 software založený na mRNA sekvencích z databáze (tabulka 3) a syntetizovaný Invitrogen (Peking, Čína). Metody extrakce RNA a kvantitativní real-time PCR (qRT-PCR) jsou popsány v našich předchozích publikacích. qRT-PCR byla provedena za použití jednoho kroku SYBR ® PrimeScript ® RT-PCR Kit (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Čína). Amplifikace byla provedena za použití BIO-RAD Icycler Termální Cykler(BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Relativní úrovně exprese mRNA byly stanoveny metodou srovnávacího kritického prahu (Ct) (v samostatné trubici)., Jako kontrola normalizace byl použit úklidový Gen β-aktin.

Western blot test

Western blot analýzy tenkého střeva, tkáně a kultivované buňky byly provedeny, jak je popsáno dříve . Ekvivalentní množství bílkovin z každého vzorku bylo připraveno a odděleno pomocí SDS-PAGE (12% gelů) a následně elektrotransfer na PVDF membrány., Membrány byly inkubovány s blokovací roztok (Tris-buffered saline, 8% netučného sušeného mléka) po dobu 2 h následuje inkubace s specifických protilátek při 4 °C přes noc. Membrány byly promyty značně v TBST (Tris-buffered saline Tween, obsahující 0, 5% Tween-20 v TBS) a inkubovány s křenovou peroxidázou konjugované sekundární protilátky v TBST po dobu 1 h. Membrány byly promyty dále v TBST a kapely byly detekovány pomocí chemiluminiscenční detekce agens. Byla provedena Blot denzitometrie a pásy byly analyzovány pomocí softwaru ImageJ., Protilátky zaměřené na apical sodium-dependent bile acid transporter (ASBT), ileální žlučové kyseliny vázající protein (I-BABP) a organic solute transporter α/β (Osta/β) byly zakoupeny od Abcam (Cambridge, UK). Sekundární protilátky proti kozímu IgG byly získány ze společnosti Sun Biomedical Technology Co. (Peking, Čína).

imunofluorescence

Ileová tkáň fixovaná 4% pufrovaným paraformaldehydem byla vložena do parafínu a byly připraveny 4-µm tlusté části. Sekce byly deparafinovány a uhaseny ve 3% H2O2 po dobu 15 minut, aby se zablokovala endogenní peroxidáza., Řezy byly promyty v PBS a inkubovány s anti-I-BABP protilátky v PBS (1:50 ředicím) po dobu 1 h při 37 °C. FITC-konjugované (fluorescein isothiokyanátem) protilátky byl přidán na 1:50 ředicím a inkubovány po dobu 0,5 h při 37 °C. řezy byly promyty, a PI (propidium jodid) byl použit k obarvení jader. I-BABP byl zobrazován pomocí fluorescenčního mikroskopu (BX60, Olympus, Ina, Japonsko). I-BABP byl pozorován jako zelená fluorescence a jádro bylo pozorováno jako červená fluorescence .,

Caco-2 buněčná kultura

buněčná linie Caco-2 byla získána z centra buněčných zdrojů, Peking Union Medical College (která je sídlem Národní infrastruktury zdroje buněčné linie) v Září. 20, 2016. PCR a kultura potvrdily, že buněčná linie byla zkontrolována bez kontaminace mykoplazmou. Druhový původ těchto buněk byl potvrzen pomocí PCR. Identita buněčné linie byla ověřena pomocí STR profilování (FBI, CODIS). Všechny výsledky jsou k dispozici na webových stránkách (http://cellresource.cn)., Caco-2 buňky byly kultivovány v Dulbecco ‚s modified Eagle‘ s medium (DMEM) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (FBS), 1% penicilin-streptomycin, 1% non-essential-aminokyselin. Buňky Caco – 2 byly udržovány při teplotě 37 °C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5% CO2 a 95% vzduchu. Médium bylo změněno každé 2 dny. DMEM, FBS, 1% neesenciální aminokyseliny a další materiály byly zakoupeny z národní infrastruktury zdrojů buněčné linie (Peking, Čína) nebo Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA).,

test propustnosti kyseliny kaprylové pomocí monovrstvy buněk Caco-2

pro experimenty s reabsorpcí žlučových kyselin s odkazem na zprávu y. Wanga a kol. buňky byly nasazeny a pěstované na Millicell Visí Buněčné Kultury Vložky (0.4 µm, Millipore, Molsheim, Francie) po dobu 21 dnů k získání splývající a vysoce diferencované buněčné monovrstvy. Tvorba funkčních epiteliálních monovrstvů byla sledována měřením transepiteliálního elektrického odporu (TEER) pomocí milicell-ERS meter (Millipore) před experimenty., Buněčná morfologie byla pozorována pomocí elektronového mikroskopu, a propustnost byla stanovena pomocí Lucifer Yellow (Sigma, MO, USA) jako marker.

příprava mastných kyselin a CA byla provedena tak, jak je popsáno X. Zhangem a kol. . Mastné kyseliny a CA byly měřeny a rozpustí v ethanolu, pak se zředí mobilní kultivační médium obsahující 20 mg/L endotoxin-free BSA na výslednou koncentraci 50, 100 nebo 200 µmol/L (ethanol< 0.1%). Rozpuštěné mastné kyseliny a CA byly inkubovány ve vodní lázni při teplotě 37 ° C po dobu 1 hodiny před přidáním do buněk., Kaprylová kyselina (C8:0), kaprinové kyseliny (C10:0), stearová (C18:0) a kyselina olejová (C18:1) byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

apikální (AP) a bazolaterální (BL) strany monovrstvy byly promyje hankově Vyváženém solném Roztoku (HBSS) a rovnovážného stavu v séru-zdarma kompletní médium za 15 min. Média v AP byl nahrazen s čerstvým médiem obsahující CA (200 µmmol/L) nebo se smíchá s jedním z mastných kyselin (C8:0, C10:0, C18:0 nebo C18:1) na 50, 100 nebo 200 µmol/L., Životaschopnost buněk Caco-2 v různých podmínkách byla hodnocena testem cytotoxicity buněk WST – 1 (obr. 1). Médium s jednou z mastných kyselin bylo definováno jako skupina „C8:0, C10:0, C18:0 nebo C18:1“. „Kontrolní skupina „neobsahovala žádné mastné kyseliny a“ prázdná skupina “ postrádala CA a mastné kyseliny. V BL bylo použito pouze čerstvé médium. Média ze stran AP a BL byla odstraněna o 2 h později a uložena pro analýzy CA pomocí HPLC-MS., Zdánlivý permeability (Papp) byla vypočtena pomocí následující rovnice: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ je sloučenina vzhled v přijímači prostor, dt je čas, C0 je koncentrace na dárce prostoru, a je plocha povrchu vložky).

I-BABP výraz úrovní v Caco-2 buňky

Caco-2 buňky byly nasazeny do 6-destičce (Corning, NY, USA) a kultivovány na celkové soutoku s vysokou diferenciaci potvrdit účinky Mcfa na I-BABP . Kultivační médium bylo před experimenty nahrazeno médiem obsahujícím delipidizované FBS pro 24 h., Buňky byly promyty ledovou fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) a inkubovat s čerstvým médiem obsahující CA 200 µmol/L (definováno jako CA group) nebo CA ve směsi s jedním z mastných kyselin (C8:0, C10:0, C18:0 nebo C18:1) na 200 µmol/L (definováno jako „C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA nebo C18:1+CA group“) nebo C8:0 nebo C10:0 na 200 µmol/L bez CA (definovanými jako „C8:0 skupina a C10:0 skupina“) za 24 h. A prázdné skupina byla bez mastných kyselin a CA. Médium bylo odstraněno a buňky byly třikrát promyty ledově studenými PBS., Celková RNA a protein byly izolovány a shromážděny pro další analýzy hladin mRNA i-BABP a proteinové exprese.

Statistická analýza

všechna data jsou vyjádřena jako střední ± SD. Data byla analyzována pomocí jednosměrné analýzy rozptylu následované nezávislým t-testem pro určení významu rozdílu mezi skupinami pomocí SPSS Software verze 17.0. P < 0.05 byl považován za statisticky významný.