Vývoj hlubinných Gulper Úhoře Mitochondriální Genomy: Rozsáhlé Genové Přestavby Vznikl v Rámci Úhoři

Abstrakt

Nedávné studie ukázaly, že odchylky od typické obratlovců mitochondriální gen pořadí jsou častější, než se původně myslelo., Tyto odchylky jsou však menší, s inverzí a/nebo přemístění několika geny jsou zapojeny i tandemové duplikace genu regionů následuje delece genů, které byly uplatňovány jako mechanismů pocházejících z těchto román gen zájmu., V průběhu molekulární fylogenetické studie na Elopomorpha (úhoři a jejich spojenci), jsme zjistili, že mitochondriální genomy (mitogenomes) ze dvou hlubinných gulper úhoři, Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) a Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), vykazují identický gen pořadí, které se výrazně liší od ostatních obratlovců. Fylogenetická analýza s použitím mitogenomických dat z 59 druhů ryb nejen s jistotou potvrdila jediný původ takového genového řádu, ale také naznačila, že byla odvozena z typického pořadí genů obratlovců., Podrobné srovnání gulper úhoře genu, aby se, že typické obratlovců naznačují, že výskyt jediném kroku, ve velkém měřítku duplikace genu regionu rozšíření >12 kb, následuje delece genů v společného předka dvou druhů, většina parsimoniously účty pro toto neobvyklé uspořádání genu.

Úvod

Obratlovců mitochondriální gen řád byl zpočátku považován za konzervativní, protože kompletní nukleotidové sekvence mitochondriálních genomů (mitogenomes) od savců (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981) a africká drápavá žába (Roe et al. 1985) ukázal společný genový řád. Jako kompletní mitochondriální DNA (mtDNA), které byly stanoveny pro řadu obratlovců (269 druhů, jako ze dne 11. června 2003; National Center for Biotechnology Information webu: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), bylo zjištěno, že odchylky od typického genu, pořadí, nejsou tak vzácné v obratlovců (obr. 1; Boore 1999). S výjimkou placentálních savců, příklady zahrnují všechny hlavní linie obratlovců, jako jsou úhoři (Lee a Kocher 1995), obojživelníci (Macey et al. 1997; Sumida et al., 2001), plazi (Kumazawa a Nishida 1995; Quinn a Mindell 1996; Macey et al. 1997), ptáci (Desjardins and Morais 1990, 1991; Quinn and Wilson 1993; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998), vačnatci (Pääbo et al. 1991; Janke et al. 1994) a ryby (Miya a Nishida 1999; Inoue et al. 2001b; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001). Jako genové přestavby, nicméně, jsou místní (především v rámci clusteru tRNA geny), a ne například bylo zjištěno, že zahrnuje genomické měřítku přestavby.,

Gulper úhoři jsou dobře známé hlubinných tvorů, společně včetně čtyř rodin umístěny v pořadí, Saccopharyngiformes, které se vyskytují v bathypelagic hlubin (>1000 m) po světových oceánech (Bertelsen, Nielsen, Smith, 1989). Jejich bizarní vzhled (obr. 1), který vyplývá z extrémně zvětšené, deformované hledí na špičce úhoře hadí hlavy a těla, přitahoval velkou pozornost od mnoha vědců (např., Bertelsen, Nielsen, and Smith 1989; Robins 1989)., Tyto specializované anatomické rysy vedly vyšetřovatelé předpokládat, že fylogenetická pozice těchto zvířat jsou mimo kostnaté ryby (např. Tchernavin 1946), i když jsou obecně považovány za blízké příbuzné pravda úhoři (řád Anguilliformes), protože mají list-jako leptocephalous larválním stádiu (Greenwood et al. 1966; Inoue a Miya 2001).,

v Průběhu molekulární fylogenetické studie Elopomorpha (úhoři a jejich spojenci) pomocí mitogenomic dat, jsme zjistili, neobvyklé mitochondriální gen, aby pro jeden z gulper úhoři, Eurypharynx pelecanoides (obr. 1). Tento článek popisuje nový gen organizace v mitogenomes dvou druhů gulper úhoři, E. pelecanoides a Saccopharynx lavenbergi. Použili jsme přístup založený na polymerázové řetězové reakci (PCR) vyvinutý Miya a Nishida (1999) pro sekvenování kompletních mitogenomů těchto ryb., Prozkoumat původ této jedinečné mitogenomes, jsme se podrobí mitogenomic dat pro fylogenetické analýzy, a budeme diskutovat zde možné mechanismy generování takový gen uspořádání ve dvou gulper úhoři.

Materiály a Metody

Exemplářů

Mitochondriální DNA sekvence byly získány z šesti jedinců ze dvou druhů představujících dvě rodiny v pořadí Saccopharyngiformes (Čermák 1989). U monotypické čeledi Eurypharyngidae jeden jedinec e., pelecanoides byl použit jako vzorek pro stanovení kompletní mtDNA sekvence, a další čtyři osoby, včetně dvou leptocephalous larvy, byly použity pro stanovení sekvence čtyř hlavních genů spoje (obr. 2) pro potvrzení pořadí genů v mitogenomu e.pelecanoides. Pro rodinu Saccopharyngidae byl jako vzorek pro stanovení úplné sekvence mtDNA použit jediný jedinec s. lavenbergi., Voucher vzorky byly uloženy v rybách sbírky na Muzeum Přírodní Historie & Ústav, Chiba, Japonsko (CBM-ZF) a na University of Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, jižní Japonsko; CBM-ZF 10312, 10313, 10316, a 10317: centrální rovníkové části Tichého Oceánu) a. S. lavenbergi (UW 045633: Východní Pacifik).

extrakce DNA

část epaxiálního svalstva (ca. 0, 25 g) byl vyříznut z čerstvých vzorků každého druhu a okamžitě zachován v 99, 5% ethanolu., Celková genomická DNA byla extrahována pomocí tkáňové sady QIAGEN QIAamp podle protokolu výrobce.

Polymerázová Řetězová Reakce a Sekvenování

celý mitogenomes dvou gulper úhoři byly zesíleny pomocí dlouhé-PCR technika (Cheng, Higuchi, a Stoneking 1994). Pět ryb-univerzální a tři druhy-konkrétní dlouhé PCR primery (S-LA-16-L + H12293-Leu a L12321-Leu + S-LA-16-H. E. pelecanoides; L2508–16 + Sala-ND4-H a Sala-CO1-L + Sala-ND1-H pro S. lavenbergi; obr. 1) byly použity k zesílení celého mitogenomu každého úhoře ve dvou reakcích., Celý mitogenomes další čtyři E. pelecanoides jedinců vzrůstal s tři ryby-univerzální primery a jeden druh-specifické dlouho-PCR primer (L2508–16 + Eupe-ND2-H a L12321-Leu + S-LA-16-H). Čtyři druhově specifické primery (Eupe-ND2-H. E. pelecanoides; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H, a Sala-ND4-H pro S. lavenbergi) jsou alternativně navrženy s odkazem na částečných nukleotidových sekvencí z genu ND2 E. pelecanoides a ČOI, ND1, ND4 a geny S. lavenbergi určí z každého celkové DNA pomocí fish-univerzální primery.,

dlouhé-produkty PCR byly ředěny TE pufru (1:20) pro následné použití jako PCR šablony, s výjimkou regionu zapojené mezi dvě dlouhé PCR primery (mezi S-LA-16-H a S-LA-16-L, a H12293-Leu a L12321-Leu pro E. pelecanoides; obr. 1), ve kterém byla alternativně použita celková genomická DNA.

celkem 82 rybích univerzálních primerů (Miya a Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d; Ishiguro, Miya, a Nishida 2001; Kawaguchi, Miya, a Nishida 2001) byly použity v různých kombinacích k zesílení souvislé, překrývající se segmenty celého mitogenome pro každý z obou druhů. Druhově specifické primery byly navrženy v případech, kdy nebyly k dispozici žádné vhodné ryby-univerzální primery. Seznam primerů PCR používaných pro určitý druh je k dispozici od J. G. i. na vyžádání. Dlouhé PCR a následné PCR reakce byly provedeny, jak bylo popsáno výše (např., Miya a Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

dvouvláknové PCR produkty, čištěné pomocí pre-sekvenační sady (USB), byly následně použity pro sekvenování přímého cyklu pomocí terminátorů označených barvivem (aplikované biosystémy). Použité primery byly stejné jako u PCR. Všechny sekvenční reakce byly provedeny podle pokynů výrobce. Značené fragmenty byly analyzovány pomocí sekvenceru dna modelu 377 (aplikované biosystémy).

sekvenční analýza

sekvence DNA byly analyzovány pomocí programu počítačového softwarového balíčku DNASIS verze 3.2 (Hitachi Software Engineering)., Umístění 13 genů kódujících bílkoviny bylo určeno porovnáním dna nebo aminokyselinových sekvencí kostních mitogenomů ryb. 22 tRNA genů bylo identifikováno jejich Cloverleaf sekundárními strukturami (Kumazawa a Nishida 1993) a antikodonovými sekvencemi. Oba geny rRNA byly identifikovány sekvenční podobností a sekundární strukturou (Gutell, Gray a Schnare 1993). Sekvenční data jsou k dispozici od DDBJ/EMBL/GenBank s přístupovými čísly AB046473 a AB046475–AB046490 pro E. pelecanoides, a AB047825 pro S. lavenbergi.,

fylogenetická analýza

datové matice z Inoue et al. (2001d) a Miya, Kawaguchi a Nishida (2001) byly spojeny a redundantní taxony byly odstraněny. Byly přidány mitogenomické sekvence ze dvou úhořů gulper a dvou teleostů (Gymnothorax kidako, AP002976 a Salmo salar, U12143). Protože jednoznačné zarovnání obou genů rRNA na základě modelů sekundární struktury nebylo možné (Miya a Nishida 2000), nebyly v analýzách použity., Na ND6 gen nebyl použit v fylogenetických analýz, protože jeho heterogenní základní složení a trvale špatné fylogenetické výkon (např. Zardoya a Meyer 1996; Miya a Nishida 2000). Také, tRNA smyčky, tRNASer(AGY) (nestabilní odvodit sekundární struktury u některých druhů), a další nejednoznačně souladu regionech, například na 5′ a 3′ koncích několik protein-kódujících genů, byly vyloučeny, tvoří analýzy., Kromě toho, 3. pozice kodonu v protein-kódujících genů, které by mohly pozitivně omyl analýzu na vyšší úrovni vztahy actinopterygians (Miya a Nishida 2000) byly z analýzy vyloučeny, takže 7,984 k dispozici nukleotidových pozic z 12 protein-kódujících genů a 21 tRNA geny.

Bayesovské fylogenetické analýzy byly provedeny pomocí MrBayes 2.01 (Huelsenbeck and Ronquist 2001)., Obecné časově reverzibilní model s některé stránky, předpokládá se, že být neměnné a s variabilní lokalit, předpokládá se, že dodržovat diskrétní gamma distribucí (GTR + I + Γ; Yang 1994) byl vybrán jako nejlepší-fit, model nukleotidových substitucí (ModelTest verze 3.06; Posada a Crandall 1998). Nastavili jsme maximální věrohodnosti parametry v MrBayes takto: „lset nst = 6“ (GTR), „rates = invgamma“ (I + Γ), a „basefreq = odhad“ (odhadovaný podíl základní typy dat). Proces Markovského řetězce Monte Carlo byl nastaven tak, že současně běžely čtyři řetězy (tři vyhřívané a jedna studená)., Provedli jsme dva nezávislé pokusy pro 1 milion generací, se stromy vzorku každých 100 generací, z nichž každý začal od náhodného stromu. Dvě nezávislé analýzy se shodovaly na podobných skóre log-pravděpodobnosti a dosáhly „staniarity“ (nedostatečné zlepšení skóre ML) nejpozději do 120 000 generací., To znamená, že první než 1200 stromů byly vyřazeny, z každé analýzy, a zbývající 17,602 v kombinaci vzorky ze dvou nezávislých analýz byly použity ke generování 50% majority rule consensus tree, s procentem vzorků zotavuje nějaké konkrétní clade představuje, že clade je posteriorní pravděpodobnost (Huelsenbeck a Ronquist 2001).

Výsledky

Genomu Organizace

celková délka E. pelecanoides a. S. lavenbergi mitogenomes jsou 18,978 bp a 18,495 bp (s výjimkou pro část domnělého kontrolu regionu., lavenbergi), resp. (viz doplňkový materiál online). Obsah genomu těchto dvou úhořů gulper zahrnuje dva geny rRNA, 22 tRNA a 13 genů kódujících proteiny, jak se vyskytuje u jiných obratlovců (obr. 2). Stejně jako u jiných obratlovců je většina genů těchto dvou druhů kódována na H-prameni, s výjimkou ND6 a osmi tRNA genů. Všechny funkce jsou podobné délce jako u jiných kostnatých ryb s výjimkou genu COI a kontrolní oblasti pro e. pelecanoides a geny COI a cyt b Pro s., lavenbergi (přibližně 100, 800,150 a 30 bp delší než u jiných kostnatých ryb).

mitogenom e. pelecanoides obsahuje tři nekódující oblasti delší než 200 bp (obr. 2; viz také doplňkové materiály online; nekódující region a kontrolní oblast ). Na nc1, která se nachází mezi tRNASer(UCN) a tRNAAsp geny, a nc2, která se nachází mezi tRNAAsp a COII genů, obsahují dvě a čtyři pseudogenes odpovídající degeneruje kopie genu tRNAAsp, resp., Zdá se, že nekódující oblast (1,818 bp) umístěná mezi geny cyt b a tRNAPhe odpovídá kontrolní oblasti. Mitogenom s. lavenbergi také obsahuje tři nekódující oblasti delší než 200 bp (nekódující oblast a kontrolní oblasti ). NC, který se nachází mezi geny tRNALeu(CUN) a ND5, obsahuje nejméně dva pseudogeny odpovídající degenerujícím kopiím genu tRNALeu(CUN)., CR1 (992 bp), který se nachází mezi dvěma tRNA genových klastrů (TP a IM regionů), a CR2 (> 837 bp), která se nachází mezi cyt b a tRNAPhe genů, zdá se, odpovídají na kontrolní oblasti, a mají zcela identické sekvence více než 800 bp, což znamená, že absolvují společné evoluce (viz Kumazawa et al. 1998).

S výjimkou dvou duplicitní kontrolní oblasti (CR1 a CR2), v. S. lavenbergi mitogenome, mitogenomes ze dvou hlubinných gulper úhoři vykazují identický gen pořadí (obr. 2)., Pořadí mitochondriálních genů obou úhořů gulperů se však výrazně liší od pořadí všech ostatních dosud známých obratlovců. Když byly některé geny tRNA vyloučeny ze srovnání (obr. 2) jsme identifikovali pět gen bloky (A, tRNAGlu–tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; a E, tRNAArg–tRNASer(AGY) genové regiony), gen pořadí, které je shodné s typickými obratlovci.,

Fylogenetická Pozice Dvou Gulper Úhoři

na Obrázku 3 je 50% majority rule consensus tree na 17,602 v kombinaci vzorků z dvou nezávislých Bayesovské analýzy 59 mitochondriální sekvence nukleotidů, které z dlouhých 12 protein-coding (bez 3rd pozice kodonu), plus 21 tRNA geny (kmenových oblastech pouze) s použitím GTR + I + Γ model posloupnost evoluce (Yang 1994). S výjimkou několika uzlů v Neoteleostei byla většina vnitřních větví podporována vysokými Bayesovskými zadními pravděpodobnostmi (≥95%)., Je třeba poznamenat, že výsledný strom jednoznačně se ukazuje, nejen to, že dva gulper úhoři tvoří sestry-skupina vztah s vysokou posteriorní pravděpodobností (100%), ale také to, že jsou hluboce vnořený do Anguilliformes (pravda, úhoři), silně naznačuje, že byly odvozeny od úhoř-jako předka.

diskuse

V poslední době bylo stanoveno více než 140 úplných sekvencí mtDNA z aktinopterygských ryb (např. Miya a Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya, a Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya, a Nishida 2001; Miya, Kawaguchi, a Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003) a bylo hlášeno několik příkladů přeskupení genů (obr. 1). Je třeba poznamenat, že takové události přeskupení genů zahrnují jen málo genů a že genové uspořádání mitogenomů gulper eel se výrazně liší od genů jiných obratlovců.,

Fylogenetický Dopady na Původ Nových Genů Objednávky

odvodit evoluce genu opatření ve dvou gulper úhoři, inference pro rodové organizaci na základě spolehlivý fylogenetický rámce je nutné. I když gulper úhoři byly zahrnuty v Elopomorpha pouze na základě odlišné pelagických larev forma, označována jako leptocephalus, nikdo potvrdila jejich fylogenetická pozice pomocí znakové matice odvozené od morfologických nebo molekulárních dat (Inoue a Miya 2001).,

Bayesovská analýza pomocí mitogenomických dat z 59 druhů, které plně reprezentují teleostean rybí rozmanitost (obr. 3) nejen že potvrdil, že nový genový řád dvou úhořů gulper vznikl ve společném předku obou druhů, ale také prokázal, že jejich původ byl nezávislý na původu ostatních nových genových řádů. Zdá se také, že nový genový řád Congera myriastera, dalšího člena Elopomorfy, má původ nezávislý na původu gulperových úhořů., Je třeba poznamenat, že Anguilla japonica, která má typické pořadí genů obratlovců, byla s jistotou umístěna jako sesterský druh dvou úhořů. Nejskoupější rekonstrukce genové přeskupení událostí na fylogenetický strom je uvedeno, že aberantní gen pořadí dvou gulper úhoři je odvozen od typické obratlovců.

Možné Mechanismus pro Gen Přeskupení v Gulper Úhoři

Dva hlavní mechanismy byly navrženy vysvětlit genové přestavby v obratlovců mitogenomes (Lee a Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Jeden je tandemové duplikace genu regionů v důsledku uklouzl strand mispairing, následuje delece genů (Moritz a Brown, 1986; Levinson a Gutman 1987). Ačkoli dynamika uspořádání mitochondriálních genů nebyla vysvětlena u některých bezobratlých (např. Kurabayashi a Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et al. 2002), mitochondriální genové přeskupení obratlovců lze vysvětlit takovým mechanismem (Desjardins a Morais 1990; Quinn a Wilson 1993; Kumazawa a Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999; Inoue et al. 2001b) a jeho proveditelnost je podporována také častými polymorfními duplikacemi sekvencí mtDNA (např. Stanton et al. 1994; Gach a Brown 1997; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999). Další navrhované mechanismy vyvolávají nedovolené zavedení replikace trnas a výslednou integraci tRNA genů kolem kontrolní oblasti (Cantatore et al. 1987; Jacobs et al. 1989).,

ačkoli druhý model není v tomto bodě vyloučen,první model je upřednostňován jako mechanismus přeskupení genů v mitogenomech gulper eel. Za předpokladu, že je duplikován dlouhý fragment DNA v oblasti tRNAIle–CR typické organizace (obr. 4), následné odstranění redundantních genů by vedlo k přeskupené genové organizaci v gulperových úhořích. Takové tandemové duplikace a následné odstranění nejvíce parsimoniously vyústila ve sledovaném genu zájmu a související intergenic distanční v těchto dvou gulper úhoři.,

Vícenásobné odstranění redundantních genů se zdálo být neúplné ve dvou úhořích gulperů, kvůli několika úsekům nekódujících sekvencí (obr. 2) vyskytující se kolem genů zapojených do přeskupení (obr. 4). I když nc1 a nc2 v. E. pelecanoides a nc v. S. lavenbergi jsou složeny z opakujících se pseudogenes odpovídající degeneruje kopie přilehlé tRNA genů, CR1 a CR2 v. S. lavenbergi mitogenome mají identické sekvence více než 800 bp, a CR1 se nachází na domnělé duplicitní poloze, zatímco CR2 se nachází v původní poloze ovládací regionu., Toto pozorování v mitogenomu s. lavenbergi podporuje koncept tandemové duplikace a následných delečních událostí, ke kterým došlo v oblasti tRNAIle-CR(obr. 4).

Pokud čtyři z pěti sousedících genů bloky byly duplikovány dohromady společný předek dvou druhů, a pokud následné odstranění genů došlo před speciace, předpokládá duplicitní části gulper úhoři, od tRNAIle genu pro ČR typické organizace, byly přesahující 12 kb (obr. 1)., Před touto studií byly předpokládané duplikované oblasti stále známého přeskupení obratlovců přinejlepším 4 kb. Kromě toho, všechny známé tandemly opakované kódování sekvence byly omezeny na regiony sousedící s ČR, IQM, nebo WANCY regionů, což možná odráží občasné nepřesné ukončení replikace mimo jejich původ. Duplikovaná oblast v mitogenomu úhořů byla mnohem větší než u stále známých přestaveb obratlovců a zahrnovala téměř celý mitogenom (obr. 1).