Generelle principper for transgenesis
Transgene organismer indeholder fremmed DNA, der er blevet indført ved hjælp af bioteknologi. Fremmed DNA (transgenet) defineres her som DNA fra en anden art, ellers rekombinant DNA fra den samme art, der er blevet manipuleret i laboratoriet og derefter genindført. Udtrykkene transgene organisme og genetisk modificerede organisme (GMO) er generelt synonyme., Processen med at skabe transgene organismer eller celler, der skal komme hele organismer med en permanent ændring af deres kimlinje, er blevet kaldt enten transformation eller transfektion. (Desværre har begge ord alternative betydninger. Transformation henviser også til processen med pattedyrscelle, der bliver kræft, mens transfektion også henviser til processen med at indføre DNA i celler i kultur, enten bakteriel eller eukaryot, til midlertidig anvendelse, ikke kimlinjeændringer.) Transgene organismer er vigtige forskningsværktøjer, og bruges ofte, når man udforsker et gens funktion., Transgenese er også relateret til den medicinske praksis med genterapi, hvor DNA overføres til en patients celler til behandling af sygdom. Transgene organismer er udbredt i landbruget. 90% af raps, bomuld, majs, sojabønne og sukkerroer dyrket i Nordamerika er transgene. Ingen andre transgene husdyr eller afgrøder (undtagen nogle s .uash, papaya og alfalfa) produceres i øjeblikket i Nordamerika.
for at fremstille en transgen celle skal DNA først overføres over cellemembranen (og, hvis den er til stede, over cellevæggen) uden at ødelægge cellen., I nogle tilfælde kan nøgne DNA (hvilket betyder plasmid eller lineært DNA, der ikke er bundet til nogen form for bærer) overføres til cellen ved at tilføje DNA til mediet og midlertidigt øge membranens porøsitet, for eksempel ved elektroporation. Når man arbejder med større celler, kan nøgne DNA også mikroinjekteres i en celle ved hjælp af en specialiseret nål. Andre metoder bruger vektorer til at transportere DNA over membranen. Bemærk, at ordet “vektor” som anvendt her refererer til enhver form for bærer, og ikke kun plasmidvektorer., Vektorer til transformation / transfektion inkluderer vesikler lavet af lipider eller andre polymerer, der omgiver DNA; forskellige typer partikler, der bærer DNA på deres overflade; og infektiøse vira og bakterier, der naturligt overfører deres eget DNA til en værtscelle, men som er konstrueret til at overføre ethvert DNA-molekyle af interesse. Normalt er det fremmede DNA en komplet ekspressionsenhed, der indeholder sine egne cis-regulatorer (f.eks.
når formålet med et eksperiment er at producere en stabil (dvs., arvelig) transgen eukaryote, skal det fremmede DNA inkorporeres i værtens kromosomer. For at dette kan ske, skal det fremmede DNA komme ind i værtens kerne og rekombineres med en af værtens kromatider. I nogle arter indsættes det fremmede DNA på et tilfældigt sted i et kromatid, sandsynligvis uanset hvor strengbrud og ikke-homolog slutforbindelse forekommer. I andre arter kan det fremmede DNA målrettes mod et bestemt sted ved at flankere det fremmede DNA med DNA, der er homologt med værtens DNA på det sted., Det fremmede DNA inkorporeres derefter i værtsens kromosomer gennem homolog rekombination.for at producere multicellulære organismer, hvor alle celler er transgene og transgenet er stabilt arvet, skal cellen, der oprindeligt blev transformeret, enten være en gamete eller skal udvikle sig til væv, der producerer gameter. Transgene gameter kan til sidst parres for at producere homo .ygote, transgene afkom., Tilstedeværelsen af transgenet i afkom er typisk bekræftet ved hjælp af PCR eller Southern blotting, og udtryk for transgenet kan måles ved hjælp af reverse transkription PCR (RT-PCR), RNA blotting, og Vestlige (protein blotting).
transkriptionshastigheden for en transgen er meget afhængig af tilstanden af det kromatin, hvori det indsættes (dvs.positionsvirkninger), såvel som andre faktorer. Derfor genererer forskere ofte flere uafhængigt transformerede / transficerede linjer med samme transgen, og screener derefter for linjerne med det højeste udtryk., Det er også god praksis at klone og sekvensere det transgene locus fra en nyligt genereret transgen organisme, da fejl (trunkeringer, omlejringer og andre mutationer) kan introduceres under transformation/transfektion.
Skriv et svar