antistoffer er immunoglobulin (Ig) glycoproteiner produceret af plasmaceller (B-celler) som respons på fremmede antigene molekyler (immunogener). Den primære funktion af antistoffer er at binde specifikt til disse fremmede antigener for at deaktivere dem og/eller markere dem til destruktion af immunsystemet og derved beskytte værten mod infektion. Der er flere klasser af antistoffer., Den første del af dette resum.fokuserer på konventionelle antistoffer i fuld størrelse, IgG-og IgM-klassen antistoffer, som er stærkt udnyttet i en lang række forsknings -, diagnostiske og terapeutiske biomedicinske applikationer.
basisenheden for et konventionelt antistof er en fire polypeptidenhed bestående af to identiske tunge kæder og to identiske lette kæder, der holdes sammen af disulfidbindinger. De lette kæder er kortere med lavere molekylvægt end de tunge kæder., Den generelle form af et antistof, der er en Å, med et fleksibelt hængsel (interdomain) regionen i centrum af Y. fleksibilitet interdomain hinge regionen er vigtig for bivalent binding af et antistof , så de to bindende lommer til at interagere med antigene steder på variable afstande. Hver polypeptidkæde har en konstant region, som ikke varierer signifikant blandt antistoffer, og en variabel region, som er specifik for hvert enkelt antistof. Den fælles notation for den lette kæde variable region er VL og for den lette kæde konstant region er CL (Figur 1)., Notationen er ens for den tunge kædevariabel (VH) og konstante regioner (CH) med CH1, CH2 og CH3, der angiver de forskellige konstante regiondomæner i den tunge kæde. Kulhydrater er normalt knyttet til CH2-domænerne i de tunge kæder. Fragment crystallizable (Fc) region kun indeholder konstante regioner fra de tunge kæder (CH), men fragment antigen-bindende region (Fab), der indeholder både en konstant domæne, og de variable domæner af både tunge og lette kæder (VH og CL). Fragmentet variabel region FV region indeholder kun de to variable domæner (Figur 1)., Se mus antistof til diskussion om immunoglobulin isotyper, underklasser, og antallet af immunoglobulin domæner.
hvert komplet antistof har to antigenbindende lommer, der er placeret i FV-regionerne, og kan binde til to antigener (bivalent binding)., Hvis de to antigener imidlertid er for tæt (3 3 nm) eller for langt fra hinanden (. 29 nm), kan antistoffet kun binde til et antigen (monovalent binding). Der er en signifikant affinitetsændring mellem monovalente og bivalente bindinger med en 1.500 gange ændring i Kd-værdier .
strukturen af specifikke antistoffer, der er til rådighed fra de Strukturelle Antistof Database (SAbDab), en kurateret database af offentligt tilgængelige antistof strukturer, såvel som strukturel modellering værktøjer, som opdateres ugentligt fra Protein Data Bank (FBF) .,
konventionelle antistoffer i fuld størrelse er blevet anvendt i forskning til proteindetektion via analysesestern blot-analyser , immunhistokemi og en .ymbundne immunosorbentassays (ELISA) i årtier. Antistoffer i fuld størrelse er også udviklet til diagnostiske applikationer såsom graviditetstest og påvisning af bakterier og vira i blod, såsom en ELISA, der registrerer HIV. Derudover anvendes konventionelle antistoffer i fuld størrelse ofte i sygdomsterapeutika., For eksempel er Infli .imab et antistof af mange tilgængelige, der genkender tumornekrosefaktor alfa (TNFa), og det bruges til behandling af Crohns sygdom og reumatoid arthritis . Trastu .umab eller Herceptin er et antistof, der binder til epidermal vækstfaktorreceptor 2 og bruges til behandling af metastatisk brystkræft . Der er også flere antistofbaserede terapier, herunder Muromonab , givet til transplantationsmodtagere for at forhindre allograftafstødning.,
selvom konventionelle fuldstørrelsesantistoffer begge kan anvendes til terapeutiske anvendelser, er der fordele og ulemper ved at bruge det komplette antistof. En vigtig fordel ved konventionelle antistoffer er, at FC-regionen engagerer kroppens immunrespons og kan målrette bundne antigener til destruktion. Denne FC-region kan også være en ulempe i nogle kliniske anvendelser, fordi immunresponset, som det typisk fremkalder, kan være skadeligt for patientens helbred., Derudover kan antistoffer i fuld størrelse ikke trænge godt ind i visse væv på grund af deres relativt store størrelse . I nogle tilfælde kan FC-domænet, når der anvendes antistoffer i fuld størrelse til diagnostiske applikationer, forårsage betydelig uspecifik binding, hvilket kan forringe detektionsapplikationer.
til mange anvendelser foretrækkes antistoffragmenter. Antistoffragmenter kan produceres gennem kemiske eller genetiske mekanismer., Kemisk fragmentering anvender reduktionsmidler til at bryde disulfidbindingerne i hængselområdet og fordøjelsen af antistoffet med proteaser inklusive pepsin, papain og ficin. Genetisk konstruktion af fragmenter giver mulighed for at skabe et væld af fragment-holdige molekyler, hver med unikke bindende og funktionelle egenskaber.
Skønne, Skønne’, (Fab’)2, og FV
Kemisk og protease fordøjelse af fuld størrelse IgG-eller IgM-antistoffer udbytte antigen-bindende fragmenter (Fab; Figur 1), og Fc fragmenter, kun består af den tunge kæde CH2, og CH3 domæner., Biokemiske metoder til generering af antistoffragmenter producerer nyttige værktøjer til diagnostiske og terapeutiske anvendelser, men det er ret besværligt og kræver en stor mængde antistofudgangsmateriale.
de antigenbindende fragmenter produceret ved biokemisk fordøjelse inkluderer Fab, (Fab’)2, Fab’ og FV, som alle mangler FC-regionen. Monovalente F (ab)-fragmenter har et antigenbindingssted, mens divalente (Fab’)2-fragmenter har to antigenbindende regioner, der er bundet af disulfidbindinger., To individuelle F (ab) fragmenter fremstilles, når et fuldstørrelsesantistof fordøjes med papainen .ym. Et F (ab’)2-fragment, der bevarer en del af hængselområdet, fremstilles ved pepsinfordøjelse af IgG-eller IgM-antistoffer. Reduktion af F (ab’)2 fragmenter producerer 2 monovalente Fab ‘ fragmenter, som har en fri sulfhydrylgruppe, der er nyttig til konjugering til andre molekyler. FV-fragmenter er det mindste fragment fremstillet af en .ymatisk spaltning af IgG-og IgM-klasse antistoffer (Figur 1)., FV-fragmenter har antigenbindingsstedet lavet af VH-og VL-regionerne, men de mangler de konstante regioner i Fab (CH1 og CL) regioner (Figur 1, højre panel). VH og VL holdes sammen i FV-fragmenter ved ikke-kovalente interaktioner. Fragmenterne kan genereres gennem kommercielt tilgængelige kits, for eksempel F(ab’)2 Fragmenteringssæt fra G-Biosciences .,
genteknologiske metoder, der tillader produktion af enkelt kæde variabel fragmenter (scFv), som er FV type fragmenter, der består af VH og VL-domæner, som er forbundet med en manipuleret fleksibel linker peptid (Figur 1) . Manipulation af orienteringen af V-domæner og linker længde skaber forskellige former for FV molekyler . Når linkeren er mindst 12 rester lang, er scFv-fragmenterne primært monomere (som vist i Figur 1) ., Linkers, der er 3-11 rester lang udbytte scFv molekyler, der ikke er i stand til at folde ind i en funktionel FV domæne. Disse molekyler forbinder med et andet scFv-molekyle, der skaber en bivalent diabody . Hvis linkerlængden er mindre end tre rester, forbinder scFv-molekyler sig til triabodier eller tetrabodies . For eksempel, Tao Y et al genereret en VH-VL diabody med en kort GGGGS linker og scFv med en lang GTTAASGSSGGSSSGA linker ., Multivalente scfv ‘ er har større funktionel bindingsaffinitet til deres målantigener som et resultat af at have yderligere to målantigenbindingssteder, hvilket reducerer antistoffragmentets off-rate . Minibodies er scFv-CH3 fusionsproteiner, der samles til bivalente dimerer . Små scFv-fragmenter med to forskellige variable domæner kan genereres til at producere bispecifikke bis-scFv-fragmenter, der er i stand til at binde to forskellige epitoper samtidigt . Genetiske metoder bruges også til at skabe bispecific Fab dimers (Fab2) og trispecific Fab trimers (Fab3) ., Disse antistoffragmenter er i stand til samtidig at binde henholdsvis 2 eller 3 forskellige antigener.
ud over konventionelle antistoffer, camelid og haj (squalidae) arter, der indeholder en delmængde af ejendommelige Heavy Chain-Antistoffer (hcAb), der udelukkende består af tunge kæde homodimers mangler lette kæder . Fab-delene af disse antistoffer, kaldet VHH i kamelider og VNAR i hajer, er de mindste antigenbindende regioner, der naturligt findes ., Nanobodies er VHH-afledte rekombinante domæner, der er i stand til at binde antigener, ofte klonet fra VHH fagbiblioteker, såsom dem mod betacoronarivus s-proteiner . Deres bindende termodynamik og strukturer er blevet undersøgt (og reference deri)., Nanobodies er meget stabil og kan nemt fremstilles i stor mængde, ved at bruge fælles enkel protein udtryk systemer såsom bakterier (funktionelle konventionelle fuld størrelse antistoffer er vanskeligt at udtrykke korrekt i en bakteriel system), hvilket repræsenterer et lovende værktøj til forsknings-og behandlingsformål, især i de områder, der er af super-opløsning mikroskopi, massespektrometri og målrettet protein nedbrydning . Nanobodies kan også leveres inde i levende celler gennem konjugeret med peptider, eller in vivo, eller udtrykt direkte in vivo og genkende dets mål in vivo., Nanobodies mod RFP eller GFP, når konjugeret med langt rødt Atto farvestoffer, der er opnået 118-gange forstørrelse af fluorescerende signaler over GFP eller RFP, og blev brugt til at generere hele kroppen mus neuronale forbindelser . De er også blevet brugt til at stabilisere den aktive tilstand af proteiner i strukturelle undersøgelser . Et ekspressionssystem med flere sammenkædede nanobodies mod forskellige influen .astammer undersøges som et middel til at generere en universel influen .avaccine ., Rekombinante Anti-IgG sekundære nanobodies har stort potentiale til at erstatte meget anvendte polyklonale sekundære antistoffer produceret ved hjælp af dyr .Nanobodies har den unikke evne til at krydse blod-hjerne-barrieren ; nanobodies har imidlertid en tendens til at blive behandlet og ryddet meget hurtigt fra kroppen . Nanobodies kan bruges til metoder som immunoprecipitation, for eksempel, RFP-Fælde MA fra Chromotek , eller koblet til fluorescerende proteiner til at spore intracellulære mål i levende celler i real-tid .,10% af bovine immunoglobuliner indeholder en usædvanlig lang tredje tungkædede komplementaritetsbestemmende region (CDR 3H) med et stort antal cysteinrester . Disse cysteines parrer sig for at danne disulfidbindinger, hvilket fører til en stilk-og-knob-lignende struktur i antigenbindingsdomænet . Dette usædvanligt lange CDR3H-domæne med den lange stilk bidrager til mangfoldigheden af bovin antistofspecificitet.,
Intrabodies eller intracellulære antistoffer henviser til antistoffer eller deres fragmenter (normalt af scFv-design) udtrykt direkte inde i celler eller hos dyr in vivo gennem en ekspressionsvektor. For eksempel udviklede Dong J .et al flere nanobodies mod neuronale proteiner til intracellulær ekspression som intrabodies. En vigtig overvejelse / advarsel er det reducerende intracellulære miljø, der mindsker affiniteten af et antistof eller antistoffragment, hvis binding med antigenet er afhængig af intradomain disulfidbindinger., En anden overvejelse er, at intrabodies har tendens til at aggregere. Kabayama H et al designet intrabodies med en netto engative afgift, selv ved den laveste cytoplasmatisk pH 6.6 til at generere ultra-stabil cytoplasmatisk antistoffer . Intrabodies bruges som alternativer til farmakologiske hæmmere til at målrette mod specifikke endocytiske deltagere., For tilfælde, der er udtryk for en enkelt-kæde variabel fragment (scFv) stammer fra 3B12A monoklonalt antistof mod TDP-43 nuklear eksport signal i HEK293A celler eller efter in utero elektroporation af sin ytringsfrihed vektor fremmet proteolyse af TDP-43 aggregater i dyrkede celler og embryonale mus hjernen ., Virus-medieret levering i nervesystemet af en scFv-antistof mod RNA anerkendelse motiv 1 af TDP-43 reduceret microgliosis i en musemodel for akut neuroinflammation og mindskes kognitiv svækkelse, motor fejl, TDP-43 proteinopathy, og neuroinflammation i transgene mus, der udtrykker TDP-43 mutationer, der er knyttet til amyotrofisk lateral sklerose . Intrabodies potentiale som terapeutisk modalitet er fortsat at dukke op.
et antistoffragment kan også forbindes med et celle-import-tag, såsom et IPTD-tag , for at lette dets indtræden i celler.,
Antistoffragmenter giver visse fordele i forhold til et fuldstørrelsesantistof til nogle applikationer. Dette emne blev gennemgået af Nelson . En fordel ved fragmenter over antistoffer i fuld størrelse er, at antistoffragmenter er mindre end konventionelle antistoffer og generelt mangler glycosylering, hvilket tillader deres produktion i prokaryote ekspressionssystemer, hvilket giver tid og omkostningsbesparelser., Derudover er fragmenter små nok til at infiltrere i nogle væv, som antistoffer i fuld størrelse ikke er i stand til at trænge ind, hvilket hjælper i mange terapeutiske og immunhistokemiske procedurer . Desuden er manglen på FC-domæne en væsentlig fordel for primære antistoffer, der anvendes i immunhistokemi og andre detektionsapplikationer, fordi de i høj grad har reduceret ikke-specifik binding til FC-receptoren. En scFv, der er almindeligt anvendt i diagnostik er NC10 antistof mod influen .a neuraminidase., MOC-31 antistof mod epitelcelleadhæsionsmolekyle Ep-CAM er en scFv, der almindeligvis anvendes som kræftbehandling. Diabodies, triabodies og tetrabodies har potentielle anvendelser i applikationer såsom radioimmunoterapi og diagnostisk in vivo-billeddannelse . Dog fragmenter, der mangler Fc domæne er nedbrudt i kroppen meget hurtigere end konventionelle antistoffer , og er i stand til at fremkalde Fc-medieret cytotoksiske processer, medmindre de er konjugeret til en effektor-delen , som kræver yderligere optimering for antistof-fragment-baseret terapi.,
selvom forskellige antistoffragmenter giver visse fordele, anvendes de ikke ofte i forsøg. I de mere end 60.000 artikler manuelt kurateret af Labome kun et par artikler Citeret anvendelser af antistof Fab fragmenter. Roche anti-digoxigenin Fine antistof fragmenter ( 11093274910) og anti-fluorescein Fine antistof fragmenter ( 11426338910) er genereret i får og produceret gennem fordøjelsen med papain. Anti-digo .igenin Fab-fragmenter blev anvendt til in situ-hybridiseringer, da RNA-proberne er mærket med digo .igenin ., De blev også brugt til at udføre proteinfoldningsanalyse for at studere processen med enkelt calmodulinmolekyle, der foldes gennem enkeltmolekyle kraftspektroskopi . F(ab) fragmenter af anti-mus sekundære antistoffer er ofte bruges til at blokere endogen mus Ig under immunfarvning, for eksempel, AffiniPure Fab-fragment Æsel antimouse IgG fra Biozol (JIM-715-007-003) .,
Invitrogen Alexa Fluor 546-konjugeret ged anti-kanin-IgG-F(ab’)2-fragment, der blev brugt til at udføre immunhistokemi til at undersøge den rolle, sFLT-1 i vedligeholdelse af avaskulær photoreceptor lag i mus modeller og Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2-fragment af kanin anti-ged IgG (H+L) blev brugt i immunhistokemi til at undersøge mekanismen for tip link regenerering i auditive hår celler .,
Fc-receptorer (FCR ‘ er) er molekyler, der primært udtrykkes på / i medfødte immunceller, der genkender og binder FC-domænet for antistoffer og derved initierer en cellebaseret immunrespons. De forskellige funktioner FcRs afspejler den brede vifte af beskyttende eller modulerende roller af antistoffer, herunder at formidle neutralisering og afslutning af målrettede underlag, samt programmering af adaptiv immunitet ., De biologiske funktioner af FcRs er reguleret af immunoreceptor tyrosin-baseret aktivering motiver (ITAMs) og immunoreceptor tyrosin-baseret hæmmende motiver (ITIMs), der fungerer som receptor interface med aktiverende og hæmmende signalveje, hhv. Således kan signalering af ITAMs fremkalde celleaktivering, fagocytose og endocytose, mens signalering af itimer har en hæmmende virkning på celleaktivering . FCR ‘ er er blevet beskrevet for alle klasser af immunoglobuliner, og nogle af dem diskuteres nedenfor.,denne familie omfatter FcyRI, fcyrii, fcyriii og deres isoformer. De er ansvarlige for antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet (ADCC) og antistofafhængig cellemedieret fagocytose (ACDP) .
en Anden receptor, der binder IgG er neonatal Fc-receptor (FcRn), som er involveret i overførslen af passiv humoral immunitet fra en mor til hendes foster. FcRn beskytter også IgG mod nedbrydning in vivo, hvilket forklarer deres lange halveringstid i serum ., Dette fænomen har ført til udvikling af bedre terapeutiske antistoffer ved at indføre ændringer i FC-regionen for at fremme FC-fcrn-interaktionen.
De har høj affinitet FceRI, som er i stand til bindende monomerisk IgE, og lav affinitet C-type lectin FceRII, som interagerer fortrinsvis med komplekse IgE. FceRI formidler den øjeblikkelige overfølsomhedsrespons af mange allergiske reaktioner ved at stimulere degranulering og frigivelse af en række inflammatoriske mediatorer på mastceller og basofiler ., FceRII findes både i en membranbundet form, der leverer et nedregulerende signal til IgE-syntese , såvel som opløselige fragmenter, der genererer en modsat opregulering på IgE-syntese . Dens rolle i transcytose af IgE-allergenkomplekser i humane luftveje og tarmepitelet undersøges aktivt som et potentielt mål for allergisk luftvejsinflammation som følge af fødevareallergier .
det eneste medlem af IgA-receptorgruppen, FcaRI, udtrykkes kun i celler af myeloid afstamning., Det spiller en rolle i både pro – og antiinflammatoriske reaktioner afhængigt af tilstanden af IgA bundet. Mens binding af sekretorisk IgA (SIgA), der er til stede på slimhindesteder, har antiinflammatoriske virkninger, herunder forebyggelse af patogeninvasion, fører binding af serum IgA til inflammatoriske reaktioner. FcaRI regulerer også neutrofil levedygtighed afhængigt af det inflammatoriske mikromiljø . trim21
TRIM21 kan skelnes fra andre FCR ‘ er, da det viser en bred antistofspecificitet. Det kan binde IgG, IgM og IgA . Det udtrykkes også af celler af de fleste histogene linjer ., TRIM21 deltager i antistofmedieret interferens af viral replikation ved at målrette cytosoliske virus-antistofkomplekser til proteasomal nedbrydning.
Binding af Fc domæner til FcRs kan have uønskede virkninger i monoklonalt antistof-baserede analysemetoder, såsom immunohistokemi (IHC), fluorescens-aktiveret cell sorting (FACS) og chromatin immunoprecipitation (ChIP). Ikke-specifik binding til FCR ‘ er kan indføre baggrundsstøj, der kan føre til påvisning af falske positiver., Løsninger til at håndtere dette problem omfatter anvendelse af (i) isotype kontrol for gating, (ii) serum til bredt konkurrere om receptorer involveret i ikke‐specifik binding, eller (iii) oprenset IgG at blokere FC receptorer specifikt . Innovex Fc-Receptor blokker #NB309 kan bruges til at blokere paraffin og frosne dele i løbet af IHC-eller IC-eksperimenter eller BD Biosciences #553142 , Miltenyi Biotec Fc-receptor blokere for flowcytometri. For eksempel blokerede Chopra s et al fcyr-binding med 5 µg/ml TruStain FC. (Anti-mouse CD16 / 32, clone 93) Fra BioLegend under Flo .cytometri og cellesortering.,
Dr. Macarena frit.Kelly fra S .o Jos. dos Campos, SP, Brasilien, bidrog med afsnittet om Fc-receptorer i September 2018.
Skriv et svar