Epilering inducerer hår og hud pigmentering gennem en EDN3/EDNRB-afhængige regenerativt respons melanocyte stamceller

Epilering inducerer hår og hud, hyperpigmentering i C57BL/6J mus

Generelt, hårsækkene på den dorsale hud af mus viser en synkroniseret første hår cycle15., Hårsækkene på hele dorsale hud er typisk i anagen fra postnatal dag 1-12, i catagen fra dag 16-19, og i telogen derefter indtil den næste anagen11, 22, 23. For at visualisere hudpigmenteringsændringer under den postnatale hårcyklus depilerede vi dorsale bagagerum og hovedområder i C57BL/6J-mus på postnatal dag 11 (P11) (anagen vi-stadie i første hårcyklus), P21 (telogen-stadie) eller P30. Som vist i Fig. 1A, var hele skindet homogent sort på P11 og homogent lyserødt på P21., Interessant nok var hovedbundens hud ved P30 stadig lyserød, mens ryghuden var sort (fig. 1A). Disse data indikerer, at selv om MCSC ‘ er i hovedbundens hårsække differentieres til modne melanocytter under den første hårcyklus, aktiveres de ikke for at regenerere melanocytter på et tidspunkt, hvor hårsækkene allerede er tilbage i anagen af den anden hårcyklus. Vi testede derfor, om epilering kunne aktivere MCSC ‘ er i hovedbunden på dette tidspunkt., Denne epileringsbehandling inducerede signifikant ekspression af inflammatoriske faktorer, men deres niveau er meget lavere end det, der induceres af sårskade, hvilket antyder, at epilering kun inducerer en mild form for hudskade (fig. S1). Det er interessant, når hovedbund hår af C57BL/6J mus blev epilated på P21 (som nævnt, i den telogene fase af den første hår cyklus), hovedbund pigmentering var signifikant øget (6.06 ± 1,5 gange, n = 9) allerede 7 dage senere, på P28 (Fig. S2A, B) og epileringsområdet producerede en pigmenteret ø (Fig. 1B)., Tilsvarende, epilering-induceret regenererende hår var hyperpigmenteret (2.68 ± 0.87 fold, n = 5) sammenlignet med hår af ikke-epilated kontrol (Fig. 1C, D). Disse resultater indikerer, at epilering i hovedbunden kan fremkalde for tidlig hudrepigmentering og hårhyperpigmentering.

fordi hår fysiologisk regenererer på bagsiden af C57BL / 6J mus under den første postnatale hårcyklus (fig. 1A), spekulerede vi også på, om epilering ville fremkalde ændringer i hårregenerering på bagsiden. Faktisk 7 dage efter epilering ved P21 blev det epilerede område hyperpigmenteret sammenlignet med det ikke-epilerede (fig. S2C, D), ligesom de enkelte regenererede hår (Fig. S2E)., Disse data antyder, at epileringsinduceret hyperpigmentering ikke er begrænset til hovedbunden. I betragtning af disse observationer spurgte vi også, om virkningerne af epileringsinduceret hyperpigmentering stadig ville fungere hos gamle mus. Betagende, regenererende hår tilbage i 1,5 år-gamle mus blev betydeligt hyperpigmenteret 30 dage efter epilering (1.07 ± 0.08 fold, n = 3), sammenlignet med unepilated, hvilende hår (0.84 ± 0.03) (Fig. 1E, F). Hertil kommer, HPLC-analyse viste, at epilering inducerer eumelanin syntese (1.79 ± 0.09 fold, n = 3) i stedet for pheomelanin syntese (0.97 ± 0.,12 fold, n = 3) i ryghår (Fig. S3). Dette antyder, at epilering inducerer aktivering af MCSC ‘ er for at generere enten mere modne melanocytter, eller det øger melaninsyntesen i modne melanocytter i hårpærer fra ældre mus.

Epilering-skade, der stimulerer McSC spredning og inducerer generation af dermal og epidermale melanocytter og udtryk for melanogenesis-relaterede gener

i Betragtning af, at melanogenesis er koblet til anagen24, vi har undersøgt, om epilering-induceret pigmentering i hovedbunden er forårsaget af anagen induktion. Som vist i Fig., 2A startede de epileringsinducerede hårsække anagen straks, mens hårsækkene i ikke-epilerede kontrolmus forblev på telogen i en længere periode. Derfor reagerede den hvilende hårfollikel McSCs på epilering ved at blive aktiveret. Syv dage efter epilering blev pigmenterede melanocytter observeret ikke kun i modne hårpærer, men også i dermis, åbninger af hårsækkene og den interfollikulære epidermis (fig. 2A)., Tilsvarende blev melanocytspecifikke markører, såsom PMEL17 og TYR, påvist i de epileringsinducerede pigmenterede regioner, men ikke i kontrol hårsække (fig. S4A). Hertil kommer, at western blot data viste, at de niveauer af melanogenesis-relaterede proteiner TYRP1 (4.22 ± 0.96 fold, n = 6) og TYR (9.75 ± 2.76 fold, n = 6) var begge steg betydeligt ved epilering (Fig. S4B og S9). Resultaterne antyder, at epilering ikke kun aktiverer MCSC ‘ er, men også inducerer regenerering af melanocytter til at befolke interfollikulære områder.,

I ryggen huden, 7 dage efter epilering på P21, den samlede melanocyt-nummer, i hvert hår pære (20 ± 1.9) var signifikant øget sammenlignet med fysiologiske regenerering (15.7 ± 1.4) (Fig. 2B)., Tilsvarende var der også flere melanosomer i de epileringsinducerede regenererede hårpærer end i fysiologisk regenererede hårpærer (fig. 2C og Fig. S4C, D). Disse data tyder på, at epilering induceret McSC hyperproliferation under den første postnatale hår cyklus. Ja, 3 dage efter epilering, den McSCs’ spredning, var højere (86.2 ± 3,5% af cellerne blev Ki67-positive efter epilering i forhold til 45.6 ± 3,4% af cellerne positive for Ki67 i kontrol) (Fig. 2D)., Det er interessant, KIT-positive celler, der blev ikke fundet i epidermis, men de eksisterede i håret bule 1 dag efter epilering og tydeligt til stede i epidermis 3 dage efter epilering (Fig. 2E og Fig. S5). Antallet af Kit+ celler i epilated epidermis (2.32 ± 0.72/afsnit, n = 4) er steget betydeligt sammenlignet med fysiologiske epidermis (0.77 ± 0.68/afsnit, n = 4) (Fig. 2F). Tilsvarende blev 7 dage efter epilering også pigmenterede celler fundet i epidermis (fig. 2E, F)., Desuden kvantitative RT-PCR 7 dage efter epilering afsløret induktion af mange melanogenesis-relaterede gener, herunder Tyr (2.84 ± 1.13 gange i løbet af kontrol, n = 3), Tyrp1 (3.89 ± 0.72 fold, n = 3), Mitf (3.47 ± 0.38 fold, n = 3), Sox10 (2.13 ± 1.13 fold, n = 3), Pax3 (3.18 ± 0.43 fold, n = 3) og Ednrb (3.28 ± 0.62 fold, n = 3) (Fig. S6A). Samlet set antyder disse resultater, at epilering inducerer McSCs-spredning, migration til epidermis og stimulering af melanogeneseprogrammet.,

epilering inducerer edn3-ekspression i hårsække og epidermis

blandt de gener, der induceres ved epilering, var EDNRB af særlig interesse på grund af dets velkendte involvering i reguleringen af melanocytlinjen1, 12. For nylig er udtrykket af dets ligander Edn1 og Edn2 rapporteret at blive forøget under fysiologisk håranagen, men dets ligand Edn3-udtryk blev ikke påvirket12. Derfor spekulerede vi på, om epilering af ryghår ville fremkalde disse ligander., Som bekræftelse af ovenstående resultater fandt vi, at ekspressionen af Edn1 og Edn2 under fysiologisk regenerering blev forøget i ryghuden ved P26, men Edn3-ekspression viste ingen ændring (fig. 3A og Fig. S11). Overraskende nok inducerede epilering ikke kun ekspressionen af Edn1 og Edn2, men også edn3 (Fig. 3A), hvis kodede produkt, EDN3, tidligere har vist sig at være involveret i melanocytudvikling1, 25, 26. Derfor fokuserede vi vores undersøgelse på EDN3 og dens signalvej. Vi fandt, at niveauet af EDN3-protein var signifikant forøget i epileret hud (D0, 0.,94 ± 0.2 fold; D3, 1.81 ± 0.09 fold; D5, 4.57 ± 0.67 fold; n = 6), men forblev lavt i kontrol huden (D0, 1.25 ± 0.47 fold; D3, 0.83 ± 0.14 fold; D5, 1.21 ± 0.2 fold; n = 6) (Fig. 3B og Fig. S12). Immunohistokemi viste, at edn3-protein på epileringsdag 1 blev forøget i dermal papilla, epidermis og sekundær hårkim. På dag 7 blev det også øget i åbningerne af hårsækkene (Fig. 3C). Regioner med høj epilering-induceret EDN3 niveauer var i tæt kontakt med McSCs i den sekundære hår kim (sHG) eller med hår pære, melanocytter., Ved hjælp af voksen heterozygote Ednrb lacZ /+ mus, så vi fandt, at EDNRB er udtrykt i pigmenterede melanocytter af hår pærer og i sHG, svarende til udtryk i Dct-lacZ i hårsækkene (Fig. 3D). Desuden, immunfarvning data viste, at β-Gal positive celler blev co-mærket med KIT-positive celler i sHG og med MITF-positive celler i håret pære (Fig. 3E), hvilket antyder, at EDNRB udtrykkes i MCSC ‘ er og melanocytter., As expected, 7 days after epilation, western blot analysis and immunostaining data showed that Ednrb-lacZ expression is significantly increased in melanocytes (Figs S6B,C and S13). These results suggest that epilation induces EDN3, which then stimulates its receptor EDNRB to regulate McSCs and melanocytes.

EDN3 er kendt for dens virkninger på stimulering af vækst og differentiering af melanocyte precursors1, 25, 26., For nylig er transgen overekspression af EDN3 rapporteret for at forhindre hårgraying forårsaget af gentagne epilering27, hvilket antyder, at EDN3 også påvirker MCSC ‘ er. For at undersøge effekten af EDN3 på McSCs, vi isoleret DCT+ celler fra E16.5 vildtype epidermis og stimuleret dem med EDN3 eller BQ788 (en EDNRB-hæmmer). Som vist i Fig. S7A, stimulation med EDN3 øger spredning af DCT+ celler (fra 43.7 ± 2% op til 61.4 ± 7.5%, n = 5), men denne effekt af EDN3 var fuldstændig blokeret af BQ788 (26.4 ± 1.56%, n = 5)., Baseret på de kendsgerninger, som for unpigmented celler, DCT er en specifik markør for McSCs og at der ikke er nogen gamle melanocytter i E16.5 epidermis4, 28, resultatet tyder på, at EDN3/EDNRB er nødvendig for McSC spredning.

Ednrb er nødvendig for epilering-induceret hår og hud pigmentering

for At vurdere betydningen af EDNRB signalering til epilering-induceret hud, hyperpigmentering, vi brugte homozygot Ednrb lacZ/lacZ (Ednrb−/−) mus. Sådanne mus er stort set fri for pigmentceller, men bevarer pigmenterede pletter ved bunden af hovedet og halen., Fjorten dage efter epilering i hovedet regionen, regenererende hår var hyperpigmenteret i vildtype mus (2.41 ± 0.55 fold, n = 5), men ikke i Ednrb−/− mus (Fig. 4A, B). I unepilated Ednrb−/− mus, melanin niveauer af hår skakter var lavere (0.51 ± 0.06 fold, n = 5) sammenlignet med dem, der er i kontrol vildtype mus (1.02 ± 0.14 fold, n = 5) (Fig. 4B). Derudover blev hudrepigmentering signifikant forøget hos vildtype mus, men kun lidt i Ednrb – / – mus (Fig. 4C). Hudmelaninniveauerne induceret ved epilering var signifikant lavere hos Ednrb – / – mus (1, 85 0 0.,79 gange, n = 9) sammenlignet med dem i vildtype mus (5,1 0 0,62 gange, n = 9). Disse resultater tyder på, at sletning af Ednrb forstyrrer epilering-induceret hår hyperpigmentering og hud repigmentering. Desuden er tab af EDNRB forbundet med hårgraying. Melanin niveauer af pigmenterede hår skakter af Ednrb−/− mus blev reduceret mellem en måned gammel (0.96 ± 0.1 fold, n = 4) og op til 12 måneder (0.37 ± 0.12 fold, n = 4), i modsætning til deres niveauer i hår skakter af vildtype mus (1.96 ± 0.17 fold, n = 4 på en måned; 2.15 ± 0.43 fold, n = 4, 12 måneder) (Fig. S7B).,

for At undersøge, om EDNRB signalering er nødvendige for epilering-induceret hyperpigmentering i ryggen huden, har vi udført intradermal injektion af BQ788, efter epilering af vildtype mus. Som vist i Fig., 4D, mens kontrol intradermal injektion af NaCl efter epilering lov til hud, hyperpigmentering (fra 0.23 ± 0.06 fold op til 1.0 ± 0.15 fold, n = 3), injektion af BQ788 faldt betydeligt epilering-induceret hud pigmentering (0.76 ± 0.1 fold, n = 3). Denne konstatering antyder, at farmakologisk forstyrrelse af EDNRB kan blokere epileringsinduceret hudhyperpigmentering i ryghuden. Samlet set antyder disse data, at EDNRB-signalering er påkrævet til epileringsinduceret hyperpigmentering.,

EDNRB påvirker McSC spredning i hårsækkene og regulerer melanogenesis-relateret gen-udtryk

for At undersøge, hvordan den manglende Ednrb nedsætter hudens pigmentering, vi histologisk analyseret pigmentering af hår follikler på hovedbunden (der, som nævnt, fortsat pigmenteret i Ednrb−/− mus, i modsætning til bagsiden). Som vist i Fig., 5A, på dag 5 efter epilering, hår pærer og hår skakter af Ednrb−/− mus blev normalt er til stede i hovedbunden, men var hypopigmented sammenlignet med vildtype mus, hvilket tyder på, at tab af EDNRB ikke påvirke hår cyklus, men falder melanocyt-numre eller melanin syntese i pæren. Faktisk 7 dage efter epilering var melanosomtallet af Ednrb – / – mus meget lavere end for vildtype mus (Fig. 5B)., Hertil kommer, at melanocyt-specifikke markører såsom PMEL17 og TYR kunne ikke påvises i dermis, åbninger af hårsækkene, eller interfollicular epidermis af Ednrb−/− mus 5 dage efter epilering, selvom de var til stede på et lavt niveau i håret pærer (Fig. S7C). Desuden forblev McSC-markørsættet og pigmenterede melanocytter uopdagelige selv 7 dage efter epilering(Fig . 5C og Fig. S7D). Disse resultater antydede, at EDNRB er påkrævet til epilering-induceret epidermal melanocytregenerering.,

for At analysere, hvordan tabet af EDNRB reducerer melanin niveau af hår pærer, så vi kvantificerede melanocyt-numre i hvert hår pære af vildtype og Ednrb−/− mus 7 dage efter epilering., Antallet af MITF-positive celler ved epilering var lavere i hver hårsæk af Ednrb−/− mus (11.7 ± 2.2) i forhold til hårsækkene i vildtype mus (15.7 ± 1.43) (Fig. S7D). Dette resultat antydede, at tab af EDNRB kunne blokere epileringsinduceret proliferation af melanocyt-afstamningsceller. For nylig, Takeo et al. fandt, at under fysiologisk hårregenerering er EDNRB-signalering også nødvendig for McSCs-spredning og vedligeholdelse29. Ikke desto mindre var det stadig ukendt, om EDNRB påvirker epileringsinduceret McSC-spredning., Da EDN3 udtrykkes i dermal papilla i nærheden af modne melanocytter i hårpæren, testede vi, om EDN3/EDNRB-signalering påvirker McSC-proliferation i bule eller stimulerer melaninsyntese i follikulære melanocytter. I hovedbund, anti-KIT og Ki67 immunfarvning data viste, at 3 dage efter epilering, McSC spredning i hvert hår bule Ednrb−/− mus (52 ± 5.2%) var lavere end i tilsvarende buler af vildtype mus (86.2 ą 3,5%) (Fig. 5D). Dette antyder, at EDNRB også er påkrævet til epilering-induceret McSC-proliferation i hårbukken.,

for at få yderligere indsigt i de underliggende mekanismer isolerede vi melanocytter til in vitro-dyrkning. Som vist i Fig. 5E, den pigmentering af Ednrb−/− primære melanocytter fra pigmenteret hoved hårsækkene af P6 Ednrb−/− mus, der var lavere (0.47 ± 0.1 fold, n = 5) end vildtype primære melanocytter (1.0 ± 0.1 fold, n = 5). Lignende resultater blev opnået i cellepellets eller når melaninindholdet blev direkte målt (Fig. 5F). Vi analyserede derefter, om EDNRB-signalering ville påvirke ekspressionen af melanogeneserelaterede gener. Som vist i Fig., 5G, på dag 7 efter epilering, er udtryk for melanogenesis-relaterede gener, der var faldet i Ednrb−/− hovedbunden, herunder udtryk for Pax3 (0.47 ± 0.07 fold, n = 3), Tyr (0.55 ± 0.05 fold, n = 3) og Tyrp1 (0.5 ± 0.02 fold, n = 3). Dette antyder, at edn3 / EDNRB-signalering er involveret i både melanocytproliferation og melanogenese under epileringsinducerede regenerative reaktioner af MCSC ‘ er. Samlet set indikerer disse fund, at epilering inducerer melanogeneserelateret genekspression gennem EDN3 / EDNRB-signalering og igen fører til hyperpigmentering af hud og hår.