Evolution af det Dybe Hav Gulper Ål Mitokondrie-Genomer: Store Gen-Rearrangementer Opstod I Ål

Abstrakt

de Seneste undersøgelser har vist, at afvigelser fra den typiske hvirveldyr mitokondrie-gen for er mere hyppige end oprindeligt tænkt., Sådanne afvigelser er imidlertid mindre, hvor inversioner og/eller translokationer af nogle få gener er involveret, og tandem-duplikering af genregionerne efterfulgt af deletioner af gener er blevet påberåbt som mekanismer med oprindelse i en sådan ny genorden., I løbet af molekylær-fylogenetisk undersøgelser på Elopomorpha (ål og deres allierede), fandt vi, at mitokondrie-genomer (mitogenomes) fra de to dybe hav gulper ål, Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) og Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), udviser samme gen, for hvilket i høj grad adskiller sig fra alle andre hvirveldyr. Fylogenetisk analyse ved hjælp af mitogenomiske data fra 59 arter af fisk bekræftede ikke kun en enkelt Oprindelse af en sådan genorden med tillid, men indikerede også, at den var afledt af den typiske hvirveldyrsgenorden., Detaljerede sammenligninger af gulper ål gene for med typiske hvirveldyr foreslog, at forekomsten af et enkelt skridt, store overlapning af genet region, der strækker sig >12 kb, efterfulgt af fjernelse af gener i en fælles forfader for de to arter, hvoraf de fleste parsimoniously regnskabet for dette usædvanlige gen arrangement.

introduktion

hvirveldyrs mitokondrielle genorden blev oprindeligt betragtet som konservativ, fordi de komplette nukleotidsekvenser af mitokondrielle genomer (mitogenomer) fra pattedyr (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981) og den afrikanske kløvede frø (Roe et al. 1985) viste en fælles genorden. Som komplet mitokondrie-DNA (mtDNA) sekvenser, der er fastsat for en række af hvirveldyr (269 arter, som af 11. juni 2003, National Center for Biotechnology Information Web-site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), har det været anerkendt, at afvigelser fra den typiske gene for ikke så sjældne i hvirveldyr (fig. 1; Boore 1999). Med undtagelse af placentale pattedyr omfatter eksempler alle større linjer af hvirveldyr som lampreys( Lee og Kocher 1995), amfibier (Macey et al. 1997; Sumida et al., 2001), reptiles (Kuma anda anda and Nishida 1995; 1996uinn and Mindell 1996; Macey et al. 1997), fugle (Desjardins og Morais 1990, 1991; Quinn og Wilson 1993; Mindell, Sorenson, og Dimcheff 1998), pungdyr (Pääbo et al. 1991; Janke et al. 1994), og fisk (Miya og Nishida 1999; Inoue et al. 2001b; Miya, ka andaguchi og Nishida 2001). Sådanne genomomlægninger er imidlertid lokale (især inden for en klynge af tRNA-gener), og der er ikke fundet noget eksempel, der involverer genomisk skala omlejringer.,

Gulper ål er velkendt dybt havdyr, kollektivt, herunder fire familier, der er placeret i den rækkefølge, Saccopharyngiformes, der opstår på bathypelagic dybder (>1.000 m) gennem verdens oceaner (Bertelsen, Nielsen og Smith, 1989). Deres bi .arre udseende (fig. 1), som er resultatet af ekstremt forstørrede, deformerede gapes på spidsen af ålens slangelignende hoved og krop, har tiltrukket sig stor opmærksomhed fra mange forskere (f.Bertelsen, Nielsen, and Smith 1989; Robins 1989)., Sådanne specialiserede anatomiske funktioner har ført efterforskere til at antage, at den fylogenetiske positioner af disse dyr, der er uden for knoklet fisk (fx, Tchernavin 1946), selv om de har generelt været anset for at være nære pårørende, de ægte ål (for Anguilliformes), fordi de har et blad-som leptocephalous larvestadiet (Greenwood et al. 1966; Inoue og Miya 2001).,

i løbet af molekylære fylogenetiske undersøgelser af Elopomorpha (ål og deres allierede) ved hjælp af mitogenomiske data fandt vi en usædvanlig mitokondrielt genordre for en af gulperålene, Eurypharyn.pelecanoides (fig. 1). Denne artikel beskriver nye gen organisation i mitogenomes af to arter af gulper ål, E. pelecanoides og saccopharyn.lavenbergi. Vi anvendte en polymerasekædereaktion (PCR)-baseret tilgang udviklet af Miya og Nishida (1999) til sekventering af de komplette mitogenomer af disse fisk., For at undersøge oprindelsen af sådanne unikke mitogenomer udsatte vi de mitogenomiske data for fylogenetisk analyse, og vi diskuterer her de mulige mekanismer, der genererer et sådant genarrangement i de to gulper ål.

materialer og metoder

prøver

mitokondrielle DNA-sekvenser blev opnået fra seks individer fra to arter, der repræsenterer to familier i rækkefølgen Saccopharyngiformes (Robins 1989). For den monotypiske familie Eurypharyngidae, et individ af E., pelecanoider blev anvendt som prøve til bestemmelse af den komplette mtDNA-sekvens, og de andre fire individer, inklusive to leptocephaløse larver, blev anvendt til bestemmelse af partielle sekvenser af fire store genforbindelser (fig. 2) for at bekræfte genrækkefølgen i E. pelecanoides mitogenome. For familien Saccopharyngidae blev et enkelt individ af S. lavenbergi brugt som en prøve til bestemmelse af den komplette mtDNA-sekvens., Voucher-prøver blev deponeret i fisk samlingerne på Natural History Museum & Institut, Chiba, Japan (CBM-ZF), og på University of Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, det sydlige Japan; CBM-ZF 10312, 10313, 10316, og 10317: ækvatoriale centrale Stillehav) og S. lavenbergi (UW 045633: Østlige Stillehav).

DNA-ekstraktion

en del af den epaksiale muskulatur (ca. 0, 25 g) blev udskåret fra friske prøver af hver art og straks konserveret i 99, 5% ethanol., Total genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af tissueiagen tissueiaamp vævssæt efter producentens protokol.

polymerasekædereaktion og sekventering

hele mitogenomerne af to gulper ål blev forstærket under anvendelse af en lang-PCR-teknik (Cheng, Higuchi, and Stoneking 1994). Fem fisk-universal og tre arter-særlige long-PCR-primere (S-LA-16S-L + H12293-Leu og L12321-Leu + S-LA-16S-H-E. pelecanoides; L2508–16S + Sala-ND4-H og Sala-CO1-L + Sala-ND1-H i S. lavenbergi; fig. 1) blev anvendt til at forstærke hele mitogenomet af hver ål i to reaktioner., Hele mitogenomes af de andre fire E. pelecanoides personer blev forstærket med tre fisk-universal primer og arter-særlige long-PCR-primer (L2508–16S + Eupe-ND2-H og L12321-Leu + S-LA-16S-H). Fire arter-specifikke primere (Eupe-ND2-H-E. pelecanoides; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H, og Sala-ND4-H i S. lavenbergi) var alternativt udformes med henvisning til den delvise nukleotidsekvenser fra ND2 gen af E. pelecanoides og COI, ND1, og ND4, må ikke overstige gener af S. lavenbergi bestemmes ud fra hver totale DNA ved hjælp af fisk-universal primer.,

long-PCR-produkter blev fortyndet med TE buffer (1:20) til senere brug som PCR-skabeloner, bortset fra en region, der går mellem de to long-PCR-primere (mellem S-LA-16S-H og S-LA-16-L, og H12293-Leu og L12321-Leu for E. pelecanoides; fig. 1), i hvilket totalt genomisk DNA blev anvendt alternativt.

i alt 82 fisk-universelle primere (Miya og Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d; Ishiguro, Brudepigekjoler, og Nishida 2001; Kawaguchi, Brudepigekjoler, og Nishida 2001) blev anvendt i forskellige kombinationer til at forstærke sammenhængende, overlappende segmenter af hele mitogenome for hver af de to arter. Artsspecifikke primere blev designet i tilfælde, hvor der ikke var nogen passende fisk-universelle primere til rådighed. En liste over PCR-primere, der anvendes til en bestemt art, er tilgængelig fra J. G. I. Efter anmodning. Long-PCR og efterfølgende PCR-reaktioner blev udført som tidligere beskrevet (f.Miya og Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

dobbeltstrengede PCR-produkter, oprenset under anvendelse af et præ-Sekventeringssæt (USB), blev efterfølgende anvendt til direkte cyklussekventering ved anvendelse af farvestofmærkede terminatorer (Applied Biosystems). De anvendte primere var de samme som for PCR. Alle sekventeringsreaktioner blev udført i henhold til producentens anvisninger. Mærkede fragmenter blev analyseret ved hjælp af en model 377 DNA se .uencer (Applied Biosystems).

sekvensanalyse

DNA-sekvenser blev analyseret ved hjælp af computersoft .arepakkeprogrammet dnasis version 3.2 (Hitachi Soft .are Engineering)., Placeringer af de 13 proteinkodende gener blev bestemt ved sammenligninger af DNA eller aminosyresekvenser af benede fisk mitogenomer. De 22 tRNA-gener blev identificeret ved deres sekundære kløverbladstrukturer (Kuma .a .a og Nishida 1993) og antikodonsekvenser. De to rRNA gener blev identificeret ved sekvens lighed og sekundær struktur (Gutell, grå, og Schnare 1993). Sekvens data er tilgængelige fra DDBJ/EMBL/GenBank med tiltrædelse numre AB046473 og AB046475–AB046490 for E. pelecanoides, og AB047825 for S. lavenbergi.,

fylogenetisk analyse

data matricer fra Inoue et al. (2001d) og Miya, Kawaguchi, og Nishida (2001) blev kombineret og overflødige taxa, der blev elimineret. Mitogenomiske sekvenser fra de to gulper ål og to teleost (Gymnothora.kidako, AP002976 og Salmo salar, U12143 ) blev tilføjet. Da entydige justeringer af de to rRNA-gener på basis af sekundære strukturmodeller ikke var gennemførlige (Miya og Nishida 2000), blev de ikke anvendt i analyserne., ND6-genet blev ikke anvendt i de fylogenetiske analyser på grund af dets heterogene basesammensætning og konsekvent dårlig fylogenetisk ydeevne (fard 1996ardoya og Meyer 1996; Miya og Nishida 2000). Også tRNA sløjfer, tRNASer(AGY) (ustabile udledte sekundære strukturer i nogle arter) og andre tvetydigt justerede regioner, såsom 5′ og 3′ enderne af flere proteinkodende gener, blev udelukket fra analyserne., Derudover blev 3.kodonpositioner i de proteinkodende gener, der positivt kunne vildlede en analyse af forhold på højere niveau af actinopterygians (Miya og Nishida 2000) udelukket fra analyserne, hvilket efterlod 7,984 tilgængelige nukleotidpositioner fra de 12 proteinkodende gener og 21 tRNA-gener.

Bayesian fylogenetiske analyser blev udført under anvendelse af MrBayes 2.01 (Huelsenbeck and Ron .uist 2001)., Den generelle tid reversible model med nogle steder antages at være uforanderlig og med variable steder antages at følge en diskret gamma distribution (GTR + i + Γ; Yang 1994) blev valgt som den bedste fit model af nukleotid substitution (ModelTest version 3.06; Posada og Crandall 1998). Vi indstiller de maksimale sandsynlighedsparametre i MrBayes som følger:” lset nst = 6 “(GTR),” rates = invgamma “(i + Y) og” basefre. = estimat ” (estimeret andel af basetyper fra dataene). Markov-kæden Monte Carlo-processen blev indstillet således, at fire kæder (tre opvarmede og en forkølelse) løb samtidigt., Vi gennemførte to uafhængige løb i 1 million generationer, hvor træer blev samplet hver 100 generationer, som hver startede fra et tilfældigt træ. To uafhængige analyser konvergerede på lignende log-sandsynlighedsresultater og nåede” stationaritet ” (manglende forbedring i ML-score) Senest 120.000 generationer., Således er den første til 1.200 træer blev kasseret fra den enkelte analyse, og de resterende 17,602 kombineret prøver fra to uafhængige analyser, som blev brugt til at generere en 50% flertal konsensus træet, med den procentdel af prøver at inddrive nogen særlig undergruppe, der repræsenterer denne undergruppe er posterior sandsynligheden (Huelsenbeck og Ronquist 2001).

Resultater

Genom Organisationer

Den samlede længder af E. pelecanoides og S. lavenbergi mitogenomes er 18,978 bp og 18,495 bp (bortset fra en del af den formodede kontrol region for S., lavenbergi), henholdsvis (se supplerende materiale online). Genomindholdet af disse to gulper ål omfatter to rRNA, 22 tRNA og 13 proteinkodende gener, som findes i andre hvirveldyr(fig . 2). Også som i andre hvirveldyr kodes de fleste gener af disse to arter på H-strengen, bortset fra ND6-og otte tRNA-generne. Alle funktioner er ens i længden til dem i andre benede fisk med undtagelse af COI-genet og kontrolregionen for E. pelecanoides og Coi-og cyt B-generne for S., 100, 800, 150 og 30 bp længere end dem i andre benede fisk, henholdsvis).

E. pelecanoides mitogenome indeholder tre ikke-kodende regioner længere end 200 bp (fig. 2; Se også supplerende materialer online; noncoding region og kontrol region). Nc1, der er placeret mellem trnaaser (UCN) og tRNAAsp-generne, og NC2, der er placeret mellem trnaasp-og COII-generne, indeholder to og fire pseudogener svarende til degenererende kopier af tRNAAsp-genet., En ikke-kodende region (1,818 bp) placeret mellem cyt b-og tRNAPhe-generne ser ud til at svare til kontrolregionen. S. lavenbergi mitogenome indeholder også tre ikke-kodende regioner længere end 200 bp (ikke-kodende region og kontrolregioner ). Nc, der er placeret mellem trnaleu(CUN) og ND5-generne, indeholder mindst to pseudogener svarende til degenererende kopier af trnaleu (CUN) genet., CR1 (992 bp), der ligger mellem to tRNA-genklynger (TP-og IM-regioner), og CR2 (> 837 bp), der ligger mellem cyt b-og tRNAPhe-gener, ser ud til at svare til kontrolregionen, og de har helt identiske sekvenser over 800 bp, hvilket indikerer, at de gennemgår samordnet udvikling (se Kuma .a .a et al. 1998).

Med undtagelse af de to kopieret kontrol regioner (CR1 og CR2) i S. lavenbergi mitogenome, den mitogenomes fra de to dybe hav gulper ål udviser en identisk gene for (fig. 2)., Imidlertid adskiller den mitokondrielle genorden for de to gulper ål sig meget fra den for alle andre hidtil kendte hvirveldyr. Når nogle tRNA-gener blev udelukket fra sammenligningerne (fig. 2) identificerede vi fem genblokke(a, tRNAGlu–tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; og E, tRNAArg–tRNASer (AGY) genregioner), hvis genrækkefølge er identisk med den for typiske hvirveldyr.,

Fylogenetiske position for To Gulper Ål

Figur 3 er 50% flertal rule consensus træet af 17,602 kombineret prøver fra to uafhængige Bayesian analyser af de 59 mitokondrie-nukleotidsekvenser fra den sammenkædede 12 protein-kodende (no 3rd codon positioner), plus 21 tRNA-gener (stamceller regioner) brug af GTR + I + Γ model af sekvens evolution (Yang 1994). Med undtagelse af nogle få noder i Neoteleostei blev de fleste interne grene understøttet af høje bayesiske posterior sandsynligheder (95 95%)., Det skal bemærkes, at det resulterende træ, der udtrykkeligt viser ikke blot, at de to gulper ål danne en søster-gruppen forhold med en høj posterior sandsynligheden (100%), men også, at de er dybt indlejret i Anguilliformes (sand ål), der er stærkt tyder på, at de har været afledt af en ål-lignende forfader.

Diskussion

for nylig er mere end 140 komplette mtDNA-sekvenser fra de aktinopterygiske fisk blevet bestemt (f.Miya og Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Brudepigekjoler, og Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Brudepigekjoler, og Nishida 2001; Miya, Kawaguchi, og Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003), og flere eksempler på genomlægninger er blevet rapporteret (fig. 1). Det skal bemærkes, at sådanne genomarrangementsbegivenheder involverer få gener, og at genarrangementet af gulper ål mitogenomer adskiller sig meget fra andre hvirveldyrs.,

Fylogenetiske Konsekvenser på Oprindelsen af Nye genetiske For

for At udlede udviklingen af gen-arrangementer i de to gulper ål, inferens for slægts-organisation baseret på en pålidelig fylogenetiske ramme er påkrævet. Selv om den gulper ål har været inkluderet i Elopomorpha udelukkende baseret på en særskilt pelagisk larve form, kaldet leptocephalus, ingen har bekræftet deres fylogenetiske position ved hjælp af tegn, matricer, der stammer fra morfologiske eller molekylære data (Inoue og Miya 2001).,

Bayesian analyse ved hjælp af mitogenomiske data fra 59 arter, som fuldt ud repræsenterer teleostean fisk mangfoldighed (fig. 3) ikke kun bekræftet, at det nye gen rækkefølgen af de to gulper ål stammer fra en fælles forfader for de to arter, men også vist, at deres oprindelse var uafhængig af de andre nye genetiske ordrer. Det ser også ud til, at den nye genorden af Conger myriaster, et andet medlem af Elopomorpha, har en oprindelse uafhængig af gulper ål., Det skal bemærkes, at Anguilla japonica, som har den typiske hvirveldyrsgenorden, med tillid blev placeret som en søsterart af de to gulper ål. Den mest parsimoniske rekonstruktion af genomarrangementsbegivenhederne på det fylogenetiske træ indikerede, at den afvigende genorden for de to gulper ål er afledt af typiske hvirveldyr.

Mekanisme til Gene Ombygning i Gulper Ål

To store mekanismer er blevet foreslået til at forklare de gen-rearrangementer i hvirveldyr mitogenomes (Lee og Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Den ene er tandem-duplikering af genregioner som et resultat af forkert glidende streng efterfulgt af sletninger af gener (morit.og Bro .n 1986; Levinson og Gutman 1987). Selvom dynamikken i mitokondrielle genarrangementer ikke er blevet forklaret hos nogle hvirvelløse dyr (f.Kurabayashi og Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et al. 2002), hvirveldyr mitokondrie-gen-rearrangementer kan godt forklares ved en sådan mekanisme (Desjardins og Morais 1990; Quinn og Wilson 1993; Kumazawa og Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999; Inoue et al. 2001b), og dens gennemførlighed understøttes også af de hyppige polymorfe duplikationer af mtDNA-sekvenser (f.eks. 1994; Gach and bro 1997n 1997; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999). De andre foreslåede mekanismer påberåber sig ulovlig priming af replikation af tRNA ‘ er og den resulterende integration af tRNA-gener omkring kontrolregionen (Cantatore et al. 1987; Jacobs et al. 1989).,

selvom den anden model ikke er udelukket på dette tidspunkt, foretrækkes den første model som mekanismen for genomarrangement i gulper ål mitogenomes. Under forudsætning af, at et langt DNA–fragment i trnaile-CR-regionen i den typiske organisation duplikeres (fig. 4), ville efterfølgende sletninger af overflødige gener give anledning til den omarrangerede genorganisation i gulper ål. Sådan tandem-duplikering og efterfølgende sletninger resulterede mest parsimonisk i den observerede genorden og tilknyttede intergeniske afstandsstykker i disse to gulper ål.,

flere sletninger af overflødige gener syntes at være ufuldstændige i de to gulper ål på grund af flere strækninger af ikke-kodende sekvenser (fig. 2) forekommer omkring de gener, der er involveret i omlejringen (fig. 4). Selv om nc1 og nc2 i E. pelecanoides og nc-i S. lavenbergi er sammensat af gentagne pseudogenes, der svarer til de degenererede kopier af tilstødende tRNA-gen, CR1 og CR2 i S. lavenbergi mitogenome har identiske sekvenser over 800 bp, og CR1 er beliggende på den formodede duplikeres position, mens CR2 er placeret på den oprindelige position af kontrol regionen., Denne observation i S. lavenbergi mitogenome understøtter begrebet tandem dobbeltarbejde og efterfølgende sletning begivenheder, som har fundet sted i tRNAIle–CR-regionen (fig. 4).

Hvis fire af fem sammenhængende gen blokke blev duplikeret sammen i en fælles forfader for de to arter, og hvis de efterfølgende sletning af gener, der er opstået, før den sammensætning, den forudsatte kopieret dele af gulper ål, der spænder fra tRNAIle gen til CR af den typiske organisation, var der strækker sig ud over 12 kb (fig. 1)., Før denne undersøgelse var de formodede duplikerede regioner med nogensinde kendt hvirveldyromlejring 4 kb i bedste fald. Desuden var alle de kendte tandemly gentagne kodningssekvenser begrænset til regioner, der støder op til CR -, i .m-eller WANANCY-regionerne, hvilket muligvis afspejler lejlighedsvis upræcis afslutning af replikationer ud over deres oprindelse. Den duplikerede region i gulper ål mitogenom var meget større end for nogensinde kendte hvirveldyromlejringer og involverede næsten hele mitogenomet (fig. 1).

Vi takker de kaptajner, officerer, besætning, forskere og studerende om bord i den KT97-10 cruise<– –> af R/V Tansei Maru og KH00-1 krydstogt i R/V Hakuho Maru, for deres hjælp med at indsamle prøver. Denne undersøgelse kunne ikke have været mulig uden den generøse donation af S. lavenbergi vævsmateriale, som vi oprigtigt takker E. O. O.iley. Vi takker også to anonyme anmeldere for deres værdifulde kommentarer til manuskriptet. Tak skyldes også Y., Fukuyo, K. Furuya, K. Nanba, og ph.d. – studerende ved Fiskeri, Oceanografi Laboratory, University of Tokyo, for generøst giver os mulighed for at bruge deres eksperimentelle faciliteter, og Marshall Editions Ltd. Andromeda O Oxford Ltd.; og Tokai University Press for tilladelse til at bruge illustrationer og fotografier. K. Pearson gav venligst relevante oplysninger om identiteten af “S. lavenbergi” – prøven. Denne undersøgelse blev delvis støttet af tilskud fra Japans ministerium for Uddannelse, Videnskab og kultur (nr., 09740644, 10460081, 10660189, 11640705, 11691177, 12460083, og 12NP0201) og “Forskning for Fremtiden” Program Nr. JSPS-RFTF 97L00901 fra Japan Society for Fremme af videnskab. Kt blev støttet af Research Foundation fra Tou .a Shokuhin Shinkoukai og Eel Research Foundation fra Nobori-kai.

litteratur Citeret