Grænser i Mikrobiologi

Indledning

Bacillus thuringiensis og de andre 7 arter af sporedannende Gram positive bakterier, herunder B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, og B. mycoidesare, er primært fundet i jord. Fordi disse bakterier er meget ens i genotype og fænotype, klassificeres bakterierne som B. cereus-gruppe i taksonomi (Park et al., 2007). B., cereus og B. thuringiensis er meget påviselige i fødevarer, da de observeres i råvarer fra landbrugsjord under dyrkning og distribution. Derudover diskrimineres disse to bakterier normalt ikke i klinisk diagnostik. B. cereus er en anden risikoprioriteret gruppe af fødevarebåren sygdom i friske landbrugsprodukter, og forureningen er et af de største problemer i grøntsager (Felciocio et al., 2015). Navnlig B., thuringiensis blev brugt som pesticid i dyrkning af visse afgrøder, og det er velkendt som mikrobielle insekticider, der er blevet brugt til at reducere mængden af kemiske pesticider (a .mi et al., 2015).

B. thuringiensis producerer insekticide proteiner, som er den vigtigste type krystallinske (Cry) proteiner (Kutasi et al., 2016). Omvendt fører aktivt voksende vegetative celler, der mangler krystalproduktion, til ikke-toksiske virkninger. Δ-endotoksinerne indeholder hovedsageligt cytolytisk (Cyt) og skrig (Elleuch et al., 2015; Rao et al., 2015)., Cyt og Cry har imidlertid forskellige sekvenshomologier, selvom de består af lignende virkemåder mod cellelyse, hvilket fører til permanent skade på insektet midgut (Adang et al., 2014).

den strukturelle variation af fire end-endotoksiner (Cry1, Cry2, Cry3 og Cyt2Ah) blev observeret ved røntgenkrystallografi (Dehury et al., 2013). Disse gener er identificeret i transgen bomuld og andre grøntsager, som er betydeligt effektive til bekæmpelse af skadedyr., Design af en biomarkør for det oversatte produkt varierer med de forskellige kategorier af cry-protein; derfor vil detektionen være kompleks. 16S rRNA-gensekvenserne baseret på universelle primere viste høj lighed (>99%) indeks mellem B. cereus og B. thuringiensis (B .hm et al., 2015), som ikke kan klassificeres ved hjælp af genetiske og fænotypiske assays (Peng et al., 2015). Yderligere har der været en diskussion siden 2000 om, hvorvidt hele B. cereus-gruppen skal behandles som en kompleks art af forskellige bakterier (Helgason et al.,, 2000; Bartos ande andic and og Marja andska, 2017). Der er også forslag, der fylogeni af disse bakterier, der bedre passer til deres økologiske egenskaber (psychrotolerance, virulens) end at taksonomiske tilhørsforhold (Drewnowska og Swiecicka, 2013; Bartoszewicz og Marjańska, 2017). For at løse dette problem målrettede vi XRE for at opdage B. thuringiensis, der styrer den største type krystalproteinproduktion.

disse to bakterier er meget ens i biokemiske resultater (B .hm et al., 2015) og genetiske egenskaber (Osman et al., 2015). Cho et al., (2015) rapporterede også, at de genetiske og fænotypiske egenskaber mellem disse bakterier næppe kan skelnes. Desuden pfrunder et al. rapporterede, at B. cereus – gruppearter ikke kan identificeres pålideligt ved anvendelse af klassisk biotyping(Pfrunder et al ., 2016). Baseret på disse er de biokemiske eksperimenter måske ikke nok til differentiering. I stedet blev tilstedeværelsen af et insekticid krystalprotein anvendt som en fremtrædende egenskab til at differentiere disse bakterier (Ekino et al., 2014; 2014ei et al., 2018).,

Nogle af de faktorer, der adskiller disse to bakterier, er baseret på deres patogenicitet i prøver. B. cereus forårsager gastrointestinal lidelse, mens B. thuringiensis også har været involveret i epidemier af diarr.. Som rapporteret er det kendetegnende ved B. thuringiensis tilstedeværelsen af insekticide krystalproteiner (- – endoto .in) krypteret med græsgener (Osman et al., 2015; Albright et al., 2016). Siden identifikationsmetoden ved hjælp af biomarkøren til differentiering B., cereus-gruppen er kompleks og tidskrævende, en meget effektiv biomarkør er presserende nødvendigt for at erstatte de tidligere, der gav en lavere effektivitet og nogle gange endda viste falske resultater. Baseret på de to specifikke gener, transkriptionel regulator og crystal protein gener for B. thuringiensis (Porcar, og ciudad Juárez Pérez, 2003; Han et al., 2006), blev den aktuelle undersøgelse udført for at inspicere og sammenligne effektiviteten af den designede biomarkør (2006re) med effektiviteten af den eksisterende krystalproteinmarkør (cry2) ved identifikation af B. thuringiensis fra B. cereus-gruppestammer (BCG) og ikke-B., stammer fra cereus – gruppen (non-b) i fødevarer. Cry2 er det mest almindelige krystalprotein, der findes i B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma et al., 2014).

Materialer og Metoder

Bakterier Kulturer Forberedelse

Alle de 120 stammer, herunder 111 af Bcg og 9 non-B, blev indhentet fra bakteriel samlinger i Usa og Sydkorea (Supplerende Tabel 1). Blandt samlingerne blev B. thuringiensis ATCC 10792 (type stamme) anvendt til optimering af eksperimentelle betingelser for konventionel PCR og real-time PCR., Alle stammerne blev optøet ved stuetemperatur (25.C) og stribede på næringsstofagaren (Difco, MI, USA). Efter dyrkning i 24 timer ved 35.C i inkubatoren blev en ren koloni plukket og inokuleret i tryptisk sojabuljong (Difco, MI, USA), og kulturer natten over blev anvendt til efterfølgende eksperimenter.

Primerdesign og DNA-isolering

de respektive primere rettet mod B.re til differentiering B., thuringiensis (Tabel 1) blev udviklet i henhold til følgende sekvens i Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gen – 3664610-3665047) ved hjælp af Primer Express® – Software (Version 3.0.1) fra Applied Biosystems, som ligger i CA, Usa og syntetiseret af Bioneer Corporation fra Daejeon, Sydkorea. Udførelsen af designetrere blev sammenlignet med cry2 (Ben-Dov et al., 1997). Efter 24 timers berigelse i TSB blev en alikvot på 1 mL bakterier underkastet den genomiske DNA-ekstraktion under anvendelse af PrepMan Ultra Ultra Sample Preparation reagens (Applied Biosystems, CA, USA)., DNA-koncentrationer blev målt ved Eppendorf BioSpectrometer fluores fluorescens (Eppendorf, Hamborg, Tyskland) og justeret til 10 ng/µL. DNA-prøver blev opbevaret ved -20 C C før brug.

konventionel PCR og Real-Time PCR Assay

den konventionelle PCR blev fremstillet med en C1000 TouchTM termisk cykler fra Bio-Rad placeret i Hemel Hempstead, Storbritannien., Reaktionsrøret til PCR anvendte Accu-Po .er Py Pyro Hot Start Ta.PCR-forblanding fra Bioneer Corporation beliggende i Daejeon, Korea og et volumen på 20 µL, herunder 1LL af hver primer (10 pmoL/µL) og 2 µL DNA. Amplifikationsbetingelser for den konventionelle PCR for transkriptionel regulator (rere) var: initial denaturering ved 95.C i 5 minutter, efterfulgt af 35 cyklusser med denaturering ved 95. C i 30 s, annealing ved 49. C i 30 s og forlængelse ved 72. C i 30 s, og en endelig forlængelse ved 72. C i 5 minutter., Suppleringer forhold til crystal protein (Cry 2), var: indledende denaturering ved 95°C i 5 min, efterfulgt af 35 cyklusser af denaturering ved 95°C i 30 s, udglødning ved 55°C i 30 s og brudforlængelse på mindst 72°C i 1 min., og en endelig forlængelse ved 72°C i 5 min. Efter DNA-amplifikationer, 1.5% (W/V) agarosegelopløsning indeholdende RedsafeTM Nukleinsyreopløsning 20.000 ((Intron Biotechnology, Inc.) blev fremstillet og gelelektroforese blev udført under anvendelse af Sub-celle model 192 fra Bio-Rad placeret i Hemel Hempstead, Storbritannien., Båndene blev visualiseret ved hjælp af Smart vie.Pro UVCI-1100 Imager system fra Major Science beliggende i CA, USA. Nøjagtighed (AC) blev anvendt til at evaluere PCR-metoden ved hjælp af primere XRE og cry2 i detektion af B. thuringiensis fra Bcg og ikke-B. Negative aftale (NA) betyder det samme negative resultat for ikke-B. thuringiensis ved hjælp af PCR med XRE og cry2. Positiv aftale (PA) betyder det samme positive resultat for B. thuringiensis ved anvendelse af PCR med andre og cry2. Nøjagtigheden (AC) måles ved hjælp af følgende ligning, AC = 100 100% (Ma et al., 2014).,

Real-time PCR-eksperimenter blev udført af StepOneTM real-time PCR-systemet fra Applied Biosystems placeret i CA, USA. Et reaktionsvolumen på 20 µL bestående af 10 µL Smeltedoctortm-Masterblanding med høj opløsning (HRM), 2 µL DNA, 0,5 µL af F/R-primeren (10 pmoL /ll) (tabel 2). Forstærkning betingelser af qPCR var: indledende denaturering ved 95°C i 10 min og 40 cyklusser ved 95°C i 15 s og 60°C i 1 min. Derefter blev temperaturen i den efterfølgende smeltekurveanalyse indstillet til at hæve fra 60 til 95.C ved 0,3. C/cyklus for at teste primerens specificitet.,

Evaluering af Real-Time PCR-Analyse

udførelsen af XRE og cry2 blev evalueret ved hjælp af 50 B. thuringiensis stammer, mens den eksklusivitet, der blev testet med 70 ikke-target-bakterier, herunder 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg, og 9 ikke-B (Chelliah et al., 2017). En standardkurve blev fremstillet ved anvendelse af 10 gange fortyndinger af DNA ekstraheret fra B. thuringiensis ATCC 10792., DNA-koncentrationer blev justeret fra 10 ng/µL at 100 fg/µL, svarende til 2,6 × 106 til 2,6 × 10 CFU, og suppleringer blev udført ved real-time PCR med triplicates. Til negative kontroller blev destilleret vand anvendt. Negative resultater eller ingen amplifikationskurver blev overvejet, når cyklustærskelværdierne (Ct) var over 40.

Detektion af B. thuringiensis i Spidse smagsprøver

Salat (Lactucasativa), Kimbab, og spinat (Spinaciaoleracea) blev købt fra et lokalt marked i Chuncheon, Korea., Prøverne blev testet for fravær af målbakterier i henhold til ISO 7932 (2004). En alikvot på 50 g af hver slags mad blev tilberedt i en steril stomacher-taske fra Nasco Whhirl-Pak beliggende i .i, USA. Overnight B. thuringiensis kulturer blev fortyndet i 0,5% peptonvand og anvendt til fremstilling af kunstigt forurenede prøver med inokulationsniveauer fra 103 til 105 CFU / g (Chon et al ., 2012; Kim et al., 2013). En alikvot på 1 mL suspension af fødevareprøver blev overført til et nyt steriliseret rør og anvendt til DNA-ekstraktion.,

resultater og diskussion

påvisning af B. thuringiensis under anvendelse af cry2-genet

For de 120 stammer blev amplifikationsprodukter på cirka 700 bp opnået under anvendelse af primerne cry2 (tabel 1). Som vist i tabel 2 og figur 1, blev 6 B. cereus-stammer og 36 B. thuringiensis-stammer (72%) amplificeret ved anvendelse af PCR-målretning af cry2. Ingen anden B. cereus-gruppe eller ikke-B-gruppe blev forstærket. Dette viste en nøjagtighed på 82% af cry2 til påvisning af B. cereus-grupper. For de 120 testede stammer gav 100 stammer NAs eller PAs, hvilket indikerer en samlet nøjagtighedsprocent på 83.,3% (Supplerende Tabel 1). Mens Riojas et al. (2015) rapporterede en multiplex PCR af ikke-ribosom peptid-syntase (NRP), gen-og cry1 til at identificere B. cereus og B. thuringiensis med en specificitet på 24,5% i B. cereus og 15% i B. thuringiensis.

det er rapporteret, at B. thuringiensis-stammen kan syntetisere et eller flere krystalproteiner, da der er fundet et eller flere krystaltoksingener for B. thuringiensis. Hovedårsagen til mangfoldigheden af toksingener er overførslen af plasmider i B. thuringiensis (Adang et al., 2014). Det er en hyppig proces til plasmidoverførsel ved enten konjugation eller mobilisering (Makart et al., 2017)., Endvidere genererer udvekslingen af græsgener B. cereus med en ny binding af græd, der fører til ligheden mellem B. cereus og B. thuringiensis (FIU .a, 2015). Derudover viste cry-generne med en anden isolationskilde en forskel i mangfoldighed og distributioner. For eksempel kan et nyt græsgen findes i hvert habitat, der viser forskellig insekticid aktivitet.

påvisning af B. thuringiensis under anvendelse af genere-genet

potentielle kodningssekvenser (CDS) blev forudsagt at være transkriptionelle regulatorer., CD ‘ er indeholder en helix-turn-helix (HTH) motiv i XRE-lignende protein familie og MerR familie transkriptionel tilsynsmyndigheder, som tidligere tilsvarende XRE gen-sekvenser i pBMB28 af B. thuringiensis YBT-020 og pCT281 af B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, som er relateret til HTH-typen transkriptionel regulator, SinR, var identisk med det tilsvarende element pG9842 af B. cereus G9842 (GenBank: CP001187). HTH-proteinerne deltager sammen med Sigma-faktorer i en lang række signalveje, for eksempel som undertrykkere, der hæmmer sporulation (Mura .ska et al.,, 2014), biofilm dannelse (Colledge et al., 2011) og proteasesekretion (Pflughoeft et al ., 2011). Bortset fra Cry1Ab21 og δ-endotoxin kodet i toksigent plasmid pIS56-63, som er ansvarlig for konjugation og sporulation (Martínez-Núñez et al., 2010; Deng et al., 2014) derudover med 53 forskellige kodede formodede proteiner.

PCR-resultaterne medrere viste, at ingen af 58 B. cereus eller non-B gav en amplifikation (tabel 2 og figur 1). I alt viste 50 stammer af B. thuringiensis 47 positive resultater (94%). Dette viste en nøjagtighed på 97.,3% XRE til påvisning af B. thuringiensis blandt de testede B. cereus-grupper. For de 120 testede stammer gav 117 stammer NAs eller PAs, hvilket indikerer en samlet nøjagtighedsprocent på 97, 5% (supplerende tabel 1).

standardkurve og Amplifikationseffektivitet

realtids-PCR-assayet blev udført under anvendelse af DNA-ekstrakterne fra de rene kulturer af B. thuringiensis-type stamme ATCC 10792 rettet mod genere-genet. Det udviklede realtids-PCR-assay var effektivt til at detektere koncentrationer fra 2,6 10 10 til 2,6.106 CFU/reaktion, som dækkede 6 størrelsesordener., Ligningen af log kopi nummer versus Ct værdi for B. thuringiensis var y = -3.853. + 21.244 med en R-kvadreret værdi på 0,993, hvilket indikerer den høje linearitet (figur 2).

Spidse Mad Prøver Detection

for Nylig, B. thuringiensis har været rapporteret til at være fundet i fødevarer som mælk, frisk frugt og korn, som har været dyrket og høstet fra jorden uden for landet., Forbruget af rå og minimalt forarbejdede grøntsager betragtes som naturligt og sundt, men der er rejst bekymring for resterende kemiske pesticider i friske grøntsager (Chiu et al., 2016). Således, at forbrugerne har vendt deres interesse for økologiske grøntsager (kemiske gratis grøntsager), og det forventes, at bio-pesticider, herunder B. thuringiensis, tegner sig for 20% af verdens pesticider marked inden 2020 som en erstatning for kemiske pesticider (Watt og Williamson, 2015)., I denne undersøgelse blev præstationen af realtids-PCR-målretningen targetingre evalueret med 3 slags kunstigt forurenede fødevareprøver (salat, kimbap og spinat). Friske natten over kulturer af B. thuringiensis blev inokuleret i hver fødevareprøve. Real-time PCR-kunne afsløre B. thuringiensis i en koncentration på 4,8 × 103, 3.4 × 103, og 1,5 × 103 CFU/g i salat, kimbap og spinat, henholdsvis (Figur 3). For kimbap-prøver var Ct-værdierne imidlertid højere, da det normalt indeholder mere komplekse materialer såsom pølse, æg eller gulerod sammenlignet med grøntsagerne.,

Konklusion

Da B. cereus-gruppen er meget ens i biokemiske og genetiske profiler, en ny biomarkør blev udviklet til at identificere og skelne B. thuringiensis fra den nært beslægtede gruppe. Ydeevnen FORRERE blev sammenlignet med cry2-genet, og kunstigt forurenede prøver blev også testet. Sammenlignet med cry2 blev genere-genet observeret at være effektivt nøjagtigt ved identifikation af B. thuringiensis. Yderligere, den udviklede realtids-PCR ved hjælp af B.re identificerede med succes B., thuringiensis og det kunne bruges til at kvantificere cellenumre med den genererede standardkurve.

Forfatter Bidrag

Finansiering

Denne forskning blev støttet af Ministeriet for Landbrug, Fødevarer og Drug Safety (Grant Nej 14162MFDS085) i Republikken Korea og Kangwon National University i 2015. S.var taknemmelig for den økonomiske støtte fra China Scholarship Council (CSC no: 201408260054). Forfatterne vil gerne takke Hyun-Ah Lee på Central Laboratory of the Kang .on National University for den tekniske support., RC er taknemmelig for den økonomiske støtte fra National Research Foundation of Korea (NRF) 2018007551.

Erklæring om interessekonflikt

forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Supplerende Materiale