Grænser i Pædiatri

Indledning

Posterior urethral ventiler (PUV) er den mest almindelige medfødte årsag til pædiatrisk blæreobstruktion (1). Mens dødeligheden fra PUV er forbedret markant med moderne medicinsk behandling, er obstruktiv uropati stadig en betydelig kilde til sygelighed i voksen alder (2). Op til 80% af børn med PUV viser symptomer på inkontinens og urinvejsinfektioner (3)., Desuden vil op til 50% af børn med PUV udvikle nyresvigt, med obstruktiv uropati den mest almindelige medfødte årsag til nyretransplantation (4). De obstruktive ventilblade behandles kirurgisk kort efter fødslen; dog vil børn med PUV udvikle variation i urinblærefunktion i hele deres liv. Det er blevet påvist, at blæreforringelse ofte forekommer efter puberteten, med et stigende behov for ren intermitterende kateterisering (5).

undersøgelser, der anvender forskellige dyremodeller, har vist, at blæren er hormonfølsom., Specifikt har testosteronudskiftning vist sig at øge glat muskelmasse og glat muskel til kollagenforhold i orchiektomiserede rotter (6). En model af delvis blæreudløbsobstruktion hos hanmus blev undersøgt og vist at producere blæredetrusor muskelhypertrofi (7). Testosteron har vist sig at øge detrusorfibrose som reaktion på iskæmi–reperfusionsskade hos kastrerede kaniner (8). Men til dato er effekten af hormonelle manipulationer på hanmusblærens reaktion på skade produceret af obstruktion endnu ikke undersøgt., Derfor antager vi, at testosteron deltager i de maladaptive fibrotiske ændringer, der opstår efter blæreudløbsobstruktion.

materialer og metoder

Murine Partial blære Outlet Obstruction Model

alle kirurgiske procedurer blev godkendt af Animal Care and Use Committee of Stanley manne Children ‘ s Research Institute. Otte-til ti-ugers CD1 hanmus (Charles River Labs, Chicago, IL, USA) blev anbragt i separate bure for at undgå ændringer i testosteronniveauet forårsaget af gruppeboliger. Mus blev bedøvet med 3% isofluran og placeret liggende., Underlivet blev barberet og forberedt med providon-jodopløsning. Efter at have sikret tilfredsstillende induktion af anæstesi blev der foretaget en midterlinie i nedre abdominal hudindsnit og ført ned gennem mavevæggen. Blæreudløbsobstruktion blev udført på en måde, der ligner en tidligere rapport, men med nogle forskelle (delvis obstruktion eller PO-gruppe) (7). Bemærk, at delvis obstruktion typisk omtales som “pBOO,” imidlertid, vi vil henvise til kirurgi og eksperimentel gruppe som PO., Med opadgående trækkraft på blæren blev stump dissektion omkring blærehalsen (proksimal til prostata hos hanmus) udført, mens blæren lejlighedsvis trækkes tilbage caudalt for at sikre dissektion for at være foran urinlederne. En 7-0 polypropylensutur blev derefter ført rundt om blærehalsen og bundet ned over en 23-gauge nål placeret ved siden af urinrøret. Nålen blev derefter fjernet., Hvis Handyr skulle kastreres (kastreret partiel obstruktion eller CPO), blev testiklerne samtidig bragt ud af abdominal snit, de spermatiske ledninger ligeret med 6-0 polypropylensuturer og skarpt opdelt. Mavevæggen og huden blev derefter lukket separat med 5-0 polyglactin-suturer på en afbrudt måde. Sham dyr gennemgik en identisk procedure op til blæremobiliseringspunktet. Dyrene fik lov til at komme sig, forudsat at carprofen blev opløst i drikkevand og ofret efter 1 eller 4 uger efter funktionsundersøgelser beskrevet nedenfor., Efter ofring ved dislokation af cervikale rygsøjler under isofluranbedøvelse blev dyr vejet, og blærer blev dissekeret ud på ligaturniveauet. Hver blære blev tømt for urin og derefter vejet separat for 12 sham, 17 PO, 11 CPO og 11 CPOT mus.

Testosteron Administration

Testosteron cypionate blev administreret til kastrere, delvist blokeret gruppe ved kastration og ugentlige postoperativt ved dosis på 10 mg/kg (kastrere delvis obstruktion testosteron eller CPOT gruppe)., For mus, der fik testosteronudskiftning, blev blod trukket på ofringstidspunktet og sendt til kommerciel testosteronanalyse for at sikre, at de modtog tilstrækkelig erstatning (Antech Diagnostics, Irvine, CA, USA).

Voiding plet på papir (VSOP)

VSOP blev udført om morgenen efter postoperative dage 1, 7 og 28 for hver mus. Mus blev opretholdt i metaboliske celler med underliggende filterhatman-filterpapir i 2 timer og fik ubegrænset adgang til mad og vand. Filterpapirark blev afbildet., Antal og mønster af hulrum blev noteret, og området for hver ugyldige plet blev målt ved hjælp af ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Ved hjælp af en standardkurve skabt af udtømning af pletter fra kendte mængder urin, blev pletområdet omdannet til ugyldigt volumen. Ma.annulleret volumen blev analyseret.

histologisk analyse

blærer blev fikseret i 10% (w / v) formalin (Sigma) i 24 timer, indlejret i paraffin og skåret på tværs med blærehalsen orienteret ned for at producere 4 µm sektioner. Sektioner fra 4 sham, 4 PO, 4 CPO og 4 CPOT mus blev farvet med Massons trichrome., Sektioner blev afbildet ved 10 magn og 40.forstørrelse ved hjælp af et Leica opretstående mikroskop forbundet til et kamera, og billeder blev gemt digitalt ved hjælp af OpenLab til Mac. Col / SM-forholdet blev kvantificeret ved anvendelse af Adobe Photoshop som tidligere beskrevet og i gennemsnit fra fire 40 sections sektioner pr. Til immunfarvning blev blærer fikseret i 4% (w/v) formaldehyd fremstillet af paraformaldehyd (EM Sciences) natten over. Vævet blev vasket i DPBS og ækvilibreret sekventielt i 20% (w/v) og 30% (sucrose/v) saccharose (Sigma) i DPBS., Væv blev frosset i skræl-væk forme indeholdende oktober (Tissue Tech) i en tøris isopentan (Sigma) bad.

Immunofluorescensantistoffer

faste blærer fra 3 sham, 3 PO, 3 CPO og 3 CPOT mus blev udnyttet. Sektioner på 10 µm fra blev skåret til alle forsøg. Afsnit blev vasket to gange i PBS, der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur i PBS + 0.1% Tween (PBT), og blokerede for 30 min ved stuetemperatur med 10% æsel serum i PBT., Glat muskel myosin (SMM) blev fundet på samme måde med kanin anti-glat muskel myosin (Biomedicinske Teknologier, 1:100) i forbindelse med Alexa Fluor 546 æsel anti-kanin sekundært antistof (Life Technologies, 1:400).

statistisk analyse

grupper blev sammenlignet ved anvendelse af ANOVA med post hoc Student–ne .man–Keuls-analyse. Resultater med p < 0, 05 blev betragtet som signifikante. SPSS v22. 0 blev anvendt til statistisk analyse. Fejlbjælker i tal afspejler SEM.,

Resultater

PO Fører til Funktionelle Ændringer Bestemmes ved Urodynamiske Undersøgelser og Tømme Plet på Papiret

Delvis blæreobstruktion blev udført på mandlige CD-1-mus og i forhold til to grupper: mand eller mus, der gennemgår sham operation og mandlige mus, der gennemgår delvis blæreobstruktion med kastration. Vi målte serumtestosteronniveauer i kastrerede mus og fandt, at niveauerne faldt til (<20 PG/dL) inden for 24 timer efter orchiektomi., Virkningerne af obstruktion på blærefunktionen blev bestemt ved anvendelse af urodynamiske undersøgelser i disse tre grupper. Figur 1A demonstrerer forhøjet Peak tømme tryk 1 uge efter obstruktion i PO og CPO mus sammenlignet med sham kirurgi mus. Repræsentative urodynamiske sporinger demonstrerer også ustabilitet efter 1 uge i PO – og CPO-mus (figur 1C). VSOP udført ved 1 uge efter obstruktion afspejler effekten af obstruktion på PO-og CPO-mus,der ikke ses i sham surgery-mus (figur 1B, d)., Således havde vores PO-model betydelige funktionelle effekter på micturition hos både PO-og CPO-mus 1 uge efter operationen.

selvom obstruktion i CPO-mus blev påvist efter 1 uge, blev virkningerne af obstruktion løst med 4 uger. VSOP udført 4 uger efter obstruktion demonstrerer, at PO-mus har vedvarende obstruktiv ugyldighedsmønstre med mindre maksimale ugyldige mængder end CPO-mus. På samme tidspunkt genvinder CPO-mus maksimale ugyldige volumener svarende til sham surgery–mus (figur 3A-C)., Det overordnede mønster på VSOP af CPO-mus er vendt tilbage til det normale, mens PO-mus fortsat demonstrerer indiskret sprøjtning af urin, hvilket indikerer tab af blærekontrol.

Blæreomdannelse efter PO ændres ved kastration

Vi fandt, at effekter på blærefunktion var korreleret med makroskopiske ændringer i museblæren på PO-og CPO-mus. På det tidspunkt, hvor musen blev ofret 4 uger efter PO, syntes shamblærer normale i størrelse,men PO–og CPO-blæren blev groft forstørret (figur 2A, C-E)., Efter dissektion af blæren distalt til blærehalsens ligatur blev blærer udtrykt af urin og vejet. Her fandt vi øget blærevægt i PO-musene sammenlignet med både sham-kirurgi og CPO-mus. CPO-mus viste ikke øget vægt i sammenligning med sham surgery-mus (figur 2B). Histologiske vurdering af blærer af disse mus var udføres med H&E farvning og blære areal, omkreds, og tykkelse blev sammenlignet., Både CPO-og PO-mus demonstrerede øget område og omkreds sammenlignet med sham-kirurgiske mus, hvilket afspejler ændringer fra forhøjet blæretryk efter PO (figur 2F,h). Imidlertid blev øget blæretykkelse kun set hos PO-mus (figur 2G). Dette korrelerede med de nedre blærevægte i CPO-mus, hvilket antyder, at stigningen i blærestørrelse primært skyldes “strækning” af blæremusklen i modsætning til ægte blæremuskelhypertrofi eller hyperplasi.

Blære Fibrose Øger følgende Delvis blæreobstruktion

for at undersøge, om den stigning i blæren masse og blære vægtykkelse skyldtes udelukkende muskel hypertrofi/hyperplasi eller hvis en komponent af fibrose var involveret, histologiske undersøgelse af humbug, PO, og CPO mus blærer blev udført på 4 uger efter obstruktion. Dette blev gjort ved hjælp af både Masson trichrome farvning samt fibrose markør-specifik immunofluorescens (figur 4)., Som forventet viste blærerne i PO-mus efter obstruktion at have øget col / SM-forhold. Ved kastration blev det øgede col/sm-forhold ikke længere fundet (figur 4B). Selvom Luminal blærevolumen blev forøget i CPO-mus, demonstrerede muskellaget ikke hypertrofi, hvilket fremgår af at have den samme blærevægtykkelse som sham surgery-mus. Endvidere viste evaluering af fibrosespecifikke markører Vimentin, Col1a1 og FSP-1 ved immunofluorescens øget ekspression i PO-mus sammenlignet med sham-mus med et tilsvarende fald i ekspression i CPO-mus., Det fremgår, at kastration skaber betingelser, hvor ikke-fibrotisk blære remodeling opstår, argumenterer for en potentiel rolle Testosteron specifikt i at formidle en fibrotisk reaktion på blære skade.

Indførelsen af Udefrakommende Testosteron Vender de Gavnlige Virkninger af Kastration efter Delvis blæreobstruktion

Vi har vist, at kastration i fastsættelsen af PO vil dæmpe den post-obstruktiv remodeling med hensyn til at blære hypertrofi/hyperplasi og fibrose. For at demonstrere, at dette er et testosteronspecifikt svar, efter kastration, gennemgik en kohorte af mus PO-og testosterontilskud. Her brugte vi enten testosteron eller dets reducerede produkt dihydrotestosteron (DHT)., DHT har 10 gange affiniteten for androgenreceptoren sammenlignet med testosteron og kan ikke aromatiseres til østrogen, hvilket reducerer sandsynligheden for, at de ændringer, der opstår fra testosterontilskud, skyldes stigende østrogenniveauer. Antal annulleret mængder, som bestemmes af VSOP var væsentligt lavere i CPO plus testosteron (CPOT) eller CPO plus DHT (CPOD) mus sammenlignet med CPO mus (Figur 5A). Makroskopiske og mikroskopiske ændringer set hos PO-mus (men ikke CPO-mus) dukkede op igen i CPOT-og CPOD-blærer., Blærevægtene blev signifikant forøget i CPOT-og CPOD-mus sammenlignet med CPO-mus (figur 5B). CPOT-og CPOD-blærer havde også øget col / SM-forhold sammenlignet med CPO (figur 5D). Fibrose markører blev også øget i CPOT og CPOD sammenlignet med CPO blærer som var reaktion på Massons trichrome plet (figur 5C,E). Disse resultater viser, at eksogen udskiftning af testosteron i kastrerede hanmus fuldt restaureret de patologiske virkninger af obstruktion til urinblæren., Sammenfattende understøtter virkningerne af kastration og testosteronudskiftning stærkt en rolle for mandlig androgen i patogenesen af blæreobstruktion.figur 5

Diskussion

drenge født med PUV gennemgår kirurgisk resektion af de obstruktive foldere kort efter fødslen. På trods af lindring af blæreudløbshindringen hos disse børn udvikler mange patienter med PUV sig til blæreforringelse, der kræver ren intermitterende kateterisering for at tømme blæren tilstrækkeligt (3). Disse ændringer blev ofte set efter puberteten., De kliniske ændringer hos patienter med resekterede ventiler blev tidligere tilskrevet fysiologiske ændringer forbundet med ungdom, såsom øget urinfiltrering og ikke til hormonelle ændringer (1, 5, 9). Men vores resultater tyder på, at androgen kan spille en vigtigere rolle end tidligere værdsat. Vi finder ud af, at tilstedeværelsen eller fraværet af androgen specifikt påvirker de cellulære ændringer, der opstår efter obstruktion, især fibrose.,

oplysninger fra undersøgelser, hvor testosteron blev suppleret hos patienter med nedre urinvejssygdom, kan give indsigt i virkningen af androgen på blæresygdom. Disse data er relativt sparsomme, kommer stort set fra retrospektive eller potentielle observationsstudier og undersøgelser, hvor testosteron blev administreret til hypogonadale eller eugonadale mænd. Disse undersøgelser tyder imidlertid på, at testosterontilskud ikke forværrer LUTS (10, 11)., Især flere undersøgelser har påvist en forbedring i IPSS resultat i mænd, der modtager androgen tilskud, selvom mange af disse ikke specifikt undersøgelse mænd med kendt blæreobstruktion, men snarere inddrage en kohorte behandles med testosteron tilskud, og der varierende grader af LUTS ved baseline. En undersøgelse udelukkede de patienter med kendt blærehalsobstruktion. Koritsiadis et al., gjorde specielt sammenligne symptomer og urodynamiske parametre på tryk-flow undersøgelser af hypogonadale og eugonadal mænd og fundet serum testosteron niveau til at være negativt korreleret med detrusor pres på max flow, men ikke IPSS eller andre urodynamiske parametre (12).

effekten af testosteron på blæredetrusormuskel er også undersøgt i dyremodeller. Tek og kolleger fandt, at testosterontilskud af kirurgisk kastrerede rotter resulterede i et nedsat forhold mellem kollagen og glat muskel og øget cystometrisk kapacitet (13). Shortliffe et al., (14) fandt, at testosteronudskiftning i kirurgisk kastrerede rotter også var forbundet med øget blære glat muskel samt øget blære masse (14). Sammen viser disse undersøgelser, at testosteron i uhindrede rotter stimulerer detrusor glat muskelvækst gennem en stadig uklar mekanisme. I en iskæmi-reperfusion blæreskade model hos mandlige kaniner, Chuang et al. viste, at kastration var beskyttende ved faldende blærefibrose og nedsat ekspression af forskellige fibrose-relaterede markører (8)., Testosterontilskud af disse kastrerede kaniner førte til øget detrusorfibrose efter blæreskade. Vores fund afspejler disse fund og repræsenterer den første undersøgelse af testosterons virkning på responsen på blæreskade fra PO hos unge mus.

samtidig gjorde manglen på fund i litteraturen os overrasket over vores oprindelige fund. En potentiel bekymring, vi havde, var, at musene ikke var tilstrækkeligt hindrede, og at vores fund i kastrerede mus repræsenterede en gruppe, hvor obstruktion simpelthen ikke forekom., I sidste ende ved vi, at dette ikke er sandt, fordi blærer i CPO-gruppen oprindeligt havde udtørrede pletter som den hindrede gruppe, havde unormalt tryk ved cystometri og havde ombyggede blærer. Faktisk var blærerne fra CPO-mus meget forskellige end shams, hvilket indikerede, at PO-operationen gav dybe effekter. Vores fortolkning af disse resultater er, at i timerne efter operation, trykket stiger i blærevæggen, og at der i normale mus, collagener og andre afstivning matricer er konstrueret til at forhindre brud af blæren i maven., Blærer fra CPO-mus havde meget lidt aflejring af kollagen i detrusormusklen, men blev samtidig meget store med tynde vægge. Det er muligt, at når det fibrotiske respons er nedsat i en højtryksblære, strækker den sig for at rumme den urin, der akkumuleres. Dette er typisk for det, vi observerede i CPO, men ikke PO-og CPOT-blærer. Således antager vi, at testosterons rolle specifikt kan være at formidle fibrose i blærevæggen.,

Mens vores arbejde specifikt anvendes en blære-modellen til at bestemme den rolle testosteron på muskel fibrose i svar til glat muskel skade, vi mener, at denne forskning vil vise sig at være vigtigt i mange fibrøse sygdom processer, der har et køn forening. Faktisk er dette blevet understøttet af et par undersøgelser i litteraturen. Cho et al. påvist, at orchiektomi svækkede renal fibrose set efter ureteral obstruktion. I en musemodel af ensidig ureteral obstruktion viste nyrer fra hanmus øget ekspression af alfa-SMA og kollagenaflejring (15)., I lighed med vores blæremodel af obstruktion blev denne fibrotiske respons minimeret, hvis samtidig orchiektomi blev udført med ureteral obstruktion. Analoge fund blev rapporteret i en musemodel af hjertefibrose sekundært til overbelastning af tryk. Her blev fibrotiske ændringer i venstre ventrikel svækket af orchiektomi. Dette omfattede en blunting af tgfß-signalvejen, der vides at være vigtig for at fremme myofibroblastdifferentiering (16). Aldersrelateret hjerte-og renal fibrose blev også svækket ved orchiektomi hos hanmus (17)., I en undersøgelse foretaget af andhu og kolleger blev androgenreceptoren på vaskulære glatte muskelceller impliceret i testosteronstimuleret glat muskelforkalkning. Ved hjælp af en vaskulær glat muskelceller afledt af en glat muskel-specifik androgenreceptor knockout mus, forkalkning blev afstumpet som reaktion på testosteronbehandling sammenlignet med vilde type glatte muskelceller (18). Således finder et stigende antal undersøgelser, herunder vores, en sammenhæng mellem testosteron og de patologiske ændringer forbundet med fibrose.,

mekanismen bag testosterons rolle i modulering af detrusorresponsen på skade forbliver uforklarlig. Yderligere arbejde med at undersøge do .nstream virkningerne af testosteron i detrusor muskel kunne afsløre nye terapeutiske mål, der kunne udnyttes til at forhindre eller i det mindste forbedre den negative væv remodeling set i indstillingen af PO. Derudover, dosis-respons undersøgelser kunne udføres for at bestemme, ved hvilke serumkoncentrationer af testosteron føre til negativ remodeling. Østrogen har vist sig at dæmpe vævshypo .i og tilhørende detrusorskade i dyremodeller., Yderligere undersøgelse af samspillet mellem testosteron og østrogen i modulering af detrusor muskelrespons på skade kan også bidrage til yderligere at belyse denne vej.

konklusion

Juvenile hanmus med delvis blæreudløbshindring har mindre højtryksblærer, der er fibrotiske. Kastration var forbundet med større hulrumsvolumener, lavere blærevægt og mindre detrusorfibrose. Udskiftning af testosteron i kastratmus vendte disse virkninger., Dette indikerer, at testosteron spiller en rolle i ændring af ændringer i detrusormuskel efter delvis blæreudløbsobstruktion hos mus. Således foreslår vi, at øgede niveauer af testosteron hos drenge med PUV kan bidrage til nedsat blærefunktion.

etisk Erklæring

denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra kirurgiske retningslinjer, dyrepleje og Brugsudvalg. Protokollen blev godkendt af Udvalget for dyrepleje og-anvendelse.

Forfatterbidrag

af -, PF -, DB -, NK-og GS-dataindsamling og-analyse., Af, PF, RD og f.eks. undfangelse, design og manuskriptskrivning.

Erklæring om interessekonflikt

forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

finansiering

denne forskning blev støttet af finansiering fra Hart .ell Association til EG.