Integral membranproteiner
Integral membranproteiner (Imp) fungerer som Gate .ays til celler. Alle celler og organeller er indkapslet i et uigennemtrængeligt lipid-dobbeltlag, og de IMPs, vi studerer, er indlejret i disse membraner. De er Ind-og udgangsveje for mange ioner, næringsstoffer, affaldsprodukter, hormoner, stoffer og store molekyler som proteiner og DNA. De er også ansvarlige for meget af kommunikationen mellem celler og deres miljø., Celler kan fremstille et stort udvalg af disse proteiner, cirka 30% af generne i den humane genomkode for membranproteiner, og alligevel ved vi relativt lidt om disse molekyler.
membranproteiner er desværre notorisk vanskelige at håndtere og studere, da de er designet til at sidde i det hydrofobe miljø i lipid-dobbeltlaget. De har en tendens til at være ustabile, når de ekstraheres fra deres oprindelige miljø, og vi er nødt til at tilføje vaskemidler til at dække den hydrofobe overflade., For at forstå og kontrollere funktionen af disse proteiner er det vigtigt at have information om deres tredimensionelle struktur, som normalt opnås ved røntgenkrystallografi. Imidlertid har vanskeligheden ved at håndtere disse proteiner gjort det vanskeligt at løse strukturerne, og til dato er der færre end 300 strukturer af membranproteiner kendt, mindre end 0, 5% af alle de kendte strukturer. For højere eukaryoter er historien endnu mere skarp, med kun 20 strukturer af menneskelige IMPs og mindre end 50 Pattedyrsimps løst., Membranproteiner er derfor en af de vigtigste resterende grænser for strukturel biologiforskning. På SGC anvender vi nu vores avancerede high-throughput-metoder til at overvinde flaskehalse i membranproteinforskning, så vi pålideligt kan levere rene membranproteinprøver og strukturer af disse fascinerende og medicinsk kritiske molekyler.
medicinsk betydning
den medicinske betydning af denne enorme proteinfamilie kan ikke overvurderes., Mutationer i membranproteiner er involveret i mange almindelige sygdomme, herunder hjertesygdomme, hvor funktionsfejl ion kanaler er ofte impliceret. Narkotika målrettet til calciumkanaler kan kontrollere problemer som højt blodtryk og angina. Membranproteiner er involveret i kræft, hvor fejl i signalveje kan føre til, at celler deler sig ude af kontrol. Ofte er specifikke membranproteiner overproduceret i kræftceller og er derfor mål for lægemiddelterapi. Sygdomme i hjernen som migræne, depression og Al .heimers er alle forbundet med problemer med transportører og kanaler., Cystisk fibrose er forårsaget af mutationer i cystisk fibrose transmembrane conductance regulator (CFTR) gen, som koder for en chloridionkanal.
da mange membranproteiner sidder ved overfladen af celler, er de let tilgængelige for små molekyler, der cirkulerer i blodet. Det er derfor ikke overraskende, at over 50% af små molekyler binder til membranproteiner. G-proteinkoblede receptorer og kanaler er især vigtige i denne henseende, men ABC-transportører og opløste bærere er også mål for lægemiddelterapi., Vores forståelse af mange andre sygdomme og vores evne til at behandle disse sygdomme ville drage stor fordel af mere strukturelle og funktionelle oplysninger om de involverede proteiner. Vi håber, at vi ved at løse strukturerne i disse proteiner, forstå den underliggende biokemi og interaktioner med substrater og hæmmere, kan tilbyde mere effektive behandlinger for mange sygdomme.
SGC-og integrale membranproteiner
SGC har stor erfaring med at løse strukturer af opløselige humane proteiner ved hjælp af meget effektive systemer med høj gennemstrømning., I de sidste to år har vi tilpasset disse metoder til at løse strukturer for humane membranproteiner. Vi har screenet 186 humane membranproteiner fra forskellige familier ved at vælge en række konstruktioner til hvert protein, identificere egnede rengøringsmidler til rensning og derefter opskalere purificaiton og krystallisere disse proteiner. Vi har krystalliseret 3 membranproteiner og løst vores første struktur, en proces, der tog mindre end to år fra første klon til struktur.,
Vi har løst den første struktur af et menneskeligt ABC transporter, en klasse af proteiner, som er involveret i det lille molekyle transport, multi-resistens og sygdomme såsom cystisk fibrose og diabetes. Vores første succesfulde mål er den menneskelige mitokondrie ABC transporter, ABCB10, som er indlejret i den indre membran af mitokondrier. ABCB10 er overudtrykt under erythroid differentiering, den proces, der danner røde blodlegemer. det er overudtrykt i knoglemarv, hjerte og lever., Der er nu tegn på, at når ABCB10-ekspression reduceres i celler, er de mere modtagelige for O .idativ stress, og at ABCB10 kan være involveret i at beskytte hjertet under et hjerteanfald.
teknologier til undersøgelse af IMP
Vi udvikler generiske metoder, der muliggør bestemmelse af høj gennemstrømning af strukturer af humane membranproteiner. Vi valgte baculovirus / insektcelleudtrykssystem, der giver en lipidsammensætning tæt på humane celler og er en gennemprøvet platform med høj gennemstrømning., For hvert målprotein genererer vi en række konstruktioner af forskellig længde og forskellige affinitetsmærker, inklusive genet i fuld længde og en række trunkeringer for at fjerne potentielt uordnede regioner. En high throughput udtryk skærm bruges til at identificere proteiner, der kan bruges til at rense milligram mængder af IMP til krystallisering. Hvert protein renses oprindeligt i dodecyl maltosid (DDM) vaskemiddel og screenes efterfølgende for stabilitet i en række forskellige vaskemidler for at identificere de optimale betingelser for stabilitet og krystallisering.,
Vi har etableret metoder til nanodrop-krystallisering med høj gennemstrømning og manipulation af skrøbelige membranproteinkrystaller. Vi har udviklet effektive systemer til screening af membranproteinkrystaller for diffraktionskvalitet som metode til krystallisering af konditonoptimering. Vi har også optimeret vores dataindsamling og analyse af diffraktionsdata ved hjælp af intense synchrotron microfocus beamlines, der er tilgængelige på ressourcer som Diamond lyskilde Ltd, I O .fordshire., Hvor det er muligt, udføres krystallisering med bundne ligander og hæmmere for at fange en enkelt indfødt konformation og give nøgleindsigt i funktion og lægemiddeldesign. Vi planlægger også at generere antistoffragmenter mod vores rensede proteiner til brug som affinitetsreagenser og krystallisationshjælpemidler.
Skriv et svar