Dyr og kostvaner
Han C57BL/6 J mus (4 uger gamle, n = 80) blev købt fra Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (Licens Nr. SC JK: JING2009-0007) og anbragt i et temperaturstyret rum (22 2 2 C C, 40% til 60% fugtighed) med en 12-h lys/mørk cyklus., Animal Care and Use Committee for det kinesiske PLA General Hospital godkendte alle eksperimentelle procedurer.
mus blev fodret med en basal diæt (Ain-93G diæt, købt fra Academy of Military Medical Science) i løbet af den første uge til tilpasning. Ti mus blev tilfældigt valgt og fodret med en basal diæt som den normale kontrol, og de resterende mus blev fodret med en kolesterolrig (CR) diæt modificeret fra Ain-96G-kosten. Blodprøver blev indsamlet fra den mandibulære venøse ple .us to uger senere., Mus med serum-TC-niveauer, der var 2 standardafvigelser større end den normale kontrol (svarende til 67% af mus, der fodrede CR-diætet), blev tilfældigt tildelt tre grupper (n = 12 i hver gruppe). Hver gruppe blev fodret med en anden kost til 16 uger (Tabel 1): kolesterol-rige og medium-kæde-triglycerid (CR-MCT), kolesterol-rige og langkædede triglycerider (CR-LCT) eller CR. Nisshin Oillio (Tokyo, Japan) donerede MCT ‘erne (C8:0 og C10:0) og LCT’ erne (langkædede triglycerider, sojabønneolie). Kolesterol blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)., Beijing Institute of Nutrition Resources (Beijing, Kina) målte fedtsyresammensætningerne af CR-MCT og CR-LCT diæter (tabel 2). Kropsvægt og fødeindtagelse blev overvåget ugentligt.,
prøveudtagning af blod, ileum, galde og fæces
fem mus blev valgt tilfældigt fra hver gruppe efter 16 ugers fodring for at registrere diætindtagelse og udskillelse af fæces ved hjælp af separate metaboliske celler i 3 dage., Fæces blev lyofiliseret, vejet, pulveriseret og opbevaret ved − 80 C C til yderligere analyse. 12 timer) før blodprøveudtagning fra aorta ventralis under anæstesi (hydrochlorideyla .inhydrochlorid). Serum blev opsamlet efter centrifugering af blodprøverne. En mikrokapsel blev brugt til at punktere galdeblærevæggen og udtrække galden, og hver galdeprøve blev centrifugeret ved 16.000 g i 30 minutter. Supernatanten blev opsamlet og opbevaret ved-80 C. C., Ileumvæv blev udskåret og skyllet med iskold saltvand, og dele blev straks opbevaret ved-80.C til yderligere analyse.
Måling af serum lipid profiler
Serum TC og triglycerid (TG) blev bestemt ved afslutningen af forsøget ved hjælp af kommercielle kits fra Wako (Osaka, Japan). High-density lipoprotein kolesterol (HDL-C) og low-density lipoprotein kolesterol (LDL-C) blev målt ved hjælp af sediment metoder og et kommercielt kit fra Abcam (Cambridge, UK). Serum total galdesyre (TBA) blev målt ved hjælp af et kommercielt kit fra Blue Gene (Shanghai, Kina)., Alle producentens anvisninger blev nøje fulgt.
Analyse af galdesyrer i fæces og galde hjælp af HPLC-MS
De metoder til udarbejdelse og fastlæggelse af galdesyrer i fæces og galde, der blev udført i henhold til vores tidligere undersøgelse og rapporter fra Steiner et al. . En Shimadzu LC-20 AD high-performance liquid chromatography system (Shimadzu, Kyoto, Japan) koblet til en Anvendt Biosystecm 3200 Q TRAP mass spectrometer med en electrospray ionisering (ESI) kilde (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) blev anvendt. HPLC-og MS-systemerne blev kontrolleret ved hjælp af Analyst 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Ovennævnte materialer blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Primære galdesyrer, herunder CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA og GCDCA, og sekundære galdesyrer, herunder KYSTDIREKTORATET, LCA, UDCA, TLCA, TDCA og GDCA, i galde og fæces var bestemt af lagringsperioden.
kvantitativ realtids-PCR (100rt-PCR)
prøver fra tyndtarmsvæv (cirka 100 mg) blev vasket med iskold PBS og homogeniseret. Totalt RNA fra væv og celler blev isoleret under anvendelse af Tri .olreagens (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, nr. R6812). Primere blev designet ved hjælp af Primer e .press 3.,0-software er baseret på mRNA sekvenser fra en database (Tabel 3) og syntetiseret af Invitrogen (Beijing, Kina). Metoder til RNA-ekstraktion og kvantitativ realtids-PCR (PCRRT-PCR) er beskrevet i vores tidligere publikationer. qRT-PCR blev udført under anvendelse af et SYBR Prim PrimeScript Prim RT-PCR Kit (Takara Biotechnology Co ., Ltd., Dalian, Kina). Amplifikation blev udført ved anvendelse af en BIO-RAD Icycler termisk Cykler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Relative mRNA-ekspressionsniveauer blev bestemt ved hjælp af CT-metoden (comparative critical threshold) (i et separat rør)., Husholdnings-genet β-actin blev brugt som kontrol til normalisering.
Westernestern blot-assay
analysesestern blot-analyser af tyndtarmsvæv og dyrkede celler blev udført som tidligere beskrevet . Ækvivalente mængder protein fra hver prøve blev fremstillet og adskilt under anvendelse af SDS-PAGE (12% geler) efterfulgt af elektrooverførsel til PVDF-membraner., Membraner blev inkuberet med blokerende opløsning (Tris-buffered saltvand, 8% fedtfri tørmælk) i 2 timer efterfulgt af inkubation med specifikke antistoffer ved 4.C natten over. Membraner blev vasket grundigt i TBST (Tris-buffered saline med Tween, der indeholder 0,5% Tween-20 i TBS) og inkuberes med peberrod peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer i TBST i 1 time. Membraner blev vasket yderligere i TBST, og bands der blev fundet, ved hjælp af chemiluminescence opdagelse agenter. Blot densitometri blev udført, og båndene blev analyseret ved hjælp af ImageJ soft .are., Antistoffer rettet mod den apikale natrium-afhængige galdesyre transportør (ASBT), ileal galdesyre-bindende protein (jeg-BABP) og opløst organisk transporter α/β (Osta/β) blev købt fra Abcam (Cambridge, UK). Sekundære antistoffer mod ged IgG blev opnået fra Sun Biomedical Technology Co. (Beijing, Kina).
immunofluorescens
Ileumvæv fastgjort med 4% bufret paraformaldehyd blev indlejret i paraffin, og 4-µm tykke sektioner blev fremstillet. Sektioner blev afparaffiniseret og slukket i 3% H2O2 i 15 minutter for at blokere endogen pero .idase., Afsnit blev vasket i PBS og inkuberes med en anti-jeg-BABP antistof i PBS (1:50 fortynding) i 1 time ved 37 °C. EN FITC-konjugeret (fluorescein phycoerythrin) antistof, der blev tilføjet på en 1:50 fortynding og inkuberes i 0,5 time ved 37 °C. Sektioner blev vasket, og PI (propidium iodid) blev brugt til farvning af kerner. I-BABP blev afbildet ved hjælp af et fluorescensmikroskop (B .60, Olympus, Ina, Japan). I-BABP blev observeret som grøn fluorescens, og kernen blev observeret som rød fluorescens .,
Caco-2 cellekultur
Caco-2-cellelinjen blev opnået fra Cell Resource Center, Peking Union Medical College (som er hovedkvarteret for den nationale infrastruktur for Cellelinjeressource) den Sept. 20, 2016. PCR og kultur bekræftede, at cellelinjen blev kontrolleret fri for mycoplasma-kontaminering. Artens oprindelse af disse celler blev bekræftet ved anvendelse af PCR. Identiteten af cellelinjen blev autentificeret ved hjælp af STR-profilering (FBI, CODIS) . Alle resultaterne er tilgængelige på hjemmesiden (http://cellresource.cn)., Caco-2-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin og 1% ikke-essentielle aminosyrer. Caco-2-celler blev opretholdt ved 37.C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 og 95% luft. Mediet blev ændret hver 2. dag. Den DMEM, FBS, 1% ikke-essentielle aminosyrer, og andre materialer, som blev købt fra den Nationale Infrastruktur for Celle-Line Ressource (Beijing, Kina) eller Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).,
caprylsyrepermeabilitetsanalyse gennem Caco-2-cellemonolag
til galdesyrerabsorptionsforsøg, der henviser til rapporten fra Y. .ang, et al. blev celler podet og dyrket på Millicell hængende Cellekulturindsatser (0, 4 µm, Millipore, Molsheim, Frankrig) i 21 dage for at opnå sammenflydende og stærkt differentierede cellemonolag. Dannelsen af funktionelle epithelial monolag blev overvåget via måling af transepithelial elektrisk modstand (TEER) ved hjælp af en Millicell-ERS meter (Milipore) forud for eksperimenter., Cellulær morfologi blev observeret ved anvendelse af et elektronmikroskop, og permeabilitet blev bestemt ved anvendelse af Lucifer Yello. (Sigma, MO, USA) som markør.
præparatet af fedtsyrer og CA blev udført som beskrevet af.. .hang, et al. . Fedtsyrer og CA blev målt, og opløst i ethanol, så blev fortyndet med dyrkningssubstrat, der indeholder 20 mg/L endotoxin-gratis BSA til en endelig koncentration på 50, 100 eller 200 μ mol/L (ethanol< 0.1%). De opløste fedtsyrer og CA blev inkuberet i et vandbad ved 37 C C i 1 time før tilsætning til cellerne., Caprylsyre (C8:0), caprinsyre (C10:0), stearinsyre (C18:0) og oliesyre (C18:1) blev købt hos Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
de apikale (AP) og basolaterale (BL) sider af monolaget blev vasket med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) og ækvilibreret i serumfrit komplet medium i 15 minutter. Mediet i AP blev erstattet med frisk medium-indeholder CA (200 µmmol/L) eller blandet med en af de fedtsyrer (C8:0, C10:0 C18:0 C18:1) ved 50, 100 eller 200 μ mol/L., Cellelevedygtighed af Caco-2-celler under forskellige betingelser blev vurderet ved cytst-1-cellecytotoksicitetstesten (Fig. 1). Mediet med en af fedtsyrerne blev defineret som”C8:0, C10:0, C18:0 eller C18: 1-gruppen”. “Kontrolgruppen” indeholdt ingen fedtsyrer, og” blindgruppen ” manglede CA og fedtsyrer. Kun frisk medium blev brugt i BL. Medierne fra AP-og BL-siderne blev fjernet 2 timer senere og opbevaret til analyser af CA ved hjælp af HPLC-MS., Den tilsyneladende permeabilitet (Papp) blev beregnet ved hjælp af følgende ligning: Papp = d./dt 1 1/C0A (D. er det sammensatte udseende i modtagerrummet, dt er tiden, C0 er koncentrationen i donorrummet, og A er indsatsens overfladeareal).
Cellelevedygtighed af Caco-2-celler under forskellige forhold., Cellernes levedygtighed procent = OD i eksperimentgruppen /OD i kontrolgruppen× 100%
jeg-BABP udtryk niveauer i Caco-2 celler
Caco-2 celler blev seeded til en 6-brønds plade (Corning, NY, amerikas forenede stater) og kultiveret til den samlede sammenløbet med høj differentiering for at bekræfte effekten af MCFAs på jeg-BABP . Dyrkningsmediet blev erstattet før forsøg med medium indeholdende delipidiseret FBS i 24 timer., Cellerne blev vasket med iskold phosphatbuffereret saltvand (PBS) og inkuberet med frisk medium indeholdende CA ved 200 µmol/L (defineret som CA-gruppe) eller CA blandet med en af fedtsyrerne (C8:0, C10:0, C18:0 eller C18:1) ved 200olmol/L (defineret som “C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA eller C18:1+CA-gruppen”) eller C8:0 eller C10:0 ved 200 µmol/l uden ca (defineret som “C8:0 gruppe og C10:0 gruppe”) i 24 timer. og blindgruppen var uden fedtsyrer og ca. Mediet blev fjernet, og cellerne blev vasket tre gange med iskold PBS., Total RNA og protein blev isoleret og opsamlet til yderligere analyser af i-BABP mRNA og proteinekspressionsniveauer.
statistisk analyse
alle data udtrykkes som middelværdi SD SD. Data blev analyseret ved hjælp af envejs variansanalyse efterfulgt af den uafhængige t-test for at bestemme betydningen af forskellen mellem grupper ved hjælp af SPSS-soft .areversion 17.0. P < 0, 05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Skriv et svar