Los anticuerpos son glicoproteínas de inmunoglobulina (Ig) producidas por células plasmáticas (células B) en respuesta a moléculas antigénicas extrañas (inmunógenos). La función principal de los anticuerpos es unirse específicamente a estos antígenos extraños para desactivarlos y/o marcarlos para su destrucción por el sistema inmune, protegiendo así al huésped de la infección. Hay varias clases de anticuerpos., La primera parte de este sumario se centra en los anticuerpos convencionales de tamaño completo, los anticuerpos de clase IgG e IgM, que se utilizan en gran medida en una multitud de aplicaciones biomédicas de investigación, diagnóstico y terapéuticas.
la unidad básica de un anticuerpo convencional es una unidad de cuatro polipéptidos que consta de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas unidas por enlaces disulfuro. Las cadenas ligeras son más cortas, con pesos moleculares más bajos que las cadenas pesadas., La forma general de un anticuerpo es una y, con una región de bisagra flexible (interdominio) en el Centro de la Y. la flexibilidad de la región de bisagra interdominio es importante para la Unión bivalente de un anticuerpo , permitiendo que las dos bolsas de unión interactúen con sitios antigénicos a distancias variables. Cada cadena de polipéptidos tiene una región constante, que no varía significativamente entre los anticuerpos, y una región variable, que es específica para cada anticuerpo en particular. La notación común para la región variable de la cadena ligera es VL y para la región constante de la cadena ligera es CL (Figura 1)., La notación es similar para la variable de cadena pesada (VH) y las regiones constantes (CH) con CH1, CH2 y CH3 que denotan los diferentes dominios de Región constantes de la cadena pesada. Los carbohidratos están normalmente Unidos a los dominios CH2 de las cadenas pesadas. La región cristalizable del fragmento (Fc) contiene solamente regiones constantes de las cadenas pesadas (CH), pero la región antígeno-obligatoria del fragmento (Fab) incluye un dominio constante y los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras (VH y CL). El fragmento variable región FV región contiene solo los dos dominios variables (Figura 1)., Ver anticuerpo de ratón para discusión sobre isotipos de inmunoglobulina, subclases, y el número de dominios de inmunoglobulina.
cada anticuerpo completo tiene dos bolsas de unión a antígenos, ubicadas en las regiones FV, y puede unirse a dos antígenos (Unión bivalente)., Sin embargo, si los dos antígenos están demasiado cerca (≤3 nm), o demasiado separados (≥29nm), el anticuerpo solo puede unirse a un antígeno (Unión monovalente) . Hay un cambio de afinidad significativo entre las fijaciones monovalentes y bivalentes con un cambio de 1.500 veces en los valores de Kd .
la estructura de anticuerpos específicos está disponible en la base de datos de anticuerpos estructurales (SAbDab), una base de datos curada de estructuras de anticuerpos disponibles públicamente, así como herramientas de modelado estructural, que se actualiza semanalmente desde el Banco de datos de proteínas (PDB) .,
los anticuerpos convencionales de tamaño completo se han utilizado en la investigación para la detección de proteínas a través de análisis de Western blot , inmunohistoquímica y ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) durante décadas. También se han desarrollado anticuerpos de tamaño completo para aplicaciones de diagnóstico como pruebas de embarazo y detección de bacterias y virus en la sangre, como un ELISA que detecta el VIH. Además, los anticuerpos convencionales de tamaño completo se utilizan comúnmente en la terapéutica de la enfermedad., Por ejemplo, Infliximab es uno de los muchos anticuerpos disponibles que reconocen el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y se usa en el tratamiento de la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide . El Trastuzumab, o Herceptin, es un anticuerpo que se une al receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico y se usa en el tratamiento del cáncer de mama metastásico . También hay varias terapias basadas en anticuerpos, incluido Muromonab , que se administran a los receptores de trasplantes para prevenir el rechazo del aloinjerto.,
aunque los anticuerpos convencionales de tamaño completo pueden usarse para aplicaciones terapéuticas, hay ventajas y desventajas al usar el anticuerpo completo. Una ventaja importante de los anticuerpos convencionales es el hecho de que la región Fc involucra la respuesta inmune del cuerpo y puede atacar los antígenos Unidos para su destrucción. Esta región Fc también puede ser una desventaja en algunas aplicaciones clínicas porque la respuesta inmune que típicamente provoca puede ser perjudicial para la salud del paciente., Además, los anticuerpos de tamaño completo no pueden penetrar bien en ciertos tejidos debido a su tamaño relativamente grande . En algunos casos, cuando se utilizan anticuerpos de tamaño completo para aplicaciones de diagnóstico, el dominio Fc puede causar una unión inespecífica significativa, lo que puede perjudicar las aplicaciones de detección.
para muchas aplicaciones, los fragmentos de anticuerpos son preferibles. Los fragmentos de anticuerpos se pueden producir a través de mecanismos químicos o genéticos., La fragmentación química utiliza agentes reductores para romper los enlaces disulfuro dentro de la región de la bisagra y la digestión del anticuerpo con proteasas incluyendo pepsina, papaína y ficina. La construcción genética de fragmentos ofrece la capacidad de crear una multitud de moléculas que contienen fragmentos, cada una con características funcionales y de unión únicas.
la digestión química y proteasa de anticuerpos IgG o IgM de tamaño completo produce fragmentos de unión a antígenos (Fab; Figura 1) y fragmentos Fc, compuestos solo por los dominios de cadena pesada CH2 y CH3., Los métodos bioquímicos de generación de fragmentos de anticuerpos producen herramientas útiles para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, pero es bastante laborioso y requiere una gran cantidad de material de partida de anticuerpos.
los fragmentos de unión a antígenos producidos por la digestión bioquímica incluyen Fab, (Fab’)2, Fab ‘ y FV, todos los cuales carecen de la región Fc. Los fragmentos monovalentes F(ab) tienen un sitio de unión al antígeno, mientras que los fragmentos divalentes (Fab’)2 tienen dos regiones de unión al antígeno que están unidas por enlaces disulfuro., Se producen dos fragmentos F(ab) individuales cuando se digiere un anticuerpo de tamaño completo con la enzima papaína. Un fragmento F (ab’) 2, que retiene una porción de la región de la bisagra, es producido por la digestión de pepsina de anticuerpos IgG o IgM. La reducción de los fragmentos F (ab’)2 produce 2 fragmentos Fab ‘ monovalentes, que tienen un grupo sulfhidrilo libre que es útil para la conjugación con otras moléculas. Los fragmentos de FV son el fragmento más pequeño hecho de escisión enzimática de anticuerpos de clase IgG e IgM (Figura 1)., Los fragmentos de FV tienen el sitio de unión al antígeno hecho de las regiones VH y VL, pero carecen de las regiones constantes de las regiones Fab (CH1 y CL) (Figura 1, panel derecho). El VH y el VL se mantienen juntos en fragmentos de FV por interacciones no covalentes. Los fragmentos se pueden generar a través de kits comercialmente disponibles, por ejemplo, F(ab’)2 Fragmentation Kit de G-Biosciences .,
los métodos de ingeniería genética permiten la producción de fragmentos variables de cadena única (scFv), que son fragmentos de tipo FV que consisten en los dominios VH y VL Unidos por un péptido enlazador flexible diseñado (Figura 1) . La manipulación de la orientación de los dominios V y la longitud del enlazador crea diferentes formas de moléculas FV . Cuando el enlazador tiene al menos 12 residuos de largo, los fragmentos de scFv son principalmente monoméricos (como se muestra en la Figura 1) ., Los enlazadores que son 3-11 residuos producen moléculas de scFv que no pueden plegarse en un dominio FV funcional. Estas moléculas se asocian con una segunda molécula de scFv, que crea una diabodia bivalente . Si la longitud del enlazador es inferior a tres residuos, las moléculas de scFv se asocian en triabodies o tetrabodies. Por ejemplo, Tao y et al generaron una diabody VH-VL con un enlazador ggggs corto y scFv con un enlazador GTTAASGSSGSSSGA largo ., Los scFv multivalentes poseen una mayor afinidad de unión funcional a sus antígenos Diana como resultado de tener dos sitios de unión de antígenos Diana más, lo que reduce la tasa de desactivación del fragmento de anticuerpo . Los Minibodies son proteínas de fusión scFv-CH3 que se ensamblan en dímeros bivalentes . Se pueden generar pequeños fragmentos de scFv con dos dominios variables diferentes para producir Fragmentos bis-scFv biespecíficos capaces de unir dos epítopos diferentes simultáneamente . Los métodos genéticos también se utilizan para crear dímeros Fab biespecíficos (Fab2) y trímeros Fab triespecíficos (Fab3) ., Estos fragmentos de anticuerpos son capaces de unir simultáneamente 2 o 3 antígenos diferentes, respectivamente.
Además de los anticuerpos convencionales, las especies de camélidos y tiburones (squalidae) contienen un subconjunto de anticuerpos peculiares de cadena pesada (hcAb) compuestos exclusivamente por homodímeros de cadena pesada que carecen de cadenas ligeras . Las porciones Fab de estos anticuerpos, llamadas VHH en camélidos y VNAR en tiburones, son las regiones de unión a antígenos más pequeñas que se encuentran de forma natural ., Los Nanobodies son dominios recombinantes derivados de VHH capaces de unirse a antígenos, a menudo clonados de bibliotecas de fagos de VHH, como las que se oponen a las proteínas betacoronarivus S. Su termodinámica y estructuras de unión han sido estudiadas (y referencia en ellas)., Los Nanobodies son muy estables y se pueden producir fácilmente en gran cantidad usando sistemas simples comunes de la expresión de la proteína tales como bacterias (los anticuerpos funcionales convencionales del tamaño completo son difíciles de expresar correctamente en un sistema bacteriano), así representando una herramienta prometedora para la investigación y los propósitos terapéuticos, especialmente en las áreas de la microscopía de la super-resolución, de la espectrometría de masas, y de la degradación apuntada de la proteína . Los Nanobodies se pueden también entregar dentro de células vivas con conjugado con los péptidos, o in vivo, o expresado directamente in vivo y reconocen sus blancos in vivo., Los Nanobodies contra RFP o GFP, cuando se conjugaron con tintes atto de rojo lejano, alcanzaron un aumento de 118 veces de las señales fluorescentes sobre GFP o RFP, y se utilizaron para generar conectividad neuronal de ratón de cuerpo entero . También se han utilizado para estabilizar el estado activo de las proteínas en estudios estructurales . Se está examinando un sistema de expresión con múltiples nanobodias concatenadas contra diferentes cepas de gripe como medio para generar una vacuna universal contra la gripe ., Los nanobodies secundarios recombinantes anti-IgG tienen un gran potencial para reemplazar los anticuerpos secundarios policlonales ampliamente utilizados producidos con animales .
Los Nanobodies tienen la capacidad única de cruzar la barrera hematoencefálica; sin embargo, los nanobodies tienden a ser procesados y eliminados muy rápidamente del cuerpo . Los Nanobodies se pueden utilizar para métodos como la inmunoprecipitación, por ejemplo, RFP-Trap MA de Chromotek, o acoplados a proteínas fluorescentes para rastrear objetivos intracelulares en células vivas en tiempo real .,
aproximadamente el 10% de las inmunoglobulinas bovinas contienen una tercera región de complementariedad de cadena pesada inusualmente larga (CDR 3h) con un gran número de residuos de cisteína . Estas cisteínas se emparejan para formar enlaces disulfuro que conducen a una estructura similar a tallo y perilla en el dominio de unión de antígenos . Este dominio cdr3h excepcionalmente largo con el tallo largo contribuye a la diversidad de especificidad de anticuerpos bovinos.,
Intrabodies, o anticuerpos intracelulares, se refieren a anticuerpos o sus fragmentos (generalmente de diseño scFv) expresados directamente dentro de las células o en animales in vivo a través de un vector de expresión. Por ejemplo, Dong JX et al desarrollaron varios nanobodies contra proteínas neuronales para la expresión intracelular como intrabodies . Una consideración/advertencia importante es la reducción del entorno intracelular que disminuye la afinidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión con el antígeno depende de los enlaces disulfuro intradominio., Otra consideración es que intrabodies tienden a agruparse. Kabayama H et al diseñaron intracuerpos con una carga Engativa neta incluso en el pH citoplásmico más bajo 6,6 para generar anticuerpos citoplásmicos ultra estables . Los intrabuerpos se utilizan como alternativas a los inhibidores farmacológicos para dirigirse a participantes endocíticos específicos., For instances, expression of a single-chain variable fragment (scFv) derived from the 3b12a monoclonal antibody against the TDP-43 nuclear export signal in hek293a cells or after in utero electroporation of its expression vector promoted the proteolysis of TDP-43 aggregates in cultivated cells and embryonic mouse brain ., La entrega mediada por Virus en el sistema nervioso de un anticuerpo scFv contra el motivo de reconocimiento de ARN 1 de TDP – 43 redujo la microgliosis en un modelo de ratón de neuroinflamación aguda y mitigó el deterioro cognitivo, defectos motores, proteinopatía TDP-43 y neuroinflamación en ratones transgénicos que expresaban mutaciones TDP-43 vinculadas a la esclerosis lateral amiotrófica . El potencial de intrabodies como una modalidad terapéutica sigue siendo a emerger.
un fragmento de anticuerpo también se puede vincular con una etiqueta de importación de células, como una etiqueta IPTD , para facilitar su entrada en las células.,
los fragmentos de anticuerpos ofrecen ciertas ventajas sobre un anticuerpo de tamaño completo para algunas aplicaciones. Este tema fue revisado por Nelson . Una ventaja de los fragmentos sobre los anticuerpos de tamaño completo es que los fragmentos de anticuerpos son más pequeños que los anticuerpos convencionales y generalmente carecen de glicosilación, lo que permite su producción en sistemas de expresión procariótica, lo que proporciona un ahorro de tiempo y costos., Además, los fragmentos son lo suficientemente pequeños como para infiltrarse en algunos tejidos que los anticuerpos de tamaño completo no pueden penetrar, lo que ayuda en muchos procedimientos terapéuticos e inmunohistoquímicos . Además, la falta de dominio Fc es una ventaja sustancial para los anticuerpos primarios utilizados en inmunohistoquímica y otras aplicaciones de detección, ya que han reducido en gran medida la unión no específica al receptor Fc. Un scFv que se utiliza comúnmente en diagnósticos es el anticuerpo NC10 contra La neuraminidasa de la gripe., El anticuerpo MOC-31 contra la molécula epitelial de la adhesión de la célula Ep-CAM es un scFv de uso general adentro como terapia del cáncer. Diabodies, triabodies y tetrabodies tienen usos potenciales en aplicaciones tales como radioinmunoterapia y diagnóstico de imágenes in vivo . Sin embargo , los fragmentos que carecen del dominio Fc se degradan en el cuerpo mucho más rápidamente que los anticuerpos convencionales , y son incapaces de provocar procesos citotóxicos mediados por Fc a menos que se conjuguen con una fracción efectora, lo que requiere una mayor optimización para la terapia basada en fragmentos de anticuerpos.,
aunque varios fragmentos de anticuerpos ofrecen ciertas ventajas, no se utilizan comúnmente en experimentos. En los más de 60.000 artículos curados manualmente por Labome solo unos pocos artículos citaron aplicaciones de fragmentos de anticuerpos Fab. Los fragmentos de anticuerpos anti-digoxigenina Fab de Roche ( 11093274910) y los fragmentos de anticuerpos anti-fluoresceína Fab ( 11426338910) se generan en ovejas y se producen a través de la digestión con papaína. Se utilizaron fragmentos de Fab Anti-digoxigenina para hibridaciones in situ ya que las sondas de ARN están etiquetadas con digoxigenina ., También se utilizaron para realizar análisis de plegado de proteínas para estudiar el proceso de plegado de una sola molécula de calmodulina a través de la espectroscopia de fuerza de una sola molécula . Los fragmentos F (ab) de anticuerpos secundarios anti-ratón se utilizan a menudo para bloquear la Ig endógena de ratón durante la inmunotinción, por ejemplo, affinipure Fab fragment Donkey antimouse IgG de Biozol (JIM-715-007-003) .,
Invitrogen Alexa Fluor 546-conjugated goat anti-rabbit IgG F(ab’)2 fragment was used to perform immunohistochemistry to investigate the role of sflt-1 in the maintenance of the avascular photoreceptor layer in mouse models and Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2 fragment of rabbit anti-goat IgG (H+L) was used in immunohistochemistry to investigate the mechanism of tip link regeneration in audatory ciliates .,
los receptores Fc (RFC) son moléculas expresadas principalmente en / en las células inmunitarias innatas, que reconocen y se unen al dominio Fc de los anticuerpos y, por lo tanto, inician una respuesta inmunitaria basada en células. Las diversas funciones de FcRs reflejan la amplia gama de funciones protectoras o moduladoras de los anticuerpos, incluyendo la mediación de la neutralización y el aclaramiento de sustratos específicos, así como la programación de la inmunidad adaptativa ., Las funciones biológicas de las RFC están reguladas por motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptores (ITAMs) y motivos inhibitorios basados en tirosina inmunorreceptores (tim), que actúan como interfaz del receptor con las vías de señalización activadoras e inhibitorias, respectivamente. Por lo tanto, la señalización por ITAMs puede provocar activación celular, fagocitosis y endocitosis, mientras que la señalización por IMS tiene un efecto inhibitorio sobre la activación celular . Las RFC se han descrito para todas las clases de inmunoglobulinas y algunas de ellas se discuten a continuación.,
esta familia incluye FcyRI, FcyRII, FcyRIII y sus isoformas. Son responsables de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y de la fagocitosis mediada por células dependientes de anticuerpos (ACDP).
otro receptor que se une a la IgG es el receptor FC neonatal (FcRn), que participa en la transferencia de la inmunidad humoral pasiva de una madre a su feto. FcRn también protege la IgG de la degradación in vivo, lo que explica su larga vida media en el suero ., Este fenómeno ha llevado al desarrollo de mejores anticuerpos terapéuticos al introducir alteraciones en la región Fc para promover la interacción Fc-FcRn.
incluyen el FceRI de alta afinidad, que es capaz de unirse a la IgE monomérica, y la lectina de tipo C de baja afinidad FceRII, que interactúa preferentemente con la IgE compleja. Fcri media la respuesta de hipersensibilidad inmediata de muchas reacciones alérgicas estimulando la degranulación y la liberación de una gama de mediadores inflamatorios en mastocitos y basófilos ., FceRII existe tanto en una forma unida a la membrana que entrega una señal de regulación descendente para la síntesis de IgE , así como fragmentos solubles que generan una regulación ascendente opuesta en la síntesis de IgE . Su papel en la transcitosis de los complejos IgE-alérgenos en las vías respiratorias humanas y el epitelio intestinal se está investigando activamente como un objetivo potencial para la inflamación alérgica de las vías respiratorias como resultado de las alergias alimentarias .
El único miembro del grupo receptor IgA, FcaRI, se expresa solo en células del linaje mieloide., Juega un papel en las respuestas Pro-y antiinflamatorias dependiendo del Estado de la IgA unida. Si bien la Unión de IgA secretora (SIgA) presente en los sitios de la mucosa tiene efectos antiinflamatorios, incluida la prevención de la invasión de patógenos, la Unión de IgA sérica conduce a respuestas inflamatorias. FcaRI también regula la viabilidad de los neutrófilos dependiendo del microambiente inflamatorio .
TRIM21 se puede distinguir de otros FCR, ya que muestra una amplia especificidad de anticuerpos. Puede unir IgG, IgM e IgA . También se expresa por las células de la mayoría de los linajes histogénicos ., TRIM21 participa en la interferencia mediada por anticuerpos de la replicación viral al dirigirse a los complejos citosólicos virus-anticuerpos para la degradación proteasómica.
La Unión de dominios Fc a FcRs puede tener efectos no deseados en métodos analíticos basados en anticuerpos monoclonales, como la inmunohistoquímica (IHC), la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). La unión no específica a FcRs puede introducir ruido de fondo que puede conducir a la detección de falsos positivos., Las soluciones para hacer frente a este problema incluyen el uso de (I) controles isotípicos para la apertura, (II) Suero para competir ampliamente por los receptores involucrados en la unión no específica, o (iii) IgG purificada para bloquear los receptores Fc específicamente . Innovex Fc Receptor blocker # NB309 se puede utilizar para bloquear parafina o secciones congeladas durante los experimentos IHC o IC o BD Biosciences # 553142, Miltenyi Biotec Fc receptor block para citometría de flujo. Por ejemplo, Chopra s et al bloquearon la Unión de FcyR con 5 µg/ml trustain fcX (anti-mouse CD16/32, clon 93) de BioLegend durante la citometría de flujo y la clasificación celular .,
La Dra. Macarena Fritz Kelly de São José dos Campos, SP, Brasil, contribuyó con la sección sobre receptores Fc en septiembre de 2018.
Deja una respuesta