evolución de los genomas mitocondriales de la Anguilla de aguas profundas: reordenamientos genéticos a gran escala originados dentro de las anguilas

resumen

estudios recientes han demostrado que las desviaciones del orden genético mitocondrial típico de los vertebrados son más frecuentes de lo que se pensaba inicialmente., Tales desviaciones, sin embargo, son menores, con inversiones y/o translocaciones de unos pocos genes que están involucrados y la duplicación en tándem de las regiones del gen seguido por deleciones de genes que se han invocado como mecanismos que se originan en tal nuevo orden de genes., Durante el curso de estudios filogenéticos moleculares en Elopomorpha (anguilas y sus aliados), encontramos que los genomas mitocondriales (mitogenomas) de las dos anguilas de aguas profundas, Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) y Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), exhiben un orden genético idéntico que difiere mucho del de cualquier otro vertebrado. El análisis filogenético utilizando los datos mitogenómicos de 59 especies de peces no solo confirmó un único origen de dicho orden genético con confianza, sino que también indicó que se había derivado del orden genético típico de los vertebrados., Las comparaciones detalladas del orden de genes de la anguila golper con el de vertebrados típicos sugirieron que la ocurrencia de un solo paso, duplicación a gran escala de la región génica que se extiende > 12 kb, seguida de deleciones de genes en un ancestro común de las dos especies, más parsimoniosamente explica esta disposición génica inusual.

Introducción

El orden genético mitocondrial de los vertebrados se consideró inicialmente conservador debido a las secuencias completas de nucleótidos de los genomas mitocondriales (mitogenomas) de mamíferos (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981)y la rana africana con garras (Roe et al. 1985) mostró un orden genético común. Como las secuencias completas de ADN mitocondrial (ADNmt) se han determinado para un número de vertebrados (269 especies al 11 de junio de 2003; sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), se ha reconocido que las desviaciones del orden genético típico no son tan raras en vertebrados (fig. 1; Boore 1999). Con la excepción de los mamíferos placentarios, los ejemplos incluyen todos los linajes principales de vertebrados como las lampreas (Lee y Kocher 1995), los anfibios (Macey et al. 1997; Sumida et al., 2001), reptiles (Kumazawa y Nishida 1995; Quinn y Mindell 1996; Macey et al. 1997), aves (Desjardins y Morais 1990, 1991; Quinn y Wilson 1993; Mindell, Sorenson, y Dimcheff 1998), marsupiales (Pääbo et al. 1991; Janke et al. 1994), y fish (Miya y Nishida 1999; Inoue et al. 2001B; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001). Tales reordenamientos de genes, sin embargo, son locales (más notablemente dentro de un grupo de genes de ARNt), y no se ha encontrado ningún ejemplo que involucre reordenamientos a escala genómica.,

Las anguilas golper son criaturas bien conocidas de los fondos marinos, incluyendo colectivamente cuatro familias ubicadas en el orden Saccopharyngiformes, que ocurren a profundidades batipelágicas (> 1,000 m) en todos los océanos del mundo (Bertelsen, Nielsen, y Smith 1989). Su apariencia extraña (fig. 1), que resulta de las aberturas extremadamente agrandadas y deformadas en la punta de la cabeza y el cuerpo de serpiente de la anguila, ha atraído mucha atención de muchos investigadores (por ejemplo, Bertelsen, Nielsen y Smith 1989; Robins 1989)., Tales características anatómicas especializadas han llevado a los investigadores a suponer que las posiciones filogenéticas de estos animales están fuera de los peces óseos (por ejemplo, Tchernavin 1946), aunque generalmente se han considerado parientes cercanos de las anguilas verdaderas (orden Anguilliformes), porque tienen una etapa larval leptocéfala en forma de hoja (Greenwood et al. 1966; Inoue y Miya 2001).,

durante el curso de los estudios filogenéticos moleculares de Elopomorpha (anguilas y sus aliados) utilizando datos mitogenómicos, encontramos un orden genético mitocondrial inusual para una de las anguilas golper, Eurypharynx pelecanoides (fig. 1). Este artículo describe la nueva organización genética en los mitogenomas de dos especies de anguilas golper, E. pelecanoides y Saccopharynx lavenbergi. Empleamos un enfoque basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desarrollado por Miya y Nishida (1999) para secuenciar los mitogenomas completos de estos peces., Para explorar el origen de tales mitogenomas únicos, sometemos los datos mitogenómicos al análisis filogenético, y discutimos aquí los posibles mecanismos que generan tal disposición génica en las dos anguilas gulper.

materiales y métodos

especímenes

Las secuencias de ADN mitocondrial se obtuvieron de seis individuos de dos especies que representan dos familias en el orden Saccopharyngiformes (Robins 1989). Para la familia monotípica Eurypharyngidae, un individuo de E., pelecanoides fue utilizado como espécimen para la determinación de la secuencia completa de ADNmt, y los otros cuatro individuos, incluyendo dos larvas leptocéfalas, fueron utilizados para la determinación de secuencias parciales de cuatro uniones génicas principales (fig. 2) Confirmar el orden génico en el mitogenoma de E. pelecanoides. Para la familia Saccopharyngidae, se utilizó un solo individuo de S. lavenbergi como espécimen para la determinación de la secuencia completa de ADNmt., Los especímenes de comprobantes fueron depositados en las colecciones de peces del Museo de Historia Natural & Institute, Chiba, Japón (CBM-ZF), y en la Universidad de Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, Sur de Japón; CBM-ZF 10312, 10313, 10316 y 10317: Océano Pacífico Central Ecuatorial) y S. lavenbergi (uw 045633: Eastern Pacific).

extracción de ADN

una porción de la musculatura epaxial (ca. 0,25 g) se extirpó de especímenes frescos de cada especie y se conservó inmediatamente en etanol al 99,5%., El ADN genómico total se extrajo utilizando el kit de tejido Qiagen QIAamp siguiendo el protocolo del fabricante.

reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación

Los mitogenomas completos de dos anguilas se amplificaron utilizando una técnica de PCR larga (Cheng, Higuchi y Stoneking 1994). Cinco cebadores de PCR largos universales para peces y tres especies específicas (S-la-16S-L + H12293-Leu Y L12321-Leu + S-la-16S-H Para E. pelecanoides; L2508-16S + Sala-ND4-H y Sala–CO1-L + Sala-ND1-H para S. lavenbergi; fig. 1) se utilizaron para amplificar todo el mitogenoma de cada anguila en dos reacciones., Los mitogenomas completos de los otros cuatro individuos de E. pelecanoides fueron amplificados con tres cebadores fish-universal y un cebador long-PCR específico de especie (L2508-16S + EUPE-ND2-H y L12321-Leu + S-la-16S-H). Cuatro cebadores específicos de especies (EUPE-ND2-H Para E. pelecanoides; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H y Sala-ND4-H para S. lavenbergi) fueron diseñados alternativamente con referencia a las secuencias parciales de nucleótidos del gen ND2 de E. pelecanoides y los genes COI, ND1 y ND4 de S. lavenbergi determinados a partir de cada ADN total utilizando cebadores fish-universal.,

los productos de PCR larga se diluyeron con tampón TE (1:20) para su uso posterior como plantillas de PCR, excepto para una región que intervenía entre los dos cebadores de PCR larga (entre S-La-16S-H y S-La-16S-L, y H12293-Leu y L12321-Leu para E. pelecanoides; fig. 1), en el que se utilizó alternativamente el ADN genómico total.

un total de 82 cebadores fish-universal (Miya y Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001B, 2001C, 2001d; Ishiguro, Miya y Nishida 2001; Kawaguchi, Miya y Nishida 2001) se utilizaron en varias combinaciones para amplificar segmentos contiguos y superpuestos de todo el mitogenoma para cada una de las dos especies. Se diseñaron cebadores específicos para cada especie en los casos en que no se disponía de cebadores universales adecuados para peces. Una lista de cebadores PCR utilizados para una especie específica está disponible en J. G. I. a petición. Las reacciones de PCR larga y posteriores se llevaron a cabo como se describió anteriormente (por ejemplo, Miya y Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

los productos de PCR de doble cadena, purificados mediante un Kit de pre-secuenciación (USB), se utilizaron posteriormente para la secuenciación de ciclo directo utilizando terminadores Etiquetados con tinte (Applied Biosystems). Los cebadores utilizados fueron los mismos que los de PCR. Todas las reacciones de secuenciación se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos Etiquetados fueron analizados por medio de un secuenciador de ADN modelo 377 (Applied Biosystems).

análisis de secuencias

Las secuencias de ADN fueron analizadas utilizando el programa informático DNASIS Versión 3.2 (Hitachi Software Engineering)., Las ubicaciones de los 13 genes codificadores de proteínas se determinaron mediante comparaciones de secuencias de ADN o aminoácidos de mitogenomas de peces óseos. Los 22 genes del ARNt fueron identificados por sus estructuras secundarias de trébol (Kumazawa y Nishida 1993) y secuencias anticodon. Los dos genes del ARNr fueron identificados por similitud de secuencia y estructura secundaria (Gutell, Gray, and Schnare 1993). Los datos de secuencia están disponibles en DDBJ / EMBL / GenBank con números de acceso AB046473 y AB046475-AB046490 para E. pelecanoides, y AB047825 para S. lavenbergi.,

análisis filogenético

Las matrices de datos de Inoue et al. (2001d) y Miya, Kawaguchi y Nishida (2001) se combinaron y se eliminaron taxones redundantes. Se añadieron secuencias mitogenómicas de las dos anguilas gulper y dos teleósts (Gymnothorax kidako, AP002976 y Salmo salar, U12143). Debido a que las alineaciones inequívocas de los dos genes del ARNr sobre la base de modelos de estructura secundaria no fueron factibles (Miya y Nishida 2000), no se utilizaron en los análisis., El gen ND6 no se utilizó en los análisis filogenéticos debido a su composición de base heterogénea y a su rendimiento filogenético consistentemente pobre (por ejemplo, Zardoya y Meyer 1996; Miya y Nishida 2000). Además, los bucles de ARNt, tRNASer (AGY) (estructuras secundarias inferidas inestables en algunas especies) y otras regiones ambiguamente alineadas, como los extremos 5′ y 3′ de varios genes codificadores de proteínas, fueron excluidos de los análisis., Además, se excluyeron de los análisis las posiciones del 3er codón en los genes codificadores de proteínas que podrían inducir a error un análisis de las relaciones de alto nivel de los actinopterigios (Miya y Nishida 2000), dejando 7.984 posiciones de nucleótidos disponibles de los 12 genes codificadores de proteínas y 21 genes del ARNt.

Los análisis filogenéticos bayesianos se realizaron utilizando MrBayes 2.01 (Huelsenbeck y Ronquist 2001)., El modelo general de tiempo reversible con algunos sitios considerados invariables y con sitios variables que siguen una distribución gamma discreta (GTR + I + Γ; Yang 1994) fue seleccionado como el modelo de mejor ajuste de sustitución de nucleótidos (ModelTest Versión 3.06; Posada y Crandall 1998). Establecemos los parámetros de máxima verosimilitud en MrBayes de la siguiente manera: «lset nst = 6» (GTR), «rates = invgamma» (I + Γ), y «basefreq = estimate» (proporción estimada de tipos de base a partir de los datos). El proceso de Montecarlo de la cadena de Markov se configuró para que cuatro cadenas (tres calentadas y una fría) funcionaran simultáneamente., Llevamos a cabo dos carreras independientes durante 1 millón de generaciones, con árboles muestreados cada 100 generaciones, cada uno de los cuales comenzó a partir de un árbol al azar. Dos análisis independientes convergieron en puntuaciones de log verosimilitud similares y alcanzaron la «estacionalidad» (falta de mejora en las puntuaciones de ML) a más tardar a las 120.000 generaciones., Así, los primeros 1.200 árboles fueron descartados de cada análisis, y las restantes 17.602 muestras combinadas de dos análisis independientes fueron utilizadas para generar un árbol de consenso de regla de mayoría del 50%, con el porcentaje de muestras recuperando cualquier clado en particular representando la probabilidad posterior de ese clado (Huelsenbeck y Ronquist 2001).

resultados

organizaciones genómicas

Las longitudes totales de los mitogenomas de E. pelecanoides y S. lavenbergi son 18.978 PB y 18.495 PB (excepto una porción de la región de control putativa para S., lavenbergi), respectivamente (ver material suplementario en línea). El contenido del genoma de estas dos anguilas incluye dos ARNr, 22 ARNt y 13 genes codificadores de proteínas, como se encuentran en otros vertebrados (fig. 2). También como en otros vertebrados, la mayoría de los genes de estas dos especies están codificados en la H-hebra, a excepción de los genes ND6 y ocho ARNt. Todas las características son similares en longitud a las de otros peces óseos con la excepción del gen COI y la región de control para E. pelecanoides y los genes COI y cyt B Para S., lavenbergi (aproximadamente 100, 800, 150 y 30 PB Más largos que los de otros peces óseos, respectivamente).

el mitogenoma de E. pelecanoides contiene tres regiones no codificantes de más de 200 PB (fig. 2; Ver también materiales suplementarios en línea; región no codificante y región de control). El nc1, ubicado entre los genes tRNASer(UCN) y tRNAAsp, y el nc2, ubicado entre los genes tRNAAsp y COII, contienen dos y cuatro pseudogenes correspondientes a copias degenerativas del gen tRNAAsp, respectivamente., Una región no codificante (1.818 PB) ubicada entre los genes cyt b y tRNAPhe parece corresponder a la región de control. El mitogenoma de S. lavenbergi también contiene tres regiones no codificantes de más de 200 bp (región no codificante y regiones de control ). El nc, ubicado entre los genes tRNALeu(CUN) y ND5, contiene al menos dos pseudogenes correspondientes a copias degenerativas del gen tRNALeu(CUN)., CR1 (992 PB), localizado entre dos grupos de genes tRNA (regiones TP e IM), y CR2 (> 837 PB), localizado entre los genes cyt B y tRNAPhe, parecen corresponder a la región de control, y tienen secuencias completamente idénticas sobre 800 PB, indicando que están experimentando una evolución concertada (ver Kumazawa et al. 1998).

con la excepción de las dos regiones de control duplicadas (CR1 y CR2) en el mitogenoma de S. lavenbergi, los mitogenomas de las dos anguilas de aguas profundas exhiben un orden genético idéntico (fig. 2)., Sin embargo, el orden del gen mitocondrial de las dos anguilas gulper difiere mucho del de todos los otros vertebrados conocidos hasta la fecha. Cuando algunos genes del ARNt fueron excluidos de las comparaciones (fig. 2), identificamos cinco bloques de genes (a, tRNAGlu-tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, trnaleu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; y E, regiones del gen tRNAArg–tRNASer (AGY)), cuyo orden genético es idéntico al de los vertebrados típicos.,

posiciones filogenéticas de dos anguilas golper

La Figura 3 es un árbol de consenso de la regla de la mayoría del 50% de las 17.602 muestras combinadas de dos análisis bayesianos independientes de las 59 secuencias de nucleótidos mitocondriales de las 12 codificaciones de proteínas concatenadas (sin posiciones de codón 3), Más 21 genes de ARNt (solo regiones madre) utilizando el modelo GTR + I + Γ de evolución de secuencias (Yang 1994). Con la excepción de unos pocos nodos dentro del Neoteleostei, la mayoría de las ramas internas estaban soportadas por altas probabilidades posteriores Bayesianas (≥95%)., Cabe señalar que el árbol resultante demuestra explícitamente no solo que las dos anguilas gulper forman una relación de grupo hermano con una alta probabilidad posterior (100%), sino también que están profundamente anidadas dentro de las Anguilliformes (anguilas verdaderas), lo que sugiere fuertemente que se han derivado de un ancestro similar a la anguila.

discusión

recientemente, se han determinado más de 140 secuencias completas de ADNmt de peces actinopterigios (por ejemplo, Miya y Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya, y Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya, y Nishida 2001; Miya, Kawaguchi, y Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003), y se han reportado varios ejemplos de reordenamientos genéticos (fig. 1). Cabe señalar que tales eventos de reordenamiento de genes involucran pocos genes y que la disposición génica de los mitogenomas de la anguila gulper difiere en gran medida de la de otros vertebrados.,

implicaciones filogenéticas sobre el origen del nuevo orden genético

para deducir la evolución de los arreglos genéticos en las dos anguilas gulper, se requiere inferencia para la organización ancestral basada en un marco filogenético confiable. Aunque las anguilas gulper se han incluido en el Elopomorpha basándose únicamente en una forma larvaria pelágica distinta, denominada leptocephalus, nadie ha corroborado su posición filogenética utilizando matrices de caracteres derivadas de datos morfológicos o moleculares (Inoue y Miya 2001).,

análisis bayesiano utilizando los datos mitogenómicos de 59 especies que representan plenamente la diversidad de peces teleósteos (fig. 3) no solo corroboró que el nuevo orden génico de las dos anguilas gulper se originó en un ancestro común de las dos especies, sino que también demostró que su origen era independiente de los de los otros órdenes génicos novedosos. También parece que el nuevo orden génico de congrio myriaster, otro miembro de Elopomorpha, tiene un origen independiente del de las anguilas de gulper., Cabe señalar que Anguilla japonica, que tiene el orden genético típico de los vertebrados, fue colocada con confianza como una especie hermana de las dos anguilas gulper. La reconstrucción más parsimoniosa de los eventos de reordenamiento génico en el árbol filogenético indicó que el orden génico aberrante de las dos anguilas gulper se deriva del de los vertebrados típicos.

posible mecanismo para el reordenamiento génico en las anguilas golper

se han propuesto dos mecanismos principales para explicar los reordenamientos génicos en mitogenomas de vertebrados (Lee y Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Uno de ellos es la duplicación tándem de regiones genéticas como resultado de un deslizamiento de la hebra, seguido por las deleciones de genes (Moritz y Brown 1986; Levinson y Gutman 1987). Aunque la dinámica de los arreglos genéticos mitocondriales no se ha explicado en algunos invertebrados (por ejemplo, Kurabayashi y Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et al. 2002), los reordenamientos de genes mitocondriales vertebrados bien pueden explicarse por tal mecanismo (Desjardins y Morais 1990; Quinn y Wilson 1993; Kumazawa y Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson, y Dimcheff 1998; Miya y Nishida 1999; Inoue et al. 2001b), y su viabilidad también es apoyada por las frecuentes duplicaciones polimórficas de secuencias de ADNmt (por ejemplo, Stanton et al. 1994; Gach y Brown 1997; Mindell, Sorenson, y Dimcheff 1998; Miya y Nishida 1999). Los otros mecanismos sugeridos invocan el cebado ilícito de la replicación por ARNt y la integración resultante de genes ARNt alrededor de la región de control (Cantatore et al. 1987; Jacobs et al. 1989).,

aunque el segundo modelo no se excluye en este punto, el primer modelo se favorece como el mecanismo de reordenamiento génico en los mitogenomas de la anguila gulper. Suponiendo que un fragmento de ADN largo en la región tRNAIle–CR de la organización típica se duplica (fig. 4), las deleciones subsecuentes de genes redundantes darían lugar a la organización reordenada del gen en las anguilas de gulper. Tal duplicación en tándem y las deleciones posteriores resultaron más parsimoniosamente en el orden génico observado y los espaciadores intergénicos asociados en estas dos anguilas.,

las eliminaciones múltiples de genes redundantes parecían ser incompletas en las dos anguilas gulper, debido a varios tramos de secuencias no codificantes (fig. 2) que ocurre alrededor de los genes involucrados en el reordenamiento (fig. 4). Aunque nc1 y nc2 en E. pelecanoides y nc en S. lavenbergi están compuestos de pseudogenes repetitivos correspondientes a copias degenerativas del gen Trna adyacente, CR1 y CR2 en el mitogenoma de S. lavenbergi tienen secuencias idénticas sobre 800 PB, y CR1 se encuentra en la posición supuesta duplicada mientras que CR2 se encuentra en la posición original de la región control., Esta observación en el mitogenoma de S. lavenbergi apoya el concepto de la duplicación en tándem y los eventos posteriores de deleción como si hubieran ocurrido en la región tRNAIle-CR (fig. 4).

Si cuatro de los cinco bloques de genes contiguos se duplicaban juntos en un ancestro común de las dos especies, y si la subsecuente deleción de genes ocurría antes de la especiación, las supuestas porciones duplicadas de las anguilas gulper, que iban desde el gen tRNAIle hasta CR de la organización típica, se extendían más allá de 12 kb (fig. 1)., Antes de este estudio, las supuestas regiones duplicadas de reordenamiento de vertebrados eran de 4 kb en el mejor de los casos. Además, todas las secuencias codificantes repetidas en tándem conocidas se restringieron a regiones adyacentes a las regiones de CR, IQM o WANCY, posiblemente reflejando la terminación imprecisa ocasional de las repeticiones más allá de sus orígenes. La región duplicada en el mitogenoma de la anguila golper era mucho mayor que la de los reordenamientos de vertebrados nunca conocidos e involucraba casi todo el mitogenoma (fig. 1).