Introduction
Bacillus thuringiensis and the other 7 species of spore forming Gram positive bacteria, including B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, and B. mycoidesare, se detectan principalmente en el suelo. Debido a que estas bacterias son muy similares en genotipo y fenotipo, las bacterias se clasifican como grupo B. cereus en la taxonomía(Park et al., 2007). B., cereus y B. thuringiensis son altamente detectables en los alimentos, ya que se observan en las materias primas del suelo agrícola durante el cultivo y la distribución. Además, estas dos bacterias no suelen ser discriminadas en el diagnóstico clínico. B. cereus es un segundo grupo de riesgo prioritario de enfermedades transmitidas por los alimentos en los productos agrícolas frescos, y su contaminación es uno de los principales problemas en las verduras (Felício et al., 2015). En particular, B., thuringiensis fue utilizado como pesticida en el cultivo de ciertos cultivos y es bien conocido como insecticidas microbianos que se han utilizado para reducir la cantidad de pesticidas químicos (Azmi et al., 2015).
B. thuringiensis produce proteínas insecticidas, que son el principal tipo de proteínas cristalinas (Cry) (Kutasi et al., 2016). Por el contrario, las células vegetativas de crecimiento activo que carecen de producción de cristales conducen a efectos no tóxicos. Las δ-endotoxinas contienen principalmente Citolítico (Cyt) y Cry (Elleuch et al., 2015; Rao et al., 2015)., Sin embargo, Cyt y Cry poseen diferentes homologías de secuencia a pesar de que consisten en modos similares de acción hacia la lisis celular, que conducen al daño permanente del intestino medio del insecto (Adang et al., 2014).
la variación estructural de cuatro δ-endotoxinas (Cry1, Cry2, Cry3 y Cyt2Ah) se observó mediante cristalografía de rayos X (Dehury et al., 2013). Estos genes se identifican en el algodón transgénico y otras verduras, que son considerablemente eficaces en el control de plagas., El diseño de un biomarcador para el producto traducido varía con las diferentes categorías de proteína cry; por lo tanto, la detección será compleja. Las secuencias del gen 16S rRNA basadas en cebadores universales mostraron un índice de alta similitud (>99%) entre B. cereus y B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), que no se pueden clasificar mediante ensayos genéticos y fenotípicos (Peng et al., 2015). Además, ha habido una discusión desde el año 2000 con respecto a si todo el grupo de B. cereus debe ser tratado como una especie compleja de bacterias diversas (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz y Marjańska, 2017). También hay sugerencias de que la filogenia de estas bacterias se ajusta mejor a sus propiedades ecológicas (psicrotolerancia, virulencia) que a la afiliación Taxonómica (Drewnowska y Swiecicka, 2013; Bartoszewicz y Marjańska, 2017). Para resolver este problema, apuntamos a XRE para detectar B. thuringiensis, que controla el tipo principal de producción de proteína cristalina.
estas dos bacterias son muy similares en los resultados bioquímicos (Böhm et al., 2015), y propiedades genéticas (Osman et al., 2015). Cho et al., (2015) también informaron que las propiedades genéticas y fenotípicas entre estas bacterias son apenas distinguibles. Además, Pfrunder et al. se informó de que las especies del grupo B. cereus no se pueden identificar de manera fiable mediante el biotipado clásico (Pfrunder et al., 2016). Sobre la base de estos, los experimentos bioquímicos podrían no ser suficientes para la diferenciación. En cambio, la presencia de una proteína cristalina insecticida se utilizó como una característica distinguida para diferenciar estas bacterias (Ekino et al., 2014; Wei et al., 2018).,
algunos de los factores que diferencian estas dos bacterias se basan en su patogenicidad en muestras. B. cereus causa trastorno gastrointestinal, mientras que B. thuringiensis también ha estado involucrado en epidemias de diarrea. Como se informó, la característica distintiva de B. thuringiensis es la presencia de proteínas cristalinas insecticidas (δ-endotoxina) cifradas por genes cry (Osman et al., 2015; Albright et al., 2016). Desde el método de identificación utilizando el biomarcador para diferenciar B., cereus group es complejo y requiere mucho tiempo, se necesita urgentemente un biomarcador altamente eficiente para reemplazar los anteriores que dieron una menor eficiencia y a veces incluso mostraron resultados falsos. Basado en los dos genes específicos, el regulador transcripcional y los genes de proteína cristalina para B. thuringiensis (Porcar y Juárez-Pérez, 2003; Han et al., 2006), el presente estudio se realizó para inspeccionar y comparar la eficiencia del biomarcador diseñado (XRE) con la del marcador de proteína cristalina existente (cry2) en la identificación de B. thuringiensis a partir de cepas del grupo B. cereus (Bcg) y no-B., cepas del grupo cereus (No B) en alimentos. cry2 es la proteína cristalina más común presente en B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma et al., 2014).
materiales y métodos
preparación de cultivos bacterianos
todas las 120 cepas, incluyendo 111 de Bcg y 9 No-B, se obtuvieron de colecciones bacterianas en los Estados Unidos y Corea Del Sur (tabla suplementaria 1). Entre las colecciones, se utilizó B. thuringiensis ATCC 10792 (cepa tipo) para la optimización de condiciones experimentales de PCR convencional y PCR en tiempo real., Todas las cepas se descongelaron a temperatura ambiente (25°C) y se rayaron en el agar nutritivo (Difco, MI, Estados Unidos). Después del cultivo durante 24 h a 35°C En la incubadora, se recogió una colonia pura y se inoculó en caldo de soja triptica (Difco, MI, Estados Unidos) y se utilizaron cultivos durante la noche para experimentos posteriores.
diseño de cebador y aislamiento de ADN
los respectivos cebadores dirigidos a XRE para diferenciar B., thuringiensis (Tabla 1) se diseñaron de acuerdo con la siguiente secuencia en Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gene – 3664610-3665047) utilizando el Software Primer Express® (Versión 3.0.1) de Applied Biosystems ubicado en CA, Estados Unidos y sintetizado por Bioneer Corporation de Daejeon, Corea. El rendimiento del XRE diseñado se comparó con cry2 (Ben-Dov et al., 1997). Después de un enriquecimiento de 24 h en TSB, una alícuota de 1 mL de bacteria se sometió a la extracción de ADN genómico utilizando el reactivo PrepMan® Ultra Sample Preparation (Applied Biosystems, CA, Estados Unidos)., Las concentraciones de ADN se midieron mediante fluorescencia Eppendorf BioSpectrometer® (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y se ajustaron a 10 ng/µL. Las muestras de ADN se almacenaron a -20°C antes de su uso.
la Tabla 1. Secuencias de imprimación de oligonucleótidos utilizadas en este estudio.
PCR convencional y PCR en tiempo real
la PCR convencional se preparó con un termociclador C1000 TouchTM de Bio-Rad ubicado en Hemel Hempstead, Reino Unido., El tubo de reacción para la PCR utilizó Accu-Power ® Pyro Hot Start Taq PCR Pre-Mix de Bioneer Corporation ubicada en Daejeon, Corea y un volumen de 20 µL, incluyendo 1 µL de cada imprimación (10 pmoL/µL) y 2 µL de ADN. Las condiciones de amplificación de la PCR convencional para regulador transcripcional (XRE) fueron: desnaturalización inicial a 95°C durante 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30 s, recocido a 49°C durante 30 s y alargamiento a 72°C durante 30 s, y alargamiento final a 72°C durante 5 min., Las condiciones de amplificación de la proteína cristalina (Cry 2) fueron: desnaturalización inicial a 95°C durante 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30 s, recocido a 55°C durante 30 s y elongación a 72°C durante 1 min, y una elongación final a 72°C durante 5 min. Después de amplificaciones de ADN, 1.5% (P/V) solución de gel de agarosa que contiene RedsafeTM solución de ácido nucleico 20,000 × (Intron Biotechnology, Inc.) se preparó y se realizó electroforesis en gel utilizando el modelo subcelular 192 de Bio-Rad ubicado en Hemel Hempstead, Reino Unido., Las bandas se visualizaron utilizando el sistema de imagen Smart View Pro UVCI-1100 de Major Science ubicado en CA, Estados Unidos. Se utilizó la precisión (AC) para evaluar el método de PCR utilizando cebadores XRE y cry2 en la detección de B. thuringiensis a partir de Bcg y no-B. acuerdo negativo (NA) significa el mismo resultado negativo para no-B. thuringiensis utilizando PCR con XRE y cry2. Acuerdo positivo (PA) significa el mismo resultado positivo para B. thuringiensis usando PCR con XRE y cry2. La precisión (AC)se mide utilizando la siguiente ecuación, AC = ×100% (Ma et al., 2014).,
Los experimentos de PCR en tiempo Real fueron realizados por el sistema de PCR en tiempo real StepOneTM de Applied Biosystems ubicado en CA, Estados Unidos. Un volumen de reacción de 20 µL consistente en 10 µL de Melt DoctorTM High Resolution Melting (HRM) Master Mix, 2 µL de ADN, 0,5 µL de la imprimación F/R (10 pmoL/µL) (Tabla 2). Las condiciones de amplificación del qPCR fueron: desnaturalización inicial a 95°C durante 10 min y 40 ciclos a 95°C durante 15 s y 60°C durante 1 min. Luego, en el análisis de la curva de fusión posterior, la temperatura se estableció para aumentar de 60 a 95°C a 0.3°C/ciclo para probar la especificidad de la imprimación.,
la Tabla 2. Detección de B. cereus group y non-Bacillus sp. focalización de biomarcadores de XRE y cry2 mediante PCR.
evaluación del ensayo de PCR en tiempo Real
el rendimiento de XRE y cry2 se evaluó utilizando 50 cepas de B. thuringiensis, mientras que la exclusividad se probó utilizando 70 bacterias no Diana, incluidas 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg y 9 No B (Chelliah et al., 2017). Se realizó una curva estándar utilizando diluciones de 10 veces del ADN extraído de B. thuringiensis ATCC 10792., Las concentraciones de ADN se ajustaron de 10 ng / µL a 100 fg / µL, correspondientes a 2,6 × 106 a 2,6 × 10 UFC, y las amplificaciones se realizaron mediante PCR en tiempo real con triplicados. Para los controles negativos, se utilizó agua destilada. Se consideraron resultados negativos o ninguna curva de amplificación cuando los valores de umbral de ciclo (TC) eran superiores a 40.
la detección de B. thuringiensis en muestras de alimentos enriquecidos
lechuga (Lactucasativa), Kimbab y espinaca (Spinaciaoleracea) se compraron en un mercado local en Chuncheon, Corea., Las muestras fueron analizadas para detectar la ausencia de bacterias Diana de acuerdo con la norma ISO 7932 (2004). Se preparó una alícuota de 50 g de cada tipo de alimento en una bolsa estéril stomacher de Nasco Whirl-Pak ubicada en WI, Estados Unidos. Los cultivos nocturnos de B. thuringiensis se diluyeron en agua de peptona al 0,5% y se utilizaron para preparar las muestras artificialmente contaminadas con niveles de inoculación de 103 A 105 UFC / g (Chon et al., 2012; Kim et al., 2013). Se transfirió una alícuota de 1 mL de suspensión de muestras de alimentos a un nuevo tubo esterilizado y se utilizó para la extracción de ADN.,
resultados y discusión
detección de B. thuringiensis utilizando el gen cry2
para las 120 cepas, se obtuvieron productos de amplificación de aproximadamente 700 PB utilizando los cebadores cry2 (Tabla 1). Como se muestra en la Tabla 2 y la Figura 1, cuando se utilizó PCR dirigida a cry2, se amplificaron 6 cepas de B. cereus y 36 cepas de B. thuringiensis (72%). Ningún otro grupo de B. cereus o grupo No-B fue amplificado. Esto mostró una precisión del 82% de cry2 para detectar grupos de B. cereus. Para las 120 cepas analizadas, 100 cepas dieron NAs o PAs, lo que indica un porcentaje de precisión general de 83.,3% (Cuadro Complementario 1). Mientras que Riojas et al. (2015) reportaron una PCR múltiple del gen de la péptido sintasa no ribosomal (NRPS) y cry1 para identificar B. cereus y B. thuringiensis con una especificidad de 24.5% en B. cereus y 15% en B. thuringiensis.
la Figura 1. Resultados de PCR convencionales utilizando 2 cebadores (XRE y cry2) dirigidos a 2 genes (reguladores transcripcionales y genes de proteína cristalina) específicos para B. thuringiensis con 120 cepas. (A) son los resultados de PCR de las 120 cepas usando XRE y (B) son los resultados de PCR usando cry-2., Carril m, Escalera de 100 PB; T1-T16 significa el número de tubo de 8 tiras y los detalles de cada carril se muestran en la tabla suplementaria 1.
se ha reportado que la cepa B. thuringiensis puede sintetizar una o más proteínas cristalinas ya que se han encontrado uno o más genes de toxinas cristalinas para B. thuringiensis. La razón principal de la diversidad de genes de toxinas es la transferencia de plásmidos en B. thuringiensis (Adang et al., 2014). Es un proceso frecuente para la transferencia del plásmido por conjugación o movilización (Makart et al., 2017)., Además, los intercambios de genes cry generan B. cereus con una nueva unión de cry que conduce a la similitud de B. cereus y B. thuringiensis (Fiuza, 2015). Además, con una fuente de aislamiento diferente, los genes cry mostraron una diferencia en diversidad y distribuciones. Por ejemplo, se puede encontrar un nuevo gen cry en cada hábitat que muestra una actividad insecticida diferente.
la detección de B. thuringiensis utilizando el gen XRE
se predijo que las secuencias codificantes potenciales (CDS) serían reguladores transcripcionales., CDS contiene un motivo de hélice-vuelta-hélice (HTH) en la familia de proteínas similares a XRE y reguladores transcripcionales de la familia MerR, anteriormente las secuencias de genes XRE correspondientes en pBMB28 de B. thuringiensis YBT-020 y pCT281 de B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, que está relacionado con el regulador transcripcional de tipo HTH, SinR, era idéntico al elemento correspondiente pG9842 de B. cereus G9842 (GenBank: CP001187). Las proteínas HTH, junto con los factores sigma, participan en una amplia gama de vías de señalización, por ejemplo, como represores que inhiben la esporulación (Murawska et al.,, 2014), formación de biofilm (Colledge et al., 2011), y secreción de proteasa (Pflughoeft et al., 2011). Aparte de Cry1Ab21 y δ-endotoxina codificada en el plásmido toxigénico pIS56-63, que son responsables de la conjugación y esporulación (Martínez-Núñez et al., 2010; Deng et al., 2014) además con 53 proteínas putativas codificadas diferentes.
los resultados de PCR con XRE revelaron que ninguno de los 58 B. cereus o no-b dio una amplificación (Tabla 2 y Figura 1). En total, de 50 cepas de B. thuringiensis 47 mostraron resultados positivos (94%). Esto mostró una precisión de 97.,3% de XRE para la detección de B. thuringiensis entre los grupos de B. cereus analizados. Para las 120 cepas analizadas, 117 cepas dieron NAs o PAs, lo que indica un porcentaje de precisión general del 97,5% (tabla suplementaria 1).
curva estándar y eficiencia de amplificación
el ensayo de PCR en tiempo real se realizó utilizando extractos de ADN de los cultivos puros de la cepa ATCC 10792 tipo B. thuringiensis dirigida al gen XRE. El ensayo de PCR en tiempo real desarrollado fue eficiente para detectar concentraciones de 2,6 × 10 a 2,6 × 106 UFC/reacción, que abarcó 6 órdenes de magnitud., La ecuación del número de copia logarítmica versus el valor Ct para B. thuringiensis fue y = -3.853 x+21.244 con un valor R-cuadrado de 0.993, indicando la alta linealidad (Figura 2).
detección de muestras de alimentos enriquecidos
recientemente, se ha reportado la detección de B. thuringiensis en alimentos como leche, frutas frescas y granos que han sido cultivados y cosechados de suelo fuera del país., El consumo de verduras crudas y mínimamente procesadas se considera natural y saludable, pero se han planteado preocupaciones con respecto a los pesticidas químicos residuales en verduras frescas (Chiu et al., 2016). Por lo tanto, los consumidores han vuelto Su interés a las verduras orgánicas (verduras libres de químicos), y se predice que los bio-pesticidas, incluyendo B. thuringiensis, pueden representar el 20% del mercado mundial de pesticidas en 2020 como un sustituto de los pesticidas químicos (Watts y Williamson, 2015)., En este estudio, se evaluó el desempeño de la PCR en tiempo real dirigida a XRE con 3 tipos de muestras de alimentos artificialmente contaminados (lechuga, kimbap y espinacas). Se inocularon cultivos frescos de B. thuringiensis durante la noche en cada muestra de alimento. La PCR en tiempo real pudo detectar con éxito B. thuringiensis a una concentración de 4.8 × 103, 3.4 × 103 y 1.5 × 103 UFC/g en lechuga, kimbap y espinaca, respectivamente (Figura 3). Sin embargo, para las muestras de kimbap, los valores de Ct fueron mayores, ya que generalmente contiene materiales más complejos como salchicha, huevo o zanahoria en comparación con las verduras.,
conclusión
dado que el grupo B. cereus es muy similar en perfiles bioquímicos y genéticos, se desarrolló un nuevo biomarcador para identificar y distinguir a B. thuringiensis del grupo estrechamente relacionado. El rendimiento del XRE se comparó con el gen cry2 y también se probaron muestras contaminadas artificialmente. En comparación con cry2, se observó que el gen XRE era eficientemente preciso en la identificación de B. thuringiensis. Además, la PCR en tiempo real desarrollada utilizando XRE identificó con éxito B., thuringiensis y podría ser utilizado para cuantificar los números de células con la curva estándar generada.
contribuciones del autor
financiación
Este trabajo de investigación fue apoyado por el Ministerio de Agricultura, Alimentos y seguridad de los medicamentos (subvención no.14162MFDS085) de la República De Corea y la Universidad Nacional de Kangwon en 2015. SW agradeció el apoyo financiero del Consejo de Becas de China (CSC No: 201408260054). Los autores agradecen a Hyun-Ah Lee en el laboratorio Central de la Universidad Nacional de Kangwon por el apoyo técnico., RC agradece el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Investigación De Corea (NRF) 2018007551.
Declaración de conflicto de intereses
los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran ser interpretadas como un potencial conflicto de intereses.
Supplementary Material
Drewnowska, J. M., and Swiecicka, I. (2013). Eco – genetic structure of Bacillus cereus sensu lato populations from different environments in Northeastern Poland. PLoS One 8: e80175. doi: 10.1371 / journal.ponga.,0080175
PubMed Abstract / CrossRef Full Text / Google Scholar
ISO 7932 (2004). Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs-horizontal Method for the Enumeration of Presumtive Bacillus cereus – Colony-Count Technique at 30 Degrees C 2004. Ginebra: FAO.
Google Scholar
Murawska, E., Fiedoruk, K., and Swiecicka, I. (2014). Arquitectura genética Modular del plásmido toxigénico pIS56-63 que alberga cry1Ab21 en Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis cepa IS5056. Pol. J. Microbiol. 63, 147–156.,
PubMed Abstract | Google Scholar
Watts, M., and Williamson, S. (2015). Replacing Chemicals with Biology: Phasing Out Highly Hazardous Pesticides with Agroecology. Taiwan: PAN International, 1-210.
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