animales y dietas
Los ratones macho C57BL/6 J (4 semanas de edad, n = 80) fueron comprados al Instituto de ciencias animales de laboratorio, Academia China de Ciencias Médicas (licencia No. SCXK: JING2009-0007) y alojados en una habitación con temperatura controlada (22 ± 2 °C, 40% a 60% de humedad) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas., El Comité de cuidado y uso de animales del Hospital General del PLA chino aprobó todos los procedimientos experimentales.
Los ratones fueron alimentados con una dieta basal (dieta AIN-93G, adquirida de la Academia de ciencias médicas militares) durante la primera semana para la adaptación. Diez ratones fueron elegidos al azar y alimentados con una dieta basal como control normal, y los ratones restantes fueron alimentados con una dieta rica en colesterol (RC) modificada de la dieta AIN-96G. Dos semanas después, se recogieron muestras de sangre del plexo venoso mandibular., Los ratones con niveles séricos de CT que eran 2 desviaciones estándar mayores que el control normal (representando el 67% de los ratones alimentados con la dieta de RC) se asignaron al azar a tres grupos (n = 12 en cada grupo). Cada grupo recibió una dieta diferente durante 16 semanas( Tabla 1): triglicéridos ricos en colesterol y de cadena media (CR-MCT), triglicéridos ricos en colesterol y de cadena larga (CR-LCT) o CR. Nisshin Oillio (Tokio, Japón) donó los MCT (C8:0 y C10:0) y LCTs (triglicéridos de cadena larga, aceite de soja). El colesterol fue adquirido de Sigma-Aldrich (st Louis, MO, USA)., El Instituto de recursos nutricionales de Beijing (Beijing, China) midió la composición de ácidos grasos de las dietas CR-MCT y CR-LCT (Tabla 2). El peso corporal y la ingesta de alimentos fueron monitoreados semanalmente.,
muestreo de sangre ,leumeon, bilis y heces
cinco ratones fueron elegidos aleatoriamente de cada grupo después de 16 semanas de alimentación para registrar la ingesta de dieta y la excreción de heces utilizando jaulas metabólicas separadas durante 3 días., Las heces se liofilizaron, pesaron, pulverizaron y almacenaron a − 80 °C para su posterior análisis. Todos los ratones se ayunaron durante la noche (aproximadamente 12 h) antes de la toma de muestras de sangre de la aorta ventralis bajo anestesia (clorhidrato de xilazina). El suero fue recogido después de la centrifugación de las muestras de sangre. Se utilizó una microcápsula para perforar la pared de la vesícula biliar y extraer la bilis, y cada muestra de bilis se centrifugó a 16.000 g durante 30 min. El sobrenadante se recogió y almacenó a − 80 °C., Íleon tejidos fueron extirpados y lavados con solución salina helada, y las porciones de inmediato fueron almacenadas a -80 °C para su posterior análisis.
la medición de los perfiles lipídicos séricos
la TC y los triglicéridos séricos (TG) se determinaron al final del experimento utilizando kits comerciales de Wako (Osaka, Japón). Se midieron el colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) y el colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) utilizando métodos de sedimentos y un kit comercial de Abcam (Cambridge, Reino Unido). El ácido biliar total sérico (TBA) se midió utilizando un kit comercial de Blue Gene (Shanghai, China)., Se siguieron estrictamente todas las instrucciones del fabricante.
análisis de ácidos biliares en heces y bilis mediante HPLC-MS
los métodos para la preparación y determinación de ácidos biliares en heces y bilis se realizaron de acuerdo con nuestro estudio previo y los informes de Steiner et al. . Se utilizó un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento Shimadzu LC-20 AD (Shimadzu, Kyoto, Japón) acoplado a un espectrómetro de masas Applied Biosystecm 3200 Q TRAP con una fuente de ionización electrospray (ESI) (Applied Biosystems, Carlsbad, EE. Los sistemas de HPLC y MS se controlaron mediante Analyst 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Los materiales mencionados fueron comprados a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Los ácidos biliares primarios, incluyendo CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA y GCDCA, y los ácidos biliares secundarios, incluyendo DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA y GDCA, en bilis y heces fueron determinados por los tiempos de retención.
PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
Las muestras de tejido del intestino delgado (aproximadamente 100 mg) se lavaron con PBS frío y se homogeneizaron. El ARN Total de tejidos y células se aisló utilizando el reactivo Trizol (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, no. R6812). Los cebadores fueron diseñados usando Primer Express 3.,0 software basado en las secuencias de ARNm de una base de Datos (Tabla 3) y sintetizado por Invitrogen (Beijing, China). Los métodos para la extracción de ARN y la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se describen en nuestras publicaciones anteriores. qRT-PCR se realizó utilizando un kit de RT-PCR SYBR® PrimeScript® de un solo paso (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China). La amplificación se realizó utilizando un termociclador BIO-RAD iCycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Los niveles relativos de expresión del ARNm se determinaron utilizando el método de umbral crítico comparativo (TC) (en un tubo separado)., Se utilizó el gen de limpieza β-actina como control para la normalización.
ensayo Western blot
Los análisis Western blot de tejido del intestino delgado y células cultivadas se realizaron como se describió anteriormente . Se prepararon y separaron cantidades equivalentes de proteína de cada muestra utilizando SDS-PAGE (12% geles) seguido de electrotransferencia a membranas de PVDF., Las membranas se incubaron con solución bloqueante (solución salina tamponada Tris, leche seca descremada al 8%) durante 2 h, seguida de incubación con anticuerpos específicos a 4 °C durante la noche. Las membranas se lavaron extensamente en TBST (solución salina Tris-tamponada con Tween, conteniendo 0,5% Tween-20 en TBS) y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante en tbst durante 1 h. las membranas se lavaron más en Tbst y se detectaron bandas utilizando agentes de detección de quimioluminiscencia. Se realizó densitometría de Blot y se analizaron las bandas utilizando el software ImageJ., Se adquirieron anticuerpos contra el transportador apical de ácidos biliares dependientes de sodio (ASBT), la proteína de unión a ácidos biliares ileales (I-BABP) y el transportador de solutos orgánicos α/β (Osta/β) De Abcam (Cambridge, Reino Unido). Se obtuvieron anticuerpos secundarios contra la IgG de cabra de Sun Biomedical Technology Co. (Beijing, China).
inmunofluorescencia
tejido Deleumeon fijado con paraformaldehído tamponado al 4% se incrustó en parafina y se prepararon secciones de 4 µm de espesor. Las secciones fueron desparafinadas y apagadas en H2O2 al 3% durante 15 min para bloquear la peroxidasa endógena., Se lavaron las secciones en PBS y se incubaron con un anticuerpo anti-I-BABP en PBS (dilución 1:50) durante 1 h a 37 °C. Se añadió un anticuerpo conjugado FITC (isotiocianato de fluoresceína) a una dilución 1:50 y se incubó durante 0,5 h a 37 °C. se lavaron las secciones y se utilizó PI (yoduro de propidio) para teñir los núcleos. I-BABP fue fotografiado usando un microscopio de fluorescencia (Bx60, Olympus, Ina, Japón). I-BABP se observó como fluorescencia verde, y el núcleo se observó como Fluorescencia roja .,
cultivo celular Caco-2
La línea celular Caco-2 se obtuvo del Centro de recursos celulares, Peking Union Medical College (que es la sede de la Infraestructura Nacional de recursos de líneas celulares) en Sept. 20, 2016. La PCR y el cultivo confirmaron que la línea celular estaba Libre de contaminación por micoplasma. El origen de especie de estas células se confirmó mediante PCR. La identidad de la línea celular fue autenticada usando perfiles STR (FBI, CODIS) . Todos los resultados están disponibles en el sitio web (http://cellresource.cn)., Las células Caco – 2 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales. Las células Caco – 2 se mantuvieron a 37 °C En una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2 y 95% de aire. El medio se cambiaba cada 2 días. El DMEM, el FBS, los aminoácidos no esenciales al 1% y otros materiales se compraron en la Infraestructura Nacional de Cell Line Resource (Beijing, China) o Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, EE. UU.).,
ensayo de permeabilidad del ácido caprílico a través de monocapas de células Caco-2
para experimentos de reabsorción de ácidos biliares, en referencia al informe de Y. Wang, et al. , las células se sembraron y crecieron en Insertos de cultivo celular colgantes Millicell (0.4 µm, Millipore, Molsheim, Francia) durante 21 días para obtener monocapas celulares confluentes y altamente diferenciadas. La formación de monocapas epiteliales funcionales se monitorizó mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) utilizando un medidor de Millicell-XT (Millipore) antes de los experimentos., La morfología celular se observó con un microscopio electrónico y la permeabilidad se determinó con el amarillo Lucifer (Sigma, MO, USA) como marcador.
la preparación de ácidos grasos y CA se realizó según lo descrito por X. Zhang, et al. . Los ácidos grasos y el CA se midieron y disolvieron en etanol, luego se diluyeron con medio de cultivo celular que contenía 20 mg/L de ASC libre de endotoxinas a una concentración final de 50, 100 o 200 µmol/L (etanol< 0,1%). Los ácidos grasos disueltos y el CA se incubaron en un baño de agua a 37 °C durante 1 h antes de la adición a las células., El ácido caprílico (C8:0), ácido cáprico (C10:0), esteárico (C18:0) y ácido oleico (C18:1) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (st Louis, MO, USA).
los lados apical (AP) y basolateral (BL) de la monocapa se lavaron con la solución salina equilibrada de Hank (Hbss) y se equilibraron en medio completo libre de suero durante 15 min. El medio en el PA se sustituyó por medio fresco que contenía CA (200 µmmol / L) o se mezcló con uno de los ácidos grasos (C8:0, C10:0, C18:0 o C18:1) a 50, 100 o 200 µmol/l., La viabilidad celular de las células Caco-2 en diferentes condiciones se evaluó mediante el ensayo de citotoxicidad celular WST-1 (Fig. 1). El medio con uno de los ácidos grasos se definió como el»grupo C8:0, C10:0, C18:0 o C18:1″. El » grupo control «no contenía ácidos grasos, y el» grupo en blanco » carecía de CA y ácidos grasos. Solo se utilizó medio fresco en el BL. Los medios de los lados AP Y BL se retiraron 2 h más tarde y se almacenaron para el análisis de CA utilizando HPLC-MS., La permeabilidad aparente (Papp) se calculó utilizando la siguiente ecuación: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ es la apariencia del compuesto en el compartimiento receptor, dt es el tiempo, C0 es la concentración en el compartimiento donante y A es el área de superficie del inserto).
la viabilidad Celular de las células Caco-2 en diferentes condiciones., Porcentaje de viabilidad celular = do en el grupo experimental /do en el grupo control× 100%
los niveles de expresión de I-BABP en células Caco-2
las células Caco-2 se sembraron en una placa de 6 pocillos (Corning, NY, ee .i-babp. El medio de cultivo fue reemplazado antes de los experimentos con medio que contenía FBS delipidizado durante 24 h., Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato helado (PBS) y se incubaron con medio fresco que contenía CA a 200 µmol/L (definido como el grupo CA) o CA mezclado con uno de los ácidos grasos (C8:0, C10:0, C18:0 o C18:1) a 200 µmol/L (definido como el «grupo C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA o C18:1+CA») o C8:0 o C10:0 a 200 µmol/l sin CA (definido como «grupo C8:0 y grupo C10:0») durante 24 h. y el grupo en blanco fue sin ácidos grasos y ca. El medio fue removido y las células fueron lavadas tres veces con PBS heladas., Se aislaron ARN y proteínas totales y se recolectaron para análisis adicionales de los niveles de expresión de proteínas y ARNm de I-BABP.
análisis estadístico
todos los datos se expresan como media ± de. Los datos se analizaron mediante el análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba t independiente para determinar la significación de la diferencia entre los grupos utilizando el programa SPSS versión 17.0. P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
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