Proteínas integrales de membrana

Las proteínas integrales de membrana (IMP) actúan como puertas de entrada a las células. Todas las células y orgánulos están encerrados en una bicapa lipídica impermeable y los DIPS que estudiamos están incrustados en estas membranas. Son las vías de entrada y salida de muchos iones, nutrientes, productos de desecho, hormonas, medicamentos y grandes moléculas como proteínas y ADN. También son responsables de gran parte de la comunicación entre las células y su entorno., Las células pueden producir una gran variedad de estas proteínas, aproximadamente el 30% de los genes en el genoma humano codifican proteínas de membrana, y sin embargo sabemos relativamente poco sobre estas moléculas.

Las proteínas de membrana son desafortunadamente notoriamente difíciles de manejar y estudiar, ya que están diseñadas para sentarse dentro del entorno hidrofóbico de la bicapa lipídica. Tienden a ser inestables cuando se extraen de su entorno nativo y tenemos que añadir detergentes para cubrir la superficie hidrofóbica., Para entender y controlar la función de estas proteínas es esencial tener información sobre su estructura tridimensional, que generalmente se obtiene por cristalografía de rayos X. Sin embargo, la dificultad de manejar estas proteínas ha hecho difícil resolver las estructuras, y hasta la fecha hay menos de 300 estructuras de proteínas de membrana conocidas, menos del 0,5% de todas las estructuras conocidas. Para los eucariotas superiores la historia es aún más cruda, con solo 20 estructuras de diablillos humanos y menos de 50 Diablillos mamíferos resueltos., Las proteínas de membrana son, por lo tanto, una de las fronteras restantes más importantes de la investigación en biología estructural. En el SGC ahora estamos aplicando nuestros métodos de alto rendimiento de última generación para superar los cuellos de botella en la investigación de proteínas de membrana, de modo que podamos entregar de manera confiable muestras de proteínas de membrana puras y estructuras de estas moléculas fascinantes y médicamente críticas.

importancia médica

la importancia médica de esta enorme familia de proteínas no puede ser sobreestimada., Las mutaciones en las proteínas de membrana están involucradas en muchas enfermedades comunes, incluyendo enfermedades cardíacas, donde los canales iónicos que funcionan mal a menudo están implicados. Los medicamentos dirigidos a los canales de calcio pueden controlar problemas como la presión arterial alta y la angina de pecho. Las proteínas de membrana están involucradas en el cáncer, donde los errores en las vías de señalización pueden llevar a que las células se dividan sin control. A menudo, las proteínas de membrana específicas se producen en exceso en las células cancerosas y, por lo tanto, son objetivos para la terapia farmacológica. Las enfermedades del cerebro como la migraña, la depresión y el Alzheimer están relacionadas con problemas con los transportadores y canales., La fibrosis quística es causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) que codifica un canal de iones cloruro.

dado que muchas proteínas de membrana se encuentran en la superficie de las células, están fácilmente disponibles para medicamentos de moléculas pequeñas que circulan en la sangre. Por lo tanto, no es sorprendente que más del 50% de los medicamentos de moléculas pequeñas se unan a proteínas de membrana. Los receptores y canales acoplados a la proteína G son particularmente importantes en este sentido, pero los transportadores ABC y los transportadores de solutos también son objetivos para la terapia farmacológica., Nuestra comprensión de muchas otras enfermedades, y nuestra capacidad para tratar estas enfermedades se beneficiarían enormemente de una información más estructural y funcional sobre las proteínas involucradas. Esperamos que al resolver las estructuras de estas proteínas, comprender la bioquímica subyacente y las interacciones con sustratos e inhibidores, podamos proporcionar tratamientos más efectivos para muchas enfermedades.

el SGC y las proteínas integrales de membrana

el SGC tiene una amplia experiencia en la solución de estructuras de proteínas humanas solubles utilizando sistemas altamente eficientes y de alto rendimiento., En los últimos dos años hemos adaptado estos métodos para resolver estructuras de proteínas de membrana humanas. Hemos analizado 186 proteínas de membrana humanas de diversas familias, seleccionando una serie de constructos para cada proteína, identificando detergentes adecuados para la purificación y luego escalando el purificaiton y cristalizando estas proteínas. Hemos cristalizado 3 proteínas de membrana y resuelto nuestra primera estructura, un proceso que tardó menos de dos años desde el primer clon hasta la estructura.,

hemos resuelto la primera estructura de un transportador ABC humano, una clase de proteínas que están involucradas en el transporte de moléculas pequeñas, la resistencia a múltiples medicamentos y enfermedades como la fibrosis quística y la diabetes. Nuestro primer objetivo exitoso es el transportador ABC mitocondrial humano, ABCB10, que está incrustado en la membrana interna de las mitocondrias. ABCB10 se sobreexpresa durante la diferenciación eritroide, el proceso que forma los glóbulos rojos. se sobreexpresa en la médula ósea, el corazón y el hígado., Ahora hay evidencia de que cuando la expresión de ABCB10 se reduce en las células, son más susceptibles al estrés oxidativo y que ABCB10 puede estar involucrado en la protección del corazón durante un ataque cardíaco.

tecnologías para el estudio de IMPs

estamos desarrollando métodos genéricos que permiten la determinación de alto rendimiento de estructuras de proteínas de membrana humanas. Seleccionamos el sistema de expresión celular de baculovirus / insecto que proporciona una composición lipídica cercana a la de las células humanas y es una plataforma de alto rendimiento probada., Para cada proteína objetivo generamos una serie de construcciones de longitud variable y diferentes etiquetas de afinidad, incluido el gen de longitud completa y una serie de truncamientos para eliminar regiones potencialmente desordenadas. Una pantalla de expresión de alto rendimiento se utiliza para identificar proteínas que se pueden utilizar para purificar cantidades de miligramos de IMPS para la cristalización. Cada proteína se purifica inicialmente en detergente dodecyl maltoside (DDM) y posteriormente se analiza su estabilidad en una serie de detergentes diferentes para identificar las condiciones óptimas de estabilidad y cristalización.,

hemos establecido métodos para la cristalización de nanodrop de alto rendimiento y la manipulación de cristales de proteínas de membrana frágiles. Hemos desarrollado sistemas eficientes para el cribado de cristales de proteínas de membrana para la calidad de difracción como método para la optimización de la condición de cristalización. También hemos optimizado nuestra recopilación de datos y análisis de datos de difracción utilizando líneas de haz de microfoco sincrotrón intensas, disponibles en recursos como Diamond Light Source Ltd, en Oxfordshire., Siempre que es posible, la cristalización se realiza con ligandos Unidos e inhibidores para capturar una sola conformación nativa y proporcionar información clave sobre la función y el diseño del fármaco. También planeamos generar fragmentos de anticuerpos contra nuestras proteínas purificadas para su uso como reactivos de afinidad y ayudas de cristalización.