keski-rasvahappoja, vähentää seerumin kolesteroli kautta vähentää suolen sappihappojen takaisinimeytymistä C57BL/6J hiiriä

Eläimet ja ruokavalion

Uros C57BL/6 J hiiret (4 viikkoa vanha, n = 80) oli ostanut Institute of Laboratory Animal Science, Kiina Academy of Medical Sciences (Lisenssi Nro. SCXK: JING2009–0007) ja sijoitettu lämpötila-ohjattu huone (22 ± 2 °C, 40% 60% kosteus) 12-h valo/pimeä sykli., Kiinalaisen PLA General Hospitalin Eläinten hoito-ja Käyttökomitea hyväksyi kaikki kokeelliset toimenpiteet.

hiirille syötettiin ensimmäisen viikon aikana sopeutumista varten perusruokavalio (Ain-93G-dieetti, ostettu Sotilaslääketieteen Akatemiasta). Kymmenen hiirtä valittiin satunnaisesti ja niille syötettiin perusruokavalio normaalina kontrollina, ja jäljelle jääneille hiirille syötettiin Ain-96G-ruokavaliosta muunnettua kolesterolipitoista (CR) ruokavaliota. Alaleuan laskimopunoksesta otettiin verinäytteet kaksi viikkoa myöhemmin., Hiiret, joiden seerumin TC tasoa, jotka olivat 2 keskihajontaa suurempi kuin normaali ohjaus (osuus 67% hiirillä ruokittu CR ruokavalio) satunnaistettiin kolmeen ryhmään (n = 12 kussakin ryhmässä). Jokainen ryhmä oli ruokittu eri ruokavalio 16 viikkoa (Taulukko 1): runsaasti kolesterolia ja keskipitkän ketjun triglyseridejä (CR-MCT), runsaasti kolesterolia ja pitkäketjuisten triglyseridien (CR-LCT) tai CR. Nisshin Oillio (Tokio, Japani) lahjoitti MCTs (C8:0 C10:0) ja LCTs (pitkäketjuiset triglyseridit, soijapapu öljy). Kolesteroli ostettiin Sigma-Aldrichiltä (St. Louis, MO, USA)., Beijing Institute of Nutrition Resources (Peking, Kiina) mittasi CR-MCT-ja CR-LCT-ruokavalioiden rasvahappokoostumuksia (Taulukko 2). Ruumiinpainoja ja ruoan saantia seurattiin viikoittain.,

Veri, sykkyräsuoli, sapen ja ulosteiden näytteenotto

Viisi hiiret valittiin satunnaisesti kustakin ryhmästä 16 viikon jälkeen ruokinta tallentaa ruokavalio saanti ja erittyminen ulosteeseen käyttämällä erillistä aineenvaihdunnan häkeissä 3 päivää., Uloste kylmäkuivattiin, punnittiin, jauhettiin ja säilytettiin − 80 °C: ssa lisäanalyysia varten. Kaikki hiiret olivat paastonneet yön yli (noin 12 tuntia) ennen verinäytteen kokoelma aortan ventralis anestesiassa (ksylatsiini hydrochloride). Seerumi kerättiin verinäytteiden sentrifugoinnin jälkeen. A mikrokapselin käytettiin punktio sappirakon seinä ja pura sappi, ja jokainen sappi näyte sentrifugoidaan 16000 g, 30 min. Supernatantti kerättiin ja säilytettiin − 80 °C: ssa., Ileum-kudokset poistettiin ja huuhdeltiin jääkylmällä suolaliuoksella, ja annokset säilytettiin välittömästi − 80 °C: ssa lisäanalyysia varten.

seerumin rasva-profiilit

Seerumin TC ja triglyseridien (TG) määritettiin lopussa kokeilu käyttämällä kaupallisia sarjat Wako (Osaka, Japani). Korkean tiheyden lipoproteiini-kolesterolin (HDL-C) ja low-density lipoproteiini-kolesteroli (LDL-C) mitattiin käyttäen sedimentin menetelmiä ja kaupallinen pakki Abcam (Cambridge, UK). Seerumin kokonaissapehappo (TBA) mitattiin Blue geenin (Shanghai, Kiina) kaupallisella pakkauksella., Kaikkia valmistajan ohjeita noudatettiin tiukasti.

Analyysi sappihappoja ulosteeseen ja sappi käyttäen HPLC-MS

menetelmät valmistamiseksi ja päättäväisyyttä sappihappojen ulosteeseen ja sappi suoritettiin mukaan edellinen tutkimus ja raportit Steiner et al. . A Shimadzu LC-20 AD korkean suorituskyvyn nestekromatografia-järjestelmä (Shimadzu, Kioto, Japani) on kytketty Sovellettu Biosystecm 3200 K ANSA massaspektrometri, jolla on electrospray ionisaatio (ESI) lähde (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) käytettiin. HPLC-ja MS-järjestelmiä ohjattiin analyytikko 1.4: n avulla.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Edellä mainitut materiaalit ostettiin Sigma-Aldrichiltä (St. Louis, MO, Yhdysvallat). Ensisijainen sappi hapot, mukaan lukien CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA ja GCDCA, ja sekundaarisia sappihappoja, mukaan lukien DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA ja GDCA, sappeen ja ulosteet olivat määräytyy retentioajat.

Kvantitatiivinen real-time PCR (qRT-PCR)

Näytteet ohutsuolen kudoksen (noin 100 mg) pestiin jääkylmällä PBS: llä ja homogenoitu. Kudosten ja solujen kokonais-RNA eristettiin Trizol-reagenssilla (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, no. R6812). Primerit suunniteltiin Primer Express 3: lla.,0 ohjelmisto, joka perustuu mRNA-sekvensseihin tietokannasta (Taulukko 3) ja jonka syntetisoi Invitrogen (Peking, Kiina). RNA-uuttamisen ja kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR: n (qRT-PCR) menetelmät on kuvattu aiemmissa julkaisuissamme. qRT-PCR suoritettiin yhdellä askeleella SYBR ® PrimeScript ® RT-PCR Kit (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Kiina). Monistus suoritettiin käyttäen BIO-RAD iCycler Thermal Cycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Suhteellinen mRNA-lauseketaso määritettiin vertailevan kriittisen kynnysarvon (Ct) menetelmällä (erillisessä putkessa)., Taloudenhoidon geeniä β-Actinia käytettiin normalisoinnin säätelynä.

Western blot määritys

Western blot-analyysit ohutsuolen kudosta ja viljellyt solut suoritettiin edellä kuvatulla tavalla . Vastaavia määriä proteiinia kustakin näytteestä valmistettiin ja erotettu käyttäen SDS-PAGE (12% geelit), jonka jälkeen electrotransfer, jotta PVDF-kalvoja., Kalvot olivat inkuboitiin esto-ratkaisu (Tris-buffered saline, 8% rasvattoman maidon kuiva) 2 h jonka jälkeen inkubaation spesifisten vasta-aineiden 4 °C yön yli. Kalvot pestiin laajasti TBST (Tris-buffered saline kanssa Tween, joka sisältää 0,5% Tween-20 TBS) ja inkuboitiin piparjuuri peroksidaasi-konjugoitu toissijainen vasta-aineita TBST 1 h. Kalvot pestiin edelleen TBST, ja bändit olivat havaita käyttämällä kemiluminesenssia havaitseminen aineita. Blot densitometria suoritettiin, ja yhtyeet analysoitiin ImageJ-ohjelmiston avulla., Vasta-aineita, jotka apical sodium-dependent bile acid transporter (ASBT), ohutsuolen sappihappoja sitova proteiini (I-BABP) ja orgaanisen liuenneen aineen transporter α/β (Osta/β) oli ostanut Abcam (Cambridge, UK). Toissijaisia vasta-aineita vuohen IgG: tä vastaan saatiin Sun biolääketieteellisestä Technology Co: sta. (Peking, Kiina).

Immunofluoresenssi

Sykkyräsuoli kudos, kiinteä 4% puskuroitu paraformaldehydi oli upotettu parafiini, ja 4-µm paksu osat olivat valmiita. Osat poistuivat ja sammuivat 3% H2O2: ssa 15 minuutin ajan endogeenisen peroksidaasin estämiseksi., Osat pestiin PBS: llä ja inkuboitiin anti-en-BABP vasta-PBS: llä (1:50 laimennus) 1 h 37 °C. FITC-konjugoitu (fluoreseiini-isotiosyanaatti) vasta-aine lisättiin 1:50 laimennus-ja inkuboitiin 0, 5 h 37 °C. Osiot olivat pestään, ja PI (propidium jodidi) käytettiin tahra ytimet. I-BABP kuvattiin fluoresenssimikroskoopilla (BX60, Olympus, Ina, Japani). I-BABP havaittiin vihreä fluoresenssi, ja ydin oli havaittu punainen fluoresenssi .,

Bagle-2 cell culture

Bagle-2 solulinja oli saatu Solun Resource Center, Pekingin Unionin Medical College (joka on päämaja Kansallisen Infrastruktuurin Solu Line Resource) Sept. 20, 2016. PCR ja kulttuuri vahvistivat, että solulinja tarkastettiin ilman mykoplasma-kontaminaatiota. Näiden solujen alkuperä vahvistettiin PCR: llä. Solulinjan henkilöllisyys varmistettiin STR-profiloinnin (FBI, CODIS) avulla . Kaikki tulokset löytyvät verkkosivuilta (http://cellresource.cn)., Bagle-2-solut viljeltiin vuonna Dulbecco ’ s modified Eagle medium (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% penisilliini-streptomysiiniä, ja 1% ei-välttämättömiä-aminohappoja. Caco-2-soluja säilytettiin 37 °C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO2-ja 95% ilmaa. Medium vaihdettiin 2 päivän välein. Se DMEM, FBS, 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, ja muita materiaaleja ostettiin Kansallisen Infrastruktuurin Solu Line Resurssi (Peking, Kiina) tai Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).,

Kapryylihappo läpäisevyyden määritys kautta Bagle-2 solujen monolayers

Varten sappihappoja reabsorption kokeiluja, viitaten raportin Y. Wang, et al. solut olivat kylvetään ja kasvatetaan Millicell Roikkuu Cell Culture Insertit (0,4 µm, Milliporen, Molsheim, Ranska) 21 päivää saada yhtenäisiksi ja hyvin eriytynyt solu monolayers. Muodostumista toiminnallinen epiteelin monolayers seurattiin kautta mittaus transepithelial electrical resistance (TEER) käyttäen Millicell-ERS-mittari (Milliporen) ennen kokeita., Solumorfologia havaittiin elektronimikroskoopilla, ja läpäisevyys määritettiin Lucifer Yellow ’ n (Sigma, Mo, USA) avulla merkkiaineena.

rasvahappojen ja CA: n valmistuksen suoritti X. Zhang, et al. . Rasvahappoja ja CA mitattiin ja liuotettiin etanoliin, sitten olivat laimentaa solujen kasvatusliuosta, joka sisältää 20 mg/L endotoksiinin-ilmainen BSA lopulliseen pitoisuuteen 50, 100 tai 200 µmol/L (etanoli< 0.1%). Liuenneet rasvahapot ja CA inkuboitiin vesihauteessa 37 °C: ssa 1 tunnin ajan ennen solujen lisäämistä., Kapryylihappo (C8:0) ja kapriinihapon (C10:0), steariinihappo (C18:0) ja öljyhapon (C18:1) on hankittu Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

apikaalisella (AP) ja basolateral (BL) puolin yksikerroksista pestiin Hank ’ s Balanced Salt Solution (hankin puskuroitu suolaliuos, hbss) ja tasapainotettu seerumin vapaa-täydellinen keskipitkän 15 min. Keskipitkän AP vaihdettiin tuore medium-sisältää CA (200 µmmol/L) tai sekoittaa yksi rasvahappoja (C8:0 C10:0, C18:0 tai C18:1) 50, 100 tai 200 µmol/L., Solujen elinkelpoisuuden Bagle-2 soluista eri olosuhteissa arvioitiin WST-1 solu sytotoksisuuden määritys (Fig. 1). Keskipitkän yksi rasvahappoja oli määritelty ”C8:0 C10:0, C18:0 tai C18:1-ryhmä”. ”Verrokkiryhmässä ”ei ollut lainkaan rasvahappoja, ja” tyhjästä ryhmästä ” puuttuivat CA-ja rasvahapot. BL: ssä käytettiin vain tuoretta väliainetta. Media AP ja BL puolin poistettiin 2 h myöhemmin ja varastoidaan, analysoidaan CA käyttäen HPLC-MS, Näennäinen permeabiliteetti (Papp) laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ on yhdiste, ulkonäkö vastaanotin osasto, dt on aika, C0 on pitoisuus luovuttajan osastoon, ja A on pinta-ala lisää).

I-BABP ilmaisun tasoa Bagle-2-solut

Bagle-2-solut ympättiin osaksi 6-kuoppalevyn (Corning, NY, USA) ja viljellyt yhteensä yhtymäkohdassa korkea eriyttäminen vahvistaa vaikutuksia MCFAs I-BABP . Elatusaine vaihdettiin ennen kokeiluja medium sisältää delipidized FBS 24 h., Solut pestiin jääkylmällä fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta (PBS) ja inkuboitiin tuoretta keskipitkän, jotka sisältävät CA-200 µmol/L (määritelty CA-ryhmä) tai CA sekoitetaan yksi rasvahappoja (C8:0 C10:0, C18:0 tai C18:1) 200 µmol/L (määritelty ”C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA tai C18:1+CA-ryhmän”) tai C8:0 tai C10:0 200 µmol/L ilman CA (määritelty ”C8:0 ryhmä ja C10:0 konserni”) 24 s. Ja tyhjä ryhmä oli ilman rasvahappoja ja CA. Väliaine poistettiin, ja soluja pestiin kolme kertaa jääkylmillä PBS: llä., Total RNA ja proteiini eristettiin ja kerätään edelleen analyysit I-BABP mRNA: n ja proteiinien ilmentymisen tasoilla.

tilastoanalyysi

kaikki tiedot ilmaistaan keskiarvona ± SD. Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä ja sen jälkeen riippumattomalla t-testillä SPSS-ohjelmistoversiota 17.0 käyttävien ryhmien välisen eron merkityksen määrittämiseksi. P < 0, 05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.