Rajoja Mikrobiologian

Johdanto

Bacillus thuringiensis ja muut 7 lajien itiöitä muodostava Gram-positiiviset bakteerit, kuten B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, ja B. mycoidesare, ovat ensisijaisesti havaita maaperässä. Koska nämä bakteerit ovat hyvin samankaltaisia genotyyppi ja fenotyyppi, bakteerit luokitellaan B. cereus-ryhmän taksonomia (Park et al., 2007). B., cereus ja B. thuringiensis ovat hyvin havaittavissa elintarvikkeita, koska ne havaitaan raaka-aineet maatalouden maaperän viljelyn aikana ja jakelu. Lisäksi näitä kahta bakteeria ei yleensä syrjitä kliinisessä diagnostiikassa. B. cereus on toinen riski ensisijainen ryhmä elintarvikeperäisten sairauden tuoreita maataloustuotteita, ja sen saastuminen on yksi suurimmista ongelmista, vihanneksia (Felício et al., 2015). Erityisesti B., thuringiensis käytettiin torjunta-aineiden viljely tiettyjä kasveja, ja se on tunnettu mikrobien hyönteisten, joita on käytetty vähentää kemiallisten torjunta-aineiden (Azmi et al., 2015).

B. thuringiensis tuottaa hyönteisiä proteiineja, jotka ovat pääasiallinen Kiteinen (Itkeä) proteiinit (Kutasi et al., 2016). Vastaavasti aktiivisesti kasvavat vegetatiiviset solut, joilla ei ole kidetuotantoa, johtavat myrkyttömiin vaikutuksiin. Δ-endotoksiinit sisältävät pääasiassa Sytolyyttisiä (Cyt) ja Cry (Elleuch et al., 2015; Rao et al., 2015)., Kuitenkin, Cyt ja Itkeä hallussaan eri järjestyksessä homologies vaikka ne koostuvat samanlaisia vaikutustavat kohti solun hajoaminen, joka aiheuttaa pysyviä vaurioita hyönteisten midgut (Adang et al., 2014).

rakenteellinen vaihtelu neljä δ-endotoksiinit (Cry1, Cry2, Cry3, ja Cyt2Ah) havaittiin X-ray crystallography (Dehury et al., 2013). Nämä geenit tunnistetaan siirtogeenisestä puuvillasta ja muista kasviksista, jotka torjuvat tuholaisia huomattavasti., Suunnittelu biomarkkeri käännetty tuote vaihtelee eri itkemään proteiinia; näin ollen, havaitseminen on monimutkainen. 16S rRNA geenisekvenssien perusteella universaaleja alukkeita osoitti korkea samankaltaisuus (>99%) indeksi välillä, B. cereus ja B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), jota ei voida luokitella geneettisillä ja fenotyyppisillä määrityksillä (Peng et al., 2015). Vuodesta 2000 lähtien on keskusteltu myös siitä, pitäisikö koko B. cereus-ryhmää kohdella monimuotoisten bakteerien (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz ja Marjańska, 2017). Siellä on myös ehdotuksia, jotka phylogeny nämä bakteerit paremmin sopii niiden ekologiset ominaisuudet (psychrotolerance, virulenssi) kuin taksonominen kuuluminen (Drewnowska ja Swiecicka, 2013; Bartoszewicz ja Marjańska, 2017). Tämän ongelman ratkaisemiseksi, kohdistimme XRE havaita B. thuringiensis, joka ohjaa tärkein tyyppi crystal proteiinin tuotantoa.

nämä kaksi bakteeria ovat biokemiallisissa tuloksissa hyvin samankaltaisia (Böhm ym., 2015), ja geneettisiä ominaisuuksia (Osman et al., 2015). Cho et al., (2015) kertoi myös, että näiden bakteerien geneettiset ja fenotyyppiset ominaisuudet ovat tuskin erotettavissa toisistaan. Lisäksi Pfrunder et al. ilmoitettu, että B. cereus – ryhmän lajeja ei voida luotettavasti tunnistaa klassisen biotyypin (Pfrunder et al., 2016). Näiden perusteella biokemialliset kokeet eivät välttämättä riitä erilaistumiseen. Sen sijaan, läsnäolo hyönteisiä crystal proteiinia käytettiin erottaa ominaisuus erottaa nämä bakteerit (Ekino ym., 2014; Wei et al., 2018).,

osa näitä kahta bakteeria erottavista tekijöistä perustuu niiden patogeenisuuteen näytteissä. B. cereus aiheuttaa maha-suolikanavan häiriö, kun taas B. thuringiensis on ollut mukana myös epidemioita ripuli. Kuten on raportoitu, B. thuringiensiksen tunnusmerkki on Cry-geenien (Osman et al., 2015; Albright ym., 2016). Koska tunnistusmenetelmä, jossa biomarkkeria käytetään erottamiseen B., cereus-ryhmä on monimutkainen ja aikaa vievä, erittäin tehokas biomarkkeri on kiireellisesti korvata aiemmat, joka antoi alempi hyötysuhde ja joskus jopa osoitti vääriä tuloksia. Perustuu kaksi erityisiä geenejä, transkription säädin ja crystal proteiini geenit B. thuringiensis (Porcar ja Juarez-Pérez, 2003; Han et al., 2006), nykyinen tutkimus suoritettiin tarkastaa ja vertailla tehokkuutta suunniteltu biomarkkeri (XRE), että nykyisten crystal protein marker (cry2) tunnistamisessa B. thuringiensis B. cereus-ryhmän kantoja (Bcg) ja ei-B., cereus – ryhmän kannat (Ei-B) elintarvikkeissa. Cry2 on yleisin kideproteiini läsnä B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma ym., 2014).

Materiaalit ja Menetelmät

Bakteerien Kulttuurien Valmistelu

Kaikki 120 kantoja, mukaan lukien 111 Bcg ja 9 ei-B, oli saatu bakteeri-kokoelmat yhdysvallat ja Etelä-Korea (Täydentävä Taulukko 1). Kokoelmista B. thuringiensis ATCC 10792 (tyyppikanta) käytettiin perinteisen PCR: n ja reaaliaikaisen PCR: n kokeellisten olosuhteiden optimointiin., Kaikki kannat olivat sulatetaan huoneenlämmössä (25°C) ja siveltiin ravinteiden agaria (Difco, MI, yhdysvallat). Kun viljellään 24 h-35°C inkubaattorissa, puhdas siirtomaa oli valittu ja istutettu vuonna tryptisten soija-lientä (Difco, MI, yhdysvallat) ja yön yli kulttuureissa käytettiin myöhemmissä kokeissa.

Pohjamaali Suunnittelu ja DNA: n Eristäminen

vastaava pohjamaalit kohdistaminen XRE oliko B., thuringiensis (Taulukko 1) oli suunniteltu mukaan seuraavassa järjestyksessä Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Geeni – 3664610-3665047) käyttäen Primer Express® – Ohjelmiston (Versio 3.0.1) Applied Biosystems sijaitsee CA, yhdysvallat ja syntetisoida Bioneer Corporation Daejeon, Korea. Suunnitellun xren suorituskykyä verrattiin cry2: een (Ben-Dov et al., 1997). Jälkeen 24 h rikastus TSB, määräosa 1 mL bakteerit joutui genomista DNA: n uutto käyttäen PrepMan® Ultra Sample Preparation Reagent (Applied Biosystems, CA, yhdysvallat)., DNA-pitoisuudet mitattiin Eppendorf BioSpectrometer® fluoresenssi (Eppendorf, Hampuri, Saksa) ja säätää 10 ng/µL. DNA-näytteet säilytettiin -20°C: ssa ennen käyttöä.

Perinteiset PCR-ja Real-Time PCR-Määritys

perinteisen PCR valmistettiin C1000 TouchTM Thermal Cycler alkaen Bio-Rad sijaitsee Hemel Hempstead, Yhdistynyt Kuningaskunta., Reaktio putki PCR käyttää Accu-Power® Pyro Hot Start Taq-PCR-Pre-Mix Bioneer Corporation sijaitsee kohteessa Daejeon, Korea ja tilavuus on 20 µL, josta 1 µL kutakin aluketta (10 pmoL/µL) ja 2 µL DNA: ta. Vahvistus ehtoja perinteisen PCR transkription säädin (XRE) olivat: alkudenaturaatio 95°C 5 min, jonka jälkeen 35 denaturaatio 95°C 30 s, hehkutus-49°C: ssa 30 s ja pidennys 72°C 30 s, ja lopullinen pidennys 72°C 5 min., Monistuksia edellytykset crystal proteiinia (Cry 2) olivat: alkudenaturaatio 95°C 5 min, jonka jälkeen 35 denaturaatio 95°C 30 s, hehkutus-55°C: ssa 30 s ja pidennys 72°C 1 min, ja lopullinen pidennys 72°C 5 min. Kun DNA-lisäyksiä, 1.5% (W/V) agaroosi geeli, liuos, joka sisältää RedsafeTM nukleiinihapon Ratkaisu On 20 000 × (Introni Biotekniikka, Inc.) valmistettiin ja geelielektroforeesi suoritettiin käyttämällä Bio-Rad-mallin 192 mukaista Alikennomallia Hemel Hempsteadissa, Yhdistyneessä kuningaskunnassa., Bändit visualisoitiin Smart View Pro UVCI-1100 Imager system-järjestelmällä Major Science sijaitsee CA, Yhdysvallat. Tarkkuus (AC) käytettiin arvioimaan PCR-menetelmällä käyttäen alukkeita XRE ja cry2 havaitsemisessa B. thuringiensis alkaen Bcg-ja ei-B. Negatiivinen sopimuksen (NA) tarkoittaa samaa negatiivinen tulos ei-B. thuringiensis käyttäen PCR kanssa XRE ja cry2. Positiivinen sopimus (pa) tarkoittaa samaa positiivista tulosta B. thuringiensikselle käyttäen PCR: ää XRE: n ja cry2: n kanssa. Tarkkuus (AC) mitataan seuraavalla yhtälöllä, AC = ×100% (Ma ym., 2014).,

reaaliaikaiset PCR-kokeet suoritti StepOneTM-reaaliaikainen PCR-järjestelmä sovelletuista Biosysteemeistä, jotka sijaitsevat CA: ssa, Yhdysvalloissa. Reaktion tilavuus on 20 µL, joka koostuu 10 µL Sulaa DoctorTM High Resolution Melting (HRM) Master Mix, 2 µL DNA: ta, 0.5 µL F/R-aluke (10 pmoL/µL) (Taulukko 2). Vahvistus ehtoja qPCR olivat: alkudenaturaatio 95°C: ssa 10 min ja 40 sykliä 95°C 15 s ja 60°C 1 min. Sitten myöhemmin sulaa käyrä analyysi, lämpötila oli asetettu nostaa 60-95°C 0,3°C/sykli testin spesifisyys pohjamaali.,

Arvioinnin Real-Time PCR-Määritys

suorituskyky XRE ja cry2 arvioitiin käyttäen 50 B. thuringiensis kantoja, vaikka yksinoikeus testattiin 70 ei-kohde bakteereja, mukaan lukien 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg, ja 9 ei-B (Chelliah et al., 2017). Standardisuoran tehtiin käyttäen 10-kertaisia laimennoksia DNA uutetaan B. thuringiensis ATCC 10792., DNA-pitoisuudet olivat säätää 10 ng/µL 100 fg/µL, mikä vastaa 2,6 × 106 2,6 × 10 PMY, ja lisäyksiä tehtiin real-time PCR kanssa triplicates. Negatiivisissa kontrolleissa käytettiin tislattua vettä. Negatiivisia tuloksia tai ei vahvistusta käyrät katsottiin, kun syklin raja-arvon (Ct) – arvot olivat yli 40.

Havaitseminen B. thuringiensis vuonna Terästettyä Ruokaa Näytteitä

Salaattia (Lactucasativa), Kimbab, ja pinaatti (Spinaciaoleracea) ostettiin paikallisesta markkina-Chuncheon, Korea., Näytteet tutkittiin kohde-bakteerien puuttumisen varalta ISO 7932-standardin (2004) mukaisesti. Jokaisesta ruuasta valmistettiin 50 g: n erä steriilissä stomacher-pussissa Nasco Whirl-pakista, joka sijaitsee WISSÄ, Yhdysvalloissa. Yön B. thuringiensis kulttuurit olivat laimennettuna 0,5% peptonivettä ja valmistamiseen keinotekoisesti saastuttamia näytteitä rokotus tasoilla 103 105 PMY/g (Chon ym., 2012; Kim et al., 2013). Elintarvikenäytteiden suspensiosta 1 mL: n määräosa siirrettiin uuteen steriloituun putkeen, ja sitä käytettiin DNA: n uuttamiseen.,

Tulokset ja Keskustelu

Havaitseminen B. thuringiensis Käyttäen cry2-Geenin

120 kantoja, vahvistus tuotteet noin 700 bp on saatu käyttämällä alukkeita cry2 (Taulukko 1). Kuten taulukoista 2 ja kuviosta 1 käy ilmi, PCR-kohdistusta cry2 käytettäessä vahvistettiin 6 B. cereus-kantaa ja 36 B. thuringiensis-kantaa (72%). Mitään muuta B. cereus-ryhmää tai ei-B-ryhmää ei monistettu. Tämä osoitti 82%: n tarkkuuden cry2: sta B. cereus-ryhmien havaitsemiseksi. 120 kantoja testattu, 100 kantoja, antoi NAs tai PAs, mikä osoittaa, yleistä tarkkuutta osuus 83.,3% (Lisätaulukko 1). Kun taas Riojas et al. (2015) kertoi, multiplex PCR: ei-ribosomaalinen peptidi nopaliinisyntaasin (NRP) – geenin ja cry1 tunnistaa B. cereus ja B. thuringiensis kanssa spesifisyys 24,5% B. cereus ja 15% B. thuringiensis.

Se on raportoitu, että B. thuringiensis-kannan voi koota yhden tai useamman crystal proteiineja, koska yksi tai useampi crystal toksiini geenejä on löydetty B. thuringiensis. Tärkein syy toksiinigeenien monimuotoisuuteen on plasmidien siirtyminen B. thuringiensis (Adang et al., 2014). Se on usein prosessi plasmidin siirto joko konjugaatio tai liikkeelle (Makart et al., 2017)., Lisäksi vaihto itkeä geenit tuottaa B. cereus uuden sitova huuto, joka johtaa samankaltaisuus B. cereus ja B. thuringiensis (Fiuza, 2015). Lisäksi erilaisella eristyslähteellä itkugeenit osoittivat erilaisuutta ja jakaumia. Jokaisesta elinympäristöstä löytyy esimerkiksi uusi cry-geeni, joka osoittaa erilaista hyönteismyrkkyä.

Havaitseminen B. thuringiensis Käyttäen XRE Geenin

Mahdollisia koodausta sekvenssit (CDS) ennustettiin olevan transkription säätelijöitä., CD sisältää helix-turn-helix (HTH) aihe XRE-kuten proteiini perhe ja MerR perhe transkription sääntelyviranomaisten, aiemmin vastaava XRE geenisekvenssien pBMB28 B. thuringiensis YBT-020 ja pCT281 B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, joka liittyy HTH-tyyppi transkription säädin, Sir, oli sama kuin vastaava elementti pG9842 B. cereus G9842 (GenBank: CP001187). Myös HTH proteiineja, yhdessä sigma tekijöitä, osallistua monenlaisia signalointireiteissä, esimerkiksi repressors, jotka estävät itiöiden (Murawska et al.,, 2014), biofilm formation (Colledge et al., 2011) ja proteaasineritystä (Pflughoeft et al., 2011). Lukuun ottamatta Cry1Ab21 ja δ-endotoksiinin koodattu toksigeeninen plasmidi pIS56-63, jotka ovat vastuussa konjugaatio ja itiöiden (Martínez-Núñez et al., 2010; Deng ym., 2014) lisäksi 53 erilaista koodattua putatiivista proteiinia.

PCR-tulokset XRE kävi ilmi, että yksikään 58 B. cereus-tai ei-B antoi vahvistusta (Taulukko 2 ja Kuva 1). Yhteensä 50: stä B. thuringiensis 47-kannasta saatiin positiivisia tuloksia (94%). Tämä osoitti tarkkuutta 97.,3% XRE: stä B. thuringiensis-bakteerin havaitsemiseen testatuista B. cereus-ryhmistä. 120 kannat testataan, 117 kantoja antoi NAs tai PAs, mikä osoittaa, yleistä tarkkuutta prosenttiyksikköä 97,5% (Täydentävä Taulukko 1).

Vakio Käyrä ja Vahvistus Tehokkuus

real-time PCR-määritys suoritettiin käyttäen DNA-otteita puhtaat viljelmät B. thuringiensis tyyppi kanta ATCC 10792 kohdistaminen XRE geeni. Kehitetty reaaliaikainen PCR-määritys oli tehokas 2,6 × 10-2,6 × 106 PMY/ – reaktion pitoisuuksien havaitsemiseksi, mikä kattoi 6 suuruusluokkaa., Yhtälö log kopioi numero vs. Ct-arvo B. thuringiensis oli y = -3.853 x+21.244 R-squared arvo 0.993, osoittaa korkea lineaarisuus (Kuva 2).

Terästettyä Ruokaa Näytteitä Havaitseminen

viime Aikoina, B. thuringiensis on raportoitu havaita elintarvikkeita, kuten maitoa, tuoreita hedelmiä ja jyviä, jotka on viljelty ja korjattu maaperä maan ulkopuolella., Kulutus raaka-ja minimaalisesti jalostettuja vihanneksia pidetään luonnollinen ja terve, mutta huolia jäljellä kemiallisia torjunta-aineita, tuoreita vihanneksia on kasvatettu (Chiu et al., 2016). Näin ollen kuluttajat ovat kääntäneet kiinnostaa orgaanisia vihanneksia (kemiallinen ilmainen vihanneksia), ja on ennustettu, että bio-torjunta-aineet, myös B. thuringiensis, voi osuus on 20% maailman torjunta-aineiden markkinoilla vuoteen 2020 mennessä korvata kemiallisten torjunta-aineiden (Wattia ja Williamson, 2015)., Tässä tutkimuksessa suorituskykyä real-time PCR kohdistaminen XRE arvioitiin 3 erilaista keinotekoisesti saastunutta ruokaa näytteitä (salaattia, kimbap ja pinaatti). B. thuringiensis-organismin tuoreita yön yli viljelmiä rokotettiin jokaiseen ruokanäytteeseen. Real-time PCR voisi onnistuneesti tunnistaa B. thuringiensis pitoisuus oli 4,8 × 103, 3.4 × 103, ja 1,5 × 103 PMY/g salaattia, kimbap ja pinaatti, vastaavasti (Kuva 3). Kuitenkin, kimbap näytteiden Ct-arvot olivat korkeammat, koska yleensä se sisältää monimutkaisempia materiaaleja, kuten makkara, muna tai porkkana verrattuna vihanneksia.,

Johtopäätös

Koska B. cereus-ryhmä ovat erittäin samankaltaisia biokemiallisia sekä geneettiset profiilit, uusi biomarkkeri on kehitetty tunnistamaan ja erottamaan B. thuringiensis päässä läheisesti ryhmä. Xren suorituskykyä verrattiin cry2-geeniin ja testattiin myös keinotekoisesti saastuneita näytteitä. Verrattuna cry2, XRE-geenin havaittiin olevan oikein tarkka tunnistaminen B. thuringiensis. Lisäksi kehitetty reaaliaikainen PCR käyttäen XRE onnistuneesti tunnistettu B., thuringiensis ja sitä voidaan käyttää määrittämään solun numerot syntyy vakio-käyrä.

Kirjoittaja Maksut

Rahoitus

Tämä tutkimustyö oli tuettu Maatalous -, Elintarvike-ja Drug Safety (Grant Nro 14162MFDS085) Korean Tasavallan ja Kangwonin National University vuonna 2015. SW oli kiitollinen Kiinan Stipendineuvoston (CSC No: 201408260054) antamasta taloudellisesta tuesta. Tekijät haluavat kiittää Hyun-Ah Leetä Kangwonin kansallisen yliopiston keskuslaboratoriossa teknisestä tuesta., RC on kiitollinen taloudellisen tuen National Research Foundation of Korea (NRF) 2018007551.

eturistiriita Lausunto

kirjoittajat ilmoittavat, että tutkimus on tehty ilman mitään kaupallisia tai taloudellisia suhteita, jotka voitaisiin tulkita mahdollisia eturistiriitoja.

oheismateriaali