évolution des génomes mitochondriaux de l’anguille Gulper profonde: réarrangements de gènes à grande échelle à l’Origine des Anguilles

résumé

des études récentes ont démontré que les écarts par rapport à l’ordre typique des gènes mitochondriaux des vertébrés sont plus fréquents qu’on ne le pensait initialement., De telles déviations, cependant, sont mineures, avec des inversions et / ou des translocations de quelques gènes étant impliquées et la duplication en tandem des régions de gène suivies par des délétions de gènes ayant été invoquées comme mécanismes originaires d’un tel nouvel ordre de gène., Au cours d’études phylogénétiques moléculaires sur les Elopomorpha (anguilles et leurs alliés), nous avons constaté que les génomes mitochondriaux (mitogénomes) des deux anguilles gulpeuses des grands fonds, Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) et Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), présentent un ordre génétique identique qui diffère grandement de celui de tous les autres vertébrés. L’analyse phylogénétique utilisant les données mitogénomiques de 59 espèces de poissons a non seulement confirmé une seule origine d’un tel ordre génique avec confiance, mais a également indiqué qu’il avait été dérivé de l’ordre génique typique des vertébrés., Des comparaisons détaillées de l’ordre des gènes de l’anguille gulper avec celui des vertébrés typiques ont suggéré que l’apparition d’une duplication à grande échelle d’une région génétique s’étendant >12 kb, suivie de suppressions de gènes chez un ancêtre commun des deux espèces, explique de manière très parcimonieuse cet arrangement génétique inhabituel.

Introduction

l’ordre des gènes mitochondriaux des vertébrés était initialement considéré comme conservateur parce que les séquences nucléotidiques complètes des génomes mitochondriaux (mitogénomes) des mammifères (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et coll., 1981) et la grenouille à griffes Africaine (Roe et al. 1985) ont montré un ordre de gènes commun. Comme les séquences complètes de L’ADN mitochondrial (ADNmt) ont été déterminées pour un certain nombre de vertébrés (269 espèces au 11 juin 2003; site Web du National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), il a été reconnu que les écarts par rapport à l’ordre typique des gènes ne sont pas si rares chez les vertébrés (fig. 1; Boore 1999). À l’exception des mammifères placentaires, les exemples incluent toutes les lignées principales de vertébrés comme les lamproies (Lee et Kocher, 1995), les amphibiens (Macey et al. 1997; Sumida et coll., 2001), reptiles (Kumazawa et Nishida 1995; Quinn et Mindell 1996; Macey et al. 1997), les oiseaux (Desjardins et Morais 1990, 1991; Quinn et Wilson 1993; Mindell, Sorenson et Dimcheff 1998), les marsupiaux (Pääbo et al. 1991; Janke et coll. 1994), et les poissons (Miya et Nishida 1999; Inoue et coll. 2001b; Miya, Kawaguchi et Nishida 2001). De tels réarrangements de gènes, cependant, sont locaux (notamment dans un groupe de gènes d’ARNt), et aucun exemple n’a été trouvé impliquant des réarrangements à l’échelle génomique.,

les anguilles Gulper sont des créatures bien connues des grands fonds, comprenant collectivement quatre familles placées dans l’ordre des Saccopharyngiformes, qui se rencontrent à des profondeurs bathypélagiques (> 1 000 m) dans les océans du monde (Bertelsen, Nielsen et Smith, 1989). Leur apparence bizarre (fig. 1), qui résulte de trous extrêmement élargis et déformés à l’extrémité de la tête et du corps ressemblant à un serpent de l’anguille, a attiré beaucoup d’attention de la part de nombreux chercheurs (p. ex., Bertelsen, Nielsen et Smith, 1989; Robins, 1989)., De telles caractéristiques anatomiques spécialisées ont conduit les chercheurs à supposer que les positions phylogénétiques de ces animaux sont en dehors des poissons osseux (par exemple, Tchernavin 1946), bien qu’ils aient généralement été considérés comme des parents proches des vraies anguilles (ordre des Anguilliformes), car ils ont un stade larvaire leptocéphale en forme de feuille (Greenwood et al. 1966; Inoue et Miya 2001).,

au cours d’études phylogénétiques moléculaires des Elopomorpha (anguilles et leurs alliés) utilisant des données mitogénomiques, nous avons trouvé un ordre de gènes mitochondriaux inhabituel pour L’une des Anguilles gulper, Eurypharynx pelecanoides (fig. 1). Cet article décrit une nouvelle organisation génétique dans les mitogénomes de deux espèces d’anguilles gulpeuses, E. pelecanoides et Saccopharynx lavenbergi. Nous avons utilisé une approche basée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) développée par Miya et Nishida (1999) pour séquencer les mitogénomes complets de ces poissons., Pour explorer l’origine de ces mitogénomes uniques, nous avons soumis les données mitogénomiques à une analyse phylogénétique, et nous discutons ici des mécanismes possibles générant un tel arrangement génétique chez les deux anguilles gulper.

matériaux et méthodes

spécimens

des séquences D’ADN Mitochondrial ont été obtenues chez six individus de deux espèces représentant deux familles de L’ordre des Saccopharyngiformes (Robins, 1989). Pour la famille monotypique des Eurypharyngidae, un individu de E., pelecanoides a été utilisé comme spécimen pour déterminer la séquence complète de l’ADNmt, et les quatre autres individus, y compris deux larves leptocéphales, ont été utilisés pour déterminer les séquences partielles de quatre jonctions géniques majeures (fig. 2) confirmer l’ordre des gènes dans le mitogénome d’E. pelecanoides. Pour la famille des Saccopharyngidae, un seul individu de S. lavenbergi a été utilisé comme spécimen pour la détermination de la séquence complète de l’ADNmt., Des spécimens de bons ont été déposés dans les collections de poissons du Muséum D’Histoire Naturelle & Institute, Chiba, Japon (CBM-ZF), et à L’Université de Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, sud du Japon; CBM-ZF 10312, 10313, 10316 et 10317: océan Pacifique central équatorial) et S. lavenbergi (uw 045633: Pacifique est).

extraction de L’ADN

Une partie de la musculature épaxiale (env. 0,25 g) a été excisé à partir de spécimens frais de chaque espèce et immédiatement conservé dans de l’éthanol à 99,5%., L’ADN génomique Total a été extrait à l’aide du kit de tissus Qiagen QIAamp suivant le protocole du fabricant.

réaction en chaîne par polymérase et séquençage

Les mitogénomes entiers de deux anguilles gulper ont été amplifiés à l’aide d’une technique de PCR longue (Cheng, Higuchi et Stoneking, 1994). Cinq amorces de PCR longues universelles et trois espèces spécifiques aux poissons (S-la-16s-l + H12293 – Leu et L12321-Leu + S-La-16S-H Pour E. pelecanoides; L2508-16s + Sala-ND4-H et Sala-CO1-l + Sala-ND1-H Pour S. lavenbergi; fig. 1) ont été utilisés pour amplifier le mitogénome entier de chaque anguille dans deux réactions., Les mitogénomes entiers des quatre autres individus D’E. pelecanoides ont été amplifiés avec trois amorces universelles de poisson et une amorce PCR longue spécifique à l’espèce (L2508-16s + Eupe-ND2–H et L12321-Leu + S-LA-16S-H). Quatre amorces spécifiques à une espèce (Eupe-ND2-H Pour E. pelecanoides; Sala-CO1-l, Sala-ND1-H et Sala-ND4-H Pour S. lavenbergi) ont également été conçues en référence aux séquences nucléotidiques partielles du gène ND2 d’E. pelecanoides et aux gènes COI, ND1 et ND4 de S. lavenbergi déterminés à partir de chaque ADN total à l’aide d’amorces universelles de poisson.,

Les produits de PCR longue ont été dilués avec un tampon TE (1:20) pour une utilisation ultérieure comme modèles de PCR, sauf pour une région intervenant entre les deux amorces de PCR longue (entre S-La-16S-H et S-la-16S-L, et H12293-Leu et L12321-Leu Pour E. pelecanoides; fig. 1), dans lequel L’ADN génomique total a été utilisé alternativement.

un total de 82 amorces universelles (Miya et Nishida, 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001C, 2001d; Ishiguro, Miya et Nishida 2001; Kawaguchi, Miya et Nishida 2001) ont été utilisés dans diverses combinaisons pour amplifier des segments contigus et chevauchants de l’ensemble du mitogénome pour chacune des deux espèces. Des amorces spécifiques à l’espèce ont été conçues dans les cas où il n’y avait pas d’amorces universelles appropriées pour le poisson. Une liste des amorces de PCR utilisées pour une espèce spécifique est disponible auprès de J. G. I. sur demande. Des réactions de PCR longue et de PCR subséquentes ont été effectuées comme décrit précédemment (p. ex., Miya et Nishida, 1999; Inoue et al. 2003).,

Les produits de PCR double brin, purifiés à l’aide d’un kit de pré-séquençage (USB), ont ensuite été utilisés pour le séquençage à cycle direct à l’aide de terminateurs marqués par colorant (Applied Biosystems). Les amorces utilisées étaient les mêmes que celles utilisées pour la PCR. Toutes les réactions de séquençage ont été effectuées conformément aux instructions du fabricant. Les fragments marqués ont été analysés au moyen d’un séquenceur D’ADN modèle 377 (Applied Biosystems).

analyse des séquences

Les séquences D’ADN ont été analysées à l’aide du logiciel DNASIS version 3.2 (Hitachi Software Engineering)., Les emplacements des 13 gènes codant des protéines ont été déterminés par comparaison de séquences D’ADN ou d’acides aminés de mitogénomes de poissons osseux. Les 22 gènes de l’ARNt ont été identifiés par leurs structures secondaires à feuilles de trèfle (Kumazawa et Nishida, 1993) et leurs séquences d’anticodons. Les deux gènes de l’ARNr ont été identifiés par une similitude de séquence et une structure secondaire (Gutell, Gray et Schnare, 1993). Les données de séquence sont disponibles auprès de DDBJ / EMBL / GenBank avec les numéros D’adhésion AB046473 et AB046475-AB046490 pour E. pelecanoides et AB047825 pour S. lavenbergi.,

analyse phylogénétique

Les matrices de données d’Inoue et al. (2001d) et Miya, Kawaguchi et Nishida (2001) ont été combinés et les taxons redondants ont été éliminés. Des séquences mitogénomiques de deux anguilles gulpeuses et de deux téléostéens (Gymnothorax kidako, AP002976 et Salmo salar, U12143 ) ont été ajoutées. Comme les alignements non ambigus des deux gènes de l’ARNr sur la base de modèles de structure secondaire n’étaient pas réalisables (Miya et Nishida 2000), ils n’ont pas été utilisés dans les analyses., Le gène ND6 n’a pas été utilisé dans les analyses phylogénétiques en raison de sa composition de base hétérogène et de ses performances phylogénétiques constamment médiocres (p. ex., Zardoya et Meyer, 1996; Miya et Nishida, 2000). De plus, les boucles d’ARNt, les tRNASer(Agy) (structures secondaires inférées instables chez certaines espèces) et d’autres régions alignées de manière ambiguë, telles que les extrémités 5′ et 3′ de plusieurs gènes codant des protéines, ont été exclues des analyses., De plus, les positions du 3e codon dans les gènes codant des protéines qui pourraient induire positivement en erreur une analyse des relations de niveau supérieur des actinoptérygiens (Miya et Nishida 2000) ont été exclues des analyses, laissant 7 984 positions nucléotidiques disponibles parmi les 12 gènes codant des protéines et les 21 gènes de l’ARNt.

des analyses phylogénétiques bayésiennes ont été effectuées à L’aide de MrBayes 2.01 (Huelsenbeck et Ronquist, 2001)., Le modèle général réversible dans le temps avec certains sites supposés invariables et avec des sites variables supposés suivre une distribution gamma discrète (GTR + I + Γ; Yang 1994) a été choisi comme modèle le mieux adapté de la substitution nucléotidique (ModelTest version 3.06; Posada et Crandall 1998). Nous définissons les paramètres de vraisemblance maximale dans MrBayes comme suit: « lset nst = 6 « (RTM),” rates = invgamma « (I + Γ) et” basefreq = estimate  » (proportion estimée des types de base à partir des données). Le procédé Markov chain Monte Carlo a été réglé de manière à ce que quatre chaînes (trois chauffées et une froide) fonctionnent simultanément., Nous avons effectué deux essais indépendants pour 1 million de générations, avec des arbres échantillonnés toutes les 100 générations, chacun partant d’un arbre aléatoire. Deux analyses indépendantes ont convergé vers des scores de log-vraisemblance similaires et ont atteint la” stationnarité  » (absence d’amélioration des scores ML) au plus tard 120 000 générations., Ainsi, les 1 200 premiers arbres ont été écartés de chaque analyse, et les 17 602 échantillons combinés restants de deux analyses indépendantes ont été utilisés pour générer un arbre de consensus de règle majoritaire de 50%, le pourcentage d’échantillons récupérant un clade particulier représentant la probabilité postérieure de ce clade (Huelsenbeck et Ronquist, 2001).

résultats

organisations du génome

Les longueurs totales des mitogénomes D’E. pelecanoides et de S. lavenbergi sont de 18 978 PB et de 18 495 pb (à L’exception d’une partie de la région témoin présumée de S., lavenbergi), respectivement (voir le matériel supplémentaire en ligne). Le contenu du génome de ces deux anguilles gulper comprend deux ARNr, 22 ARNt et 13 gènes codant des protéines, comme on le trouve chez d’autres vertébrés (fig. 2). Comme chez les autres vertébrés, la plupart des gènes de ces deux espèces sont codés sur le brin H, à l’exception des gènes ND6 et huit ARNt. Toutes les caractéristiques sont similaires en longueur à celles d’autres poissons osseux, à L’exception du gène COI et de la région témoin pour E. pelecanoides et des gènes COI et cyt b Pour S., lavenbergi (environ 100, 800, 150 et 30 bp de plus que ceux des autres poissons osseux, respectivement).

Le mitogénome D’E. pelecanoides contient trois régions non codantes de plus de 200 PB (fig. 2; voir également les documents supplémentaires en ligne; Région non codante et région de contrôle). Le nc1, situé entre les gènes TRNASER(UCN) et tRNAAsp, et le nc2, situé entre les gènes tRNAAsp et COII, contiennent respectivement deux et quatre pseudogènes correspondant à des copies dégénérées du gène tRNAAsp., Une région non codante (1 818 PB) située entre les gènes cyt b et tRNAPhe semble correspondre à la région témoin. Le mitogénome de S. lavenbergi contient également trois régions non codantes de plus de 200 PB (région non codante et régions témoins ). Le nc, Situé entre les gènes tRNALeu(CUN) et ND5, contient au moins deux pseudogènes correspondant à des copies dégénérées du gène tRNALeu(CUN)., CR1 (992 PB), Situé entre deux clusters de gènes d’ARNt (régions TP et IM), et CR2 (> 837 PB), Situé entre les gènes cyt b et tRNAPhe, semblent correspondre à la région témoin, et ils ont des séquences complètement identiques sur 800 pb, indiquant qu’ils subissent une évolution concertée (voir Kumazawa et al. 1998).

à l’exception des deux régions témoins dupliquées (CR1 et CR2) dans le mitogénome de S. lavenbergi, les mitogénomes des deux anguilles gulpeuses des grands fonds présentent un ordre génétique identique (fig. 2)., Cependant, l’ordre des gènes mitochondriaux des deux anguilles gulper diffère grandement de celui de tous les autres vertébrés connus à ce jour. Lorsque certains gènes d’ARNt ont été exclus des comparaisons (fig. 2), nous avons identifié cinq blocs de gènes (A, tRNAGlu-tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; et E, régions de gènes tRNAArg–TRNASER(AGY)), dont l’ordre des gènes est identique à celui des vertébrés typiques.,

Positions phylogénétiques de deux Anguilles Gulpeuses

La Figure 3 est un arbre de consensus de règle majoritaire de 50% des 17 602 échantillons combinés provenant de deux analyses bayésiennes indépendantes des 59 séquences nucléotidiques mitochondriales des 12 codages protéiques concaténés (pas de 3e position de codon), plus 21 gènes d’ARNt (régions souches seulement) utilisant le modèle GTR + I + Γ De l’évolution des séquences (Yang 1994). À l’exception de quelques nœuds au sein des Neoteleostei, la plupart des branches internes étaient soutenues par des probabilités bayésiennes postérieures élevées (≥95%)., Il convient de noter que l’arbre résultant démontre explicitement non seulement que les deux anguilles gulper forment une relation de groupe frère avec une probabilité postérieure élevée (100%), mais aussi qu’elles sont profondément imbriquées dans les Anguilliformes (vraies anguilles), suggérant fortement qu’elles ont été dérivées d’un ancêtre semblable à l’anguille.

Discussion

récemment, plus de 140 séquences complètes d’ADNmt des poissons actinoptérygiens ont été déterminées (p. ex., Miya et Nishida, 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya, et Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya, et Nishida 2001; Miya, Kawaguchi, et Nishida 2001; Miya et coll. 2003; Saitoh et coll. 2003), et plusieurs exemples de réarrangements de gènes ont été rapportés (fig. 1). Il convient de noter que de tels événements de réarrangement de gènes impliquent peu de gènes et que la disposition des gènes des mitogénomes de l’anguille gulper diffère grandement de celle des autres vertébrés.,

Implications phylogénétiques sur l’origine d’un nouvel ordre génique

pour déduire l’évolution des arrangements géniques chez les deux anguilles gulper, une inférence pour l’organisation ancestrale basée sur un cadre phylogénétique fiable est nécessaire. Bien que les anguilles gulper aient été incluses dans les Elopomorpha en se basant uniquement sur une forme larvaire pélagique distincte, appelée leptocephalus, personne n’a corroboré leur position phylogénétique à l’aide de matrices de caractères dérivées de données morphologiques ou moléculaires (Inoue et Miya, 2001).,

analyse bayésienne utilisant les données mitogénomiques de 59 espèces qui représentent pleinement la diversité des poissons téléostéens (fig. 3) a non seulement corroboré que le nouvel ordre de gènes des deux anguilles gulpeuses provenait d’un ancêtre commun des deux espèces, mais a également démontré que leur origine était indépendante de celles des autres nouveaux ordres de gènes. Il semble également que le nouvel ordre génétique de Conger myriaster, un autre membre des Elopomorpha, ait une origine indépendante de celle de l’anguille gulper., Il convient de noter Qu’Anguilla japonica, qui possède l’ordre génétique typique des vertébrés, a été placée avec confiance comme une espèce sœur des deux anguilles gulper. La reconstruction la plus parcimonieuse des événements de réarrangement des gènes sur l’arbre phylogénétique a indiqué que l’ordre des gènes aberrant des deux anguilles gulper est dérivé de celui des vertébrés typiques.

mécanisme Possible pour le réarrangement des gènes chez les anguilles Gulper

deux mécanismes majeurs ont été proposés pour expliquer les réarrangements des gènes chez les mitogénomes vertébrés (Lee et Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., La première est la duplication en tandem de régions génétiques à la suite d’une erreur d’appariement des brins glissés, suivie de la suppression de gènes (Moritz et Brown, 1986; Levinson et Gutman, 1987). Bien que la dynamique des arrangements de gènes mitochondriaux n’ait pas été expliquée chez certains invertébrés (p. ex., Kurabayashi et Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et coll. 2002), les réarrangements des gènes mitochondriaux des vertébrés pourraient bien s’expliquer par un tel mécanisme (Desjardins et Morais 1990; Quinn et Wilson 1993; Kumazawa et Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson et Dimcheff 1998; Miya et Nishida 1999; Inoue et coll. 2001b), et sa faisabilité est également étayée par les duplications polymorphes fréquentes des séquences d’ADNmt (p. ex., Stanton et al. 1994; Gach et Brown 1997; Mindell, Sorenson et Dimcheff 1998; Miya et Nishida 1999). Les autres mécanismes suggérés invoquent l’amorçage illicite de la réplication par les ARNt et l’intégration résultante des gènes d’ARNt autour de la région témoin (Cantatore et al. 1987; Jacobs et coll. 1989).,

bien que le deuxième modèle ne soit pas exclu à ce stade, le premier modèle est favorisé comme mécanisme de réarrangement des gènes dans les mitogénomes de l’anguille gulper. En supposant qu’un long fragment D’ADN dans la région tRNAIle–CR de l’organisation typique est dupliqué (fig. 4), les suppressions ultérieures de gènes redondants donneraient lieu à l’organisation des gènes réarrangés chez les anguilles gulper. Une telle duplication en tandem et les délétions subséquentes ont entraîné de manière très parcimonieuse l’ordre des gènes observé et les espaceurs intergéniques Associés chez ces deux anguilles gulpeuses.,

Plusieurs suppressions de gènes redondants semblaient incomplètes chez les deux anguilles gulper, en raison de plusieurs séquences non codantes (fig. 2) survenant autour des gènes impliqués dans le réarrangement (fig. 4). Bien que nc1 et nc2 chez E. pelecanoides et nc chez S. lavenbergi soient composés de pseudogènes répétitifs correspondant à des copies dégénérées du gène de l’ARNt adjacent, CR1 et CR2 chez S. lavenbergi mitogenome ont des séquences identiques sur 800 pb, et CR1 est situé à la position dupliquée putative tandis que CR2 est situé à la position originale de la région témoin., Cette observation dans le mitogénome de S. lavenbergi appuie le concept de duplication en tandem et d’événements de délétion subséquents comme s’étant produits dans la région tRNAIle–CR (fig. 4).

Si quatre des cinq blocs de gènes contigus étaient dupliqués ensemble dans un ancêtre commun des deux espèces, et si la délétion subséquente de gènes se produisait avant la spéciation, les parties supposées dupliquées de Gulper anguilles, allant du gène tRNAIle à CR de l’organisation typique, s’étendaient au-delà de 12 kb (fig. 1)., Avant cette étude, les régions présumées dupliquées du réarrangement des vertébrés étaient au mieux de 4 kb. De plus, toutes les séquences codantes répétées en tandem connues ont été limitées à des régions adjacentes aux régions CR, IQM ou WANCY, ce qui reflète peut-être la fin imprécise occasionnelle des réplications au-delà de leurs origines. La région dupliquée dans le mitogénome de l’anguille gulper était beaucoup plus grande que celle des réarrangements vertébrés jamais connus et impliquait presque tout le mitogénome (fig. 1).

Nous remercions les capitaines, officiers, membres d’équipage, scientifiques et étudiants à bord pendant la croisière KT97-10< — — > du R/V Tansei Maru et de la croisière kh00-1 du R/V Hakuho Maru pour leur aide dans la collecte d’échantillons. Cette étude n’aurait pas pu être possible sans le généreux don de matériel tissulaire de S. lavenbergi, pour lequel nous remercions sincèrement E. O. Wiley. Nous remercions également deux examinateurs anonymes pour leurs précieux commentaires sur le manuscrit. Merci également à Y., Fukuyo, K. Furuya, K. Nanba, et des étudiants diplômés du Fisheries Oceanography Laboratory, Université de Tokyo, pour nous avoir généreusement permis d’utiliser leurs installations expérimentales, et à Marshall Editions Ltd.; Andromède Oxford Ltd.; et Tokai University Press pour obtenir l’autorisation d’utiliser des illustrations et des photographies. K. Pearson a gentiment fourni des informations pertinentes sur l’identité du Spécimen « S. lavenbergi”. Cette étude a été soutenue en partie par des subventions du Ministère de L’éducation, des Sciences et de la Culture du Japon (nos., 09740644, 10460081, 10660189, 11640705, 11691177, 12460083, et 12np0201) et le programme” recherche pour l’avenir  » No. JSPS-RFTF 97L00901 de la société japonaise pour la Promotion de la Science. K. T. a été soutenu par la fondation de recherche de Touwa Shokuhin Shinkoukai et la fondation de recherche sur L’anguille de Nobori-kai.

littérature Citée