Frontières en Microbiologie

Introduction

Bacillus thuringiensis et 7 autres espèces qui produisent des spores bactéries à Gram positif, y compris B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, et B. mycoidesare, sont principalement détectés dans le sol. Parce que ces bactéries sont très similaires en génotype et phénotype, les bactéries sont classées dans le groupe B. cereus en taxonomie (Park et al., 2007). B., cereus et B. thuringiensis sont hautement détectables dans les aliments car ils sont observés dans les matières premières du sol agricole pendant la culture et la distribution. De plus, ces deux bactéries ne sont généralement pas discriminées dans les diagnostics cliniques. B. cereus est un deuxième groupe prioritaire de risque de maladies d’origine alimentaire dans les produits agricoles frais, et sa contamination est l’un des problèmes majeurs dans les légumes (Felício et al., 2015). En particulier, B., thuringiensis a été utilisé comme pesticide dans la culture de certaines cultures et il est bien connu comme insecticides microbiens qui ont été utilisés pour réduire la quantité de pesticides chimiques (Azmi et al., 2015).

B. thuringiensis produit des protéines insecticides, qui sont le principal type de protéines cristallines (Cry) (Kutasi et al., 2016). Inversement, les cellules végétatives en croissance active qui manquent de production de cristaux entraînent des effets non toxiques. Les δ-endotoxines contiennent principalement des cytolytiques (Cyt) et des Cry (Elleuch et al., 2015; Rao et coll., 2015)., Cependant, Cyt et Cry possèdent des homologies de séquence différentes, même s’ils consistent en des modes d’action similaires vers la lyse cellulaire, qui conduisent à des dommages permanents de l’insecte midgut (Adang et al., 2014).

La variation structurelle de quatre δ-endotoxines (Cry1, Cry2, Cry3 et Cyt2Ah) a été observée par cristallographie aux rayons X (Dehury et al., 2013). Ces gènes sont identifiés dans le coton transgénique et d’autres légumes, qui sont considérablement efficaces dans la lutte contre les ravageurs., La conception d’un biomarqueur pour le produit traduit varie selon les différentes catégories de protéines cry; par conséquent, la détection sera complexe. Les séquences génétiques de l’ARNr 16S basées sur des amorces universelles ont montré une forte similitude (>99%) entre B. cereus et B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), qui ne peuvent pas être classés à l’aide d’analyses génétiques et phénotypiques (Peng et al., 2015). En outre, il y a eu une discussion depuis 2000 sur la question de savoir si l’ensemble du groupe de B. cereus devrait être traité comme une espèce complexe de bactéries diverses (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz et Marjańska, 2017). Il existe également des suggestions selon lesquelles la phylogénie de ces bactéries correspond mieux à leurs propriétés écologiques (psychrotolérance, virulence) qu’à leur appartenance taxonomique (Drewnowska et Swiecicka, 2013; Bartoszewicz et Marjańska, 2017). Pour résoudre ce problème, nous avons ciblé XRE pour détecter B. thuringiensis, qui contrôle le principal type de production de protéines cristallines.

Ces deux bactéries sont très similaires dans les résultats biochimiques (Böhm et coll., 2015), et les propriétés génétiques (Osman et coll., 2015). Cho et coll., (2015) ont également rapporté que les propriétés génétiques et phénotypiques entre ces bactéries sont à peine distinguables. En outre, Pfrunder et coll. a rapporté que les espèces du groupe de B. cereus ne peuvent pas être identifiées de manière fiable en utilisant le biotypage classique (Pfrunder et al., 2016). Sur la base de ceux-ci, les expériences biochimiques pourraient ne pas être suffisantes pour la différenciation. Au lieu de cela, la présence d’une protéine cristalline insecticide a été utilisée comme caractéristique distinctive pour différencier ces bactéries (Ekino et al., 2014; Wei et coll., 2018).,

Certains des facteurs qui différencient ces deux bactéries sont basés sur leur pathogénicité dans les échantillons. B. cereus provoque des troubles gastro-intestinaux, tandis que B. thuringiensis a également été impliqué dans des épidémies de diarrhée. Comme rapporté, la caractéristique distinctive de B. thuringiensis est la présence de protéines cristallines insecticides (δ-endotoxine) cryptées par des gènes cry (Osman et al., 2015; Albright et coll., 2016). Depuis la méthode d’identification utilisant le biomarqueur pour différencier B., le groupe cereus est complexe et prend du temps, un biomarqueur très efficace est urgent pour remplacer les précédents qui ont donné une efficacité inférieure et parfois même montré de faux résultats. Basé sur les deux gènes spécifiques, le régulateur transcriptionnel et les gènes de protéine cristalline pour B. thuringiensis (Porcar et Juárez-Pérez, 2003; Han et al., 2006), la présente étude a été réalisée pour inspecter et comparer l’efficacité du biomarqueur conçu (XRE) à celle du marqueur protéique cristallin existant (cry2) dans l’identification de B. thuringiensis à partir de souches du groupe B. cereus (Bcg) et non-B., souches du groupe cereus (non-B) dans les aliments. cry2est la protéine cristalline la plus courante présente chez B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma et coll., 2014).

Matériaux et méthodes

Préparation des cultures bactériennes

Les 120 souches, dont 111 de Bcg et 9 de non-B, ont été obtenues à partir de collections bactériennes aux États-Unis et en Corée du Sud (Tableau supplémentaire 1). Parmi les collections, B. thuringiensis ATCC 10792 (souche type) a été utilisé pour l’optimisation des conditions expérimentales de la PCR conventionnelle et de la PCR en temps réel., Toutes les souches ont été décongelées à la température ambiante (25°C) et striées sur la gélose nutritive (Difco, MI, États-Unis). Après une culture de 24 h à 35°C dans l’incubateur, une colonie pure a été cueillie et inoculée dans un bouillon de soja tryptique (Difco, MI, États-Unis) et des cultures de nuit ont été utilisées pour des expériences ultérieures.

Conception des amorces et isolation de l’ADN

Les amorces respectives ciblant XRE pour différencier B., thuringiensis (Tableau 1) ont été conçus selon la séquence suivante chez Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gene – 3664610-3665047) en utilisant le logiciel Primer Express® (Version 3.0.1) d’Applied Biosystems situé en Californie, États-Unis et synthétisé par Bioneer Corporation de Daejeon, Corée. Les performances de designed XRE ont été comparées à celles de cry2 (Ben-Dov et al., 1997). Après 24 h d’enrichissement en TSB, une aliquote de 1 mL de bactéries a été soumise à l’extraction de l’ADN génomique à l’aide du réactif de préparation d’échantillon PrepMan® Ultra (Applied Biosystems, CA, États-Unis)., Les concentrations d’ADN ont été mesurées par fluorescence Eppendorf BioSpectrometer® (Eppendorf, Hambourg, Allemagne) et ajustées à 10 ng/µL. Les échantillons d’ADN ont été stockés à -20 ° C avant utilisation.

Analyse PCR conventionnelle et PCR en temps réel

La PCR conventionnelle a été préparée avec un thermocycleur C1000 TouchTM de Bio-Rad situé à Hemel Hempstead, Royaume-Uni., Le tube de réaction pour la PCR utilisé Accu-Power ® Pyro Hot Start Taq PCR Pre-Mix de Bioneer Corporation situé à Daejeon, Corée et un volume de 20 µL, y compris 1 µL de chaque amorce (10 pmoL/µL) et 2 µL d’ADN. Les conditions d’amplification de la PCR conventionnelle pour régulateur transcriptionnel (XRE) étaient: dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min, suivie de 35 cycles de dénaturation à 95°C pendant 30 s, recuit à 49°C pendant 30 s et allongement à 72°C pendant 30 s, et un allongement final à 72°C pendant 5 min., Les conditions d’amplification de la protéine cristalline (Cry 2) étaient les suivantes: dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min, suivie de 35 cycles de dénaturation à 95°C pendant 30 s, recuit à 55°C pendant 30 s et allongement à 72°C pendant 1 min, et allongement final à 72°C pendant 5 min. Après amplification de l’ADN, solution de gel d’agarose à 1,5% (P/V) contenant une Solution d’acide nucléique RedsafeTM 20 000 × (Intron Biotechnology, Inc.) a été préparé et une électrophorèse sur gel a été réalisée à l’aide du modèle sous-cellulaire 192 de Bio-Rad situé à Hemel Hempstead, au Royaume-Uni., Les bandes ont été visualisées à l’aide du système d’imageur Smart View Pro UVCI-1100 de Major Science situé en Californie, aux États-Unis. La précision (AC) a été utilisée pour évaluer la méthode de PCR en utilisant les amorces XRE et cry2 pour détecter B. thuringiensis à partir du Bcg et non-B. L’accord négatif (NA) signifie le même résultat négatif pour non-B. thuringiensis en utilisant la PCR avec XRE et cry2. L’accord positif (AP) signifie le même résultat positif pour B. thuringiensis en utilisant la PCR avec XRE et cry2. La précision (AC) est mesurée à l’aide de l’équation suivante, AC = ×100% (Ma et al., 2014).,

Des expériences de PCR en temps réel ont été réalisées par le système de PCR en temps réel StepOneTM d’Applied Biosystems situé en Californie, aux États-Unis. Un volume de réaction de 20 µL composé de 10 µL de Mélange Maître de Fusion Haute Résolution (HRM) de Melt DoctorTM, de 2 µL d’ADN, de 0,5 µL de l’amorce F/R (10 pmoL/µL) (tableau 2). Les conditions d’amplification du qPCR étaient: dénaturation initiale à 95°C pendant 10 min et 40 cycles à 95°C pendant 15 s et 60°C pendant 1 min. Ensuite, dans l’analyse de la courbe de fusion subséquente, la température a été réglée pour augmenter de 60 à 95°C à 0,3°C/cycle pour tester la spécificité de l’amorce.,

Évaluation du test PCR en temps réel

La performance de XRE et cry2 a été évaluée à l’aide de 50 souches de B. thuringiensis, tandis que l’exclusivité a été testée à l’aide de 70 bactéries non cibles, dont 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg et 9 non-B (Chelliah et al., 2017). Une courbe standard a été réalisée en utilisant des dilutions de 10 fois l’ADN extrait de B. thuringiensis ATCC 10792., Les concentrations d’ADN ont été ajustées de 10 ng / µL à 100 fg/µL, correspondant à 2,6 × 106 à 2,6 × 10 UFC, et les amplifications ont été effectuées par PCR en temps réel avec des triplets. Pour les témoins négatifs, on a utilisé de l’eau distillée. Des résultats négatifs ou aucune courbe d’amplification ont été pris en compte lorsque les valeurs de seuil de cycle (Ct) étaient supérieures à 40.

Détection de B. thuringiensis dans des échantillons d’aliments enrichis

La laitue (Lactucasativa), le Kimbab et les épinards (Spinaciaoleracea) ont été achetés sur un marché local à Chuncheon, en Corée., Les échantillons ont été testés pour l’absence de bactéries cibles selon la norme ISO 7932 (2004). Une aliquote de 50 g de chaque type de nourriture a été préparée dans un sac stomacher stérile de Nasco Whirl-Pak situé à WI, aux États-Unis. Les cultures de B. thuringiensis pendant la nuit ont été diluées dans 0,5% d’eau de peptone et utilisées pour préparer les échantillons artificiellement contaminés avec des taux d’inoculation de 103 à 105 UFC/g (Chon et al., 2012; Kim et coll., 2013). Une aliquote de 1 mL de la suspension d’échantillons alimentaires a été transférée dans un nouveau tube stérilisé et utilisée pour l’extraction de l’ADN.,

Résultats et discussion

Détection de B. thuringiensis à l’aide du gène cry2

Pour les 120 souches, des produits d’amplification d’environ 700 pb ont été obtenus à l’aide des amorces cry2 (tableau 1). Comme le montrent le tableau 2 et la figure 1, lors de l’utilisation de la PCR ciblant cry2, 6 souches de B. cereus et 36 souches de B. thuringiensis (72%) ont été amplifiées. Aucun autre groupe de B. cereus ou groupe non-B n’a été amplifié. Cela a montré une précision de 82% de cry2 pour détecter les groupes de B. cereus. Pour les 120 souches testées, 100 souches ont donné NAs ou PAs, ce qui indique un pourcentage de précision global de 83.,3% (Tableau supplémentaire 1). Alors que Riojas et coll. (2015) ont rapporté une PCR multiplex du gène de la peptide synthase non ribosomique (NRPS) et de cry1 pour identifier B. cereus et B. thuringiensis avec une spécificité de 24,5% chez B. cereus et de 15% chez B. thuringiensis.

Il a été rapporté que la souche de B. thuringiensis peut synthétiser une ou plusieurs protéines cristallines puisqu’un ou plusieurs gènes de toxine cristalline ont été trouvés pour B. thuringiensis. La principale raison de la diversité des gènes de la toxine est le transfert de plasmides chez B. thuringiensis (Adang et al., 2014). C’est un processus fréquent pour le transfert des plasmides par conjugaison ou mobilisation (Makart et al., 2017)., En outre, les échanges de gènes cry génèrent B. cereus avec une nouvelle liaison de cry qui conduit à la similitude de B. cereus et B. thuringiensis (Fiuza, 2015). De plus, avec une source d’isolement différente, les gènes cry ont montré une différence de diversité et de distributions. Par exemple, un nouveau gène cry peut être trouvé dans chaque habitat qui montre une activité insecticide différente.

Détection de B. thuringiensis À l’aide du gène XRE

On a prédit que les séquences codantes potentielles (CDS) seraient des régulateurs transcriptionnels., CDS contient un motif helix-turn-helix (HTH) dans la famille de protéines de type XRE et les régulateurs transcriptionnels de la famille MerR, auparavant les séquences de gènes XRE correspondantes dans pBMB28 de B. thuringiensis YBT-020 et pCT281 de B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, qui est apparenté au régulateur transcriptionnel de type HTH, SinR, était identique à l’élément correspondant pG9842 de B. cereus G9842 (GenBank: CP001187). Les protéines HTH, ainsi que les facteurs sigma, participent à un large éventail de voies de signalisation, par exemple, en tant que répresseurs qui inhibent la sporulation (Murawska et al.,, 2014), la formation de biofilm (Colledge et coll., 2011), et la sécrétion de protéase (Pflughoeft et al., 2011). Outre Cry1Ab21 et δ-endotoxine codées dans le plasmide toxigène pIS56-63, qui sont responsables de la conjugaison et de la sporulation (Martínez-Núñez et al., 2010; Deng et coll., 2014) en plus avec 53 protéines putatives codées différentes.

Les résultats de la PCR avec XRE ont révélé qu’aucun des 58 B. cereus ou non-B n’a donné d’amplification (Tableau 2 et Figure 1). Au total, sur 50 souches de B. thuringiensis, 47 ont donné des résultats positifs (94%). Cela a montré une précision de 97.,3% de XRE pour détecter B. thuringiensis parmi les groupes testés de B. cereus. Pour les 120 souches testées, 117 souches ont donné des NAs ou des PAS, ce qui indique un pourcentage global de précision de 97,5% (Tableau supplémentaire 1).

Courbe standard et efficacité d’amplification

Le test de PCR en temps réel a été réalisé en utilisant les extraits d’ADN des cultures pures de la souche ATCC 10792 de type B. thuringiensis ciblant le gène XRE. Le test PCR en temps réel développé a été efficace pour détecter des concentrations de 2,6 × 10 à 2,6 × 106 UFC/réaction, qui couvraient 6 ordres de grandeur., L’équation du nombre de copies logarithmiques par rapport à la valeur Ct pour B. thuringiensis était y = -3,853 x+21,244 avec une valeur R au carré de 0,993, ce qui indique la linéarité élevée (Figure 2).

Détection d’échantillons d’aliments dopés

Récemment, on a signalé la présence de B. thuringiensis dans des aliments tels que le lait, les fruits frais et les céréales qui ont été cultivés et récoltés dans le sol à l’extérieur du pays., La consommation de légumes crus et peu transformés est considérée comme naturelle et saine, mais des préoccupations concernant les pesticides chimiques résiduels dans les légumes frais ont été soulevées (Chiu et al., 2016). Ainsi, les consommateurs se sont tournés vers les légumes biologiques (légumes sans produits chimiques), et il est prévu que les bio-pesticides, y compris B. thuringiensis, pourraient représenter 20% du marché mondial des pesticides d’ici 2020 en remplacement des pesticides chimiques (Watts et Williamson, 2015)., Dans cette étude, la performance de la PCR en temps réel ciblant XRE a été évaluée avec 3 types d’échantillons d’aliments contaminés artificiellement (laitue, kimbap et épinards). Des cultures fraîches pendant la nuit de B. thuringiensis ont été inoculées dans chaque échantillon alimentaire. La PCR en temps réel a permis de détecter avec succès B. thuringiensis à une concentration de 4,8 × 103, 3,4 × 103 et 1,5 × 103 UFC/g dans la laitue, le kimbap et les épinards, respectivement (figure 3). Cependant, pour les échantillons de kimbap, les valeurs de Ct étaient plus élevées, car il contient généralement des matériaux plus complexes tels que la saucisse, l’œuf ou la carotte par rapport aux légumes.,

Conclusion

Étant donné que les profils biochimiques et génétiques de B. cereus sont très similaires, un nouveau biomarqueur a été développé pour identifier et distinguer B. thuringiensis du groupe étroitement apparenté. La performance de XRE a été comparée au gène cry2 et des échantillons artificiellement contaminés ont également été testés. Comparé à cry2, le gène XRE a été observé pour être efficacement précis dans l’identification de B. thuringiensis. En outre, la PCR en temps réel développée à l’aide de XRE a identifié avec succès B., thuringiensis et il pourrait être utilisé pour quantifier le nombre de cellules avec la courbe étalon obtenue.

Contributions des auteurs

Financement

Ce travail de recherche a été soutenu par le Ministère de l’Agriculture, de la Sécurité des Aliments et des Médicaments (Subvention No 14162MFDS085) de la République de Corée et l’Université nationale de Kangwon en 2015. SW était reconnaissant pour le soutien financier du China Scholarship Council (CSC No: 201408260054). Les auteurs tiennent à remercier Hyun-Ah Lee du Laboratoire central de l’Université nationale de Kangwon pour son soutien technique., RC est reconnaissant pour le soutien financier de la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF) 2018007551.

Déclaration de conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Matériel Supplémentaire