Frontiers in Pediatrics (Français)

Introduction

Les valves urétrales postérieures (VPI) sont la cause congénitale la plus fréquente d’obstruction de la sortie de la vessie chez les enfants (1). Bien que le taux de mortalité par VPI se soit considérablement amélioré avec la prise en charge médicale moderne, l’uropathie obstructive reste une source importante de morbidité à l’âge adulte (2). Jusqu’à 80% des enfants atteints de VPI présentent des symptômes d’incontinence et d’infections des voies urinaires (3)., En outre, jusqu’à 50% des enfants atteints de VPI développeront une insuffisance rénale, l’uropathie obstructive étant la cause congénitale la plus fréquente de transplantation rénale (4). Les feuillets valvulaires obstructifs sont traités chirurgicalement peu après la naissance; cependant, les enfants atteints de VPI développeront une variabilité de la fonction de la vessie tout au long de leur vie. Il a été démontré que la détérioration de la vessie survient souvent après la puberté, avec un besoin croissant de cathétérisme intermittent propre (5).

des études utilisant divers modèles animaux ont démontré que la vessie était sensible aux hormones., Plus précisément, il a été démontré que le remplacement de la testostérone augmente la masse musculaire lisse et le rapport muscle lisse / collagène chez les rats orchiectomisés (6). Un modèle d’obstruction partielle de la sortie de la vessie chez des souris mâles a été étudié et a montré qu’il produisait une hypertrophie du muscle détrusor de la vessie (7). Il a été démontré que la testostérone augmente la fibrose du détrusor en réponse à une lésion d’ischémie–reperfusion chez les lapins castrés (8). Cependant, à ce jour, l’effet des manipulations hormonales sur la réponse de la vessie de la souris mâle aux blessures produites par l’obstruction n’a pas encore été étudié., Par conséquent, nous émettons l’hypothèse que la testostérone participe aux changements fibrotiques inadaptés qui se produisent après une obstruction de la sortie de la vessie.

matériaux et méthodes

modèle D’Obstruction partielle de la sortie de la vessie Murine

toutes les interventions chirurgicales ont été approuvées par le Comité des soins et de L’utilisation des animaux du Stanley Manne Children’s Research Institute. Des souris mâles CD1 de huit à dix semaines (Charles River Labs, Chicago, IL, États-Unis) ont été logées dans des cages séparées pour éviter les changements de taux de testostérone causés par le logement de groupe. Les souris ont été anesthésiées avec 3% d’isoflurane et positionnées en décubitus dorsal., Le bas-ventre a été rasé et préparé avec une solution d’iode. Après avoir assuré une induction satisfaisante de l’anesthésie, une incision de la peau abdominale inférieure de la ligne médiane a été pratiquée et transportée à travers la paroi abdominale. L’obstruction de la sortie de la vessie a été réalisée de la même manière qu’un rapport précédent, mais avec quelques différences (obstruction partielle ou groupe PO) (7). Veuillez noter que l’obstruction partielle est généralement appelée « pBOO », cependant, nous désignerons le groupe de chirurgie et d’expérimentation comme PO., Avec une traction ascendante sur la vessie, une dissection contondante autour du col de la vessie (proximale de la prostate chez les souris mâles) a été réalisée tout en rétractant occasionnellement la vessie caudalement pour assurer une dissection antérieure aux uretères. Une suture en polypropylène 7-0 a ensuite été passée autour du col de la vessie et attachée sur une aiguille de calibre 23 placée à côté de l’urètre. L’aiguille est ensuite retirée., Si les animaux mâles devaient être castrés (obstruction partielle castrée ou CPO), simultanément les testicules étaient sortis de l’incision abdominale, les cordons spermatiques ligaturés avec 6-0 sutures en polypropylène et fortement divisés. La paroi abdominale et la peau ont ensuite été fermées séparément avec des sutures de polyglactine 5-0 de manière interrompue. Les animaux fictifs ont subi une procédure identique jusqu’au point de mobilisation de la vessie. Les animaux ont été autorisés à récupérer, à condition que le carprofène soit dissous dans l’eau potable et sacrifié à 1 ou 4 semaines après les études fonctionnelles décrites ci-dessous., Après le sacrifice par luxation du rachis cervical sous anesthésie isoflurane, les animaux ont été pesés et les vessies ont été disséquées au niveau de la ligature. Chaque vessie a été vidée de l’urine, puis pesée séparément pour 12 souris simulées, 17 PO, 11 CPO et 11 CPOT.

administration de testostérone

Le cypionate de testostérone a été administré au groupe castrat partiellement obstrué au moment de la castration et en postopératoire hebdomadaire à la dose de 10 mg / kg (castrat partielle obstruction testostérone ou CPOT groupe)., Pour les souris ayant reçu un remplacement de testostérone, du sang a été prélevé au moment du sacrifice et envoyé pour un test commercial de testostérone afin de s’assurer qu’elles recevaient un remplacement adéquat (Antech Diagnostics, Irvine, CA, USA).

Voiding Stain on Paper (VSOP)

VSOP a été réalisé les matins des jours postopératoires 1, 7 et 28 pour chaque souris. Les souris ont été maintenues dans des cages métaboliques avec du papier filtre Whatman sous-jacent pendant 2 h et ont eu un accès sans restriction à la nourriture et à l’eau. Des feuilles de papier filtre ont été imagées., Le nombre et la configuration des vides ont été notés et la surface de chaque tache de vide a été mesurée à L’aide D’ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). À l’aide d’une courbe standard créée à partir de l’élimination des taches à partir de volumes connus d’urine, la zone de tache a été convertie en volume annulé. Le volume maximal annulé a été analysé.

analyse histologique

les vessies ont été fixées dans du formol (Sigma) à 10% (p / v) pendant 24 h, incorporées dans de la paraffine et coupées transversalement avec le col de la vessie orienté vers le bas pour produire des sections de 4 µm. Des Sections de souris 4 sham, 4 PO, 4 CPO et 4 CPOT ont été colorées avec le trichrome de Masson., Les Sections ont été imagées à un grossissement de 10× et 40× à l’aide d’un microscope vertical Leica connecté à une caméra et les images ont été stockées numériquement à L’aide D’OpenLab pour Mac. Le rapport Col/SM a été quantifié à L’aide D’Adobe Photoshop comme décrit précédemment et a été établi en moyenne à partir de quatre sections de 40× par vessie. Pour l’immunomodulation, les vessies ont été fixées dans 4% (P/v) de formaldéhyde fabriqué à partir de paraformaldéhyde (em Sciences) pendant la nuit. Les tissus ont été lavés dans les DPBS et équilibrés séquentiellement dans 20% (P/v) et 30% (P/v) de saccharose (Sigma) dans les DPBS., Les tissus ont été congelés dans des moules pelables contenant des OCT (Tissue Tech) dans un bain de glace carbonique isopentane (Sigma).

anticorps D’Immunofluorescence

vessies fixes de souris 3 sham, 3 PO, 3 CPO et 3 CPOT ont été utilisées. Des Sections de 10 µm ont été coupées pour toutes les expériences. Les Sections ont été lavées deux fois dans PBS, incubées pendant 5 min à température ambiante dans PBS + 0,1% Tween (PBT) et bloquées pendant 30 min à température ambiante avec 10% de sérum d’âne dans PBT., La myosine du muscle lisse (SMM) a été détectée de la même manière en utilisant la myosine du muscle lisse de lapin (Biomedical Technologies, 1:100) en conjonction avec L’anticorps secondaire anti-lapin Alexa Fluor 546 donkey (Life Technologies, 1:400).

analyse statistique

Les groupes ont été comparés à L’aide D’ANOVA avec L’analyse post hoc Student–Newman–Keuls. Les résultats avec P < 0,05 ont été considérés comme significatifs. SPSS v22.0 a été utilisé pour l’analyse statistique. Les barres d’erreur dans les figures reflètent SEM.,

résultats

po conduit à des changements fonctionnels déterminés par des études urodynamiques et des taches D’Annulation sur papier

une obstruction partielle de la sortie de la vessie a été réalisée sur des souris CD-1 mâles et comparée à deux groupes: des souris mâles subissant une chirurgie simulée et des souris mâles subissant une obstruction partielle de la sortie de la vessie avec castration. Nous avons mesuré les niveaux sériques de testostérone chez des souris castrées et constaté que les niveaux chutaient à (<20 pg/dL) dans les 24 h suivant l’orchiectomie., Les effets de l’obstruction sur la fonction vésicale ont été déterminés en utilisant des études urodynamiques dans ces trois groupes. La Figure 1A montre des pressions de vidage maximales élevées 1 semaine après l’obstruction chez les souris PO et CPO par rapport aux souris de chirurgie simulée. Des tracés urodynamiques représentatifs montrent également une instabilité à 1 semaine chez les souris PO et CPO (Figure 1C). Les VSOP effectués 1 semaine après l’obstruction reflètent l’effet de l’obstruction sur les souris PO et CPO qui n’est pas observé chez les souris de chirurgie simulée (Figures 1B,D)., Ainsi, notre modèle de PO a eu des effets fonctionnels significatifs sur la miction chez les souris PO et CPO 1 semaine après la chirurgie.

Si l’obstruction du CPO souris a été démontré à 1 semaine, les effets de l’obstruction ont été résolus par les 4 semaines. Les VSOP effectués 4 semaines après l’obstruction démontrent que les souris PO ont des schémas persistants De Void obstructif avec des volumes maximaux vides plus petits que les souris CPO. Au même moment, les souris CPO récupèrent des volumes maximaux annulés similaires aux souris de chirurgie simulée (Figures 3A–C)., Le schéma général sur VSOP des souris CPO est revenu à la normale tandis que les souris PO continuent de démontrer une pulvérisation indiscrète d’urine indiquant une perte de contrôle de la vessie.

le remodelage de la vessie après la PO est altéré par la Castration

Nous avons constaté que les effets sur la fonction de la vessie étaient corrélés aux changements macroscopiques de la vessie de la souris sur les souris PO et CPO. Au moment du sacrifice chez la souris, 4 semaines après la PO, les vessies simulées semblaient de taille normale,mais les vésicules PO et CPO étaient grossièrement agrandies (Figures 2A, C–E)., Après dissection de la vessie distale à la ligature du col de la vessie, les vessies ont été exprimées d’urine et pesées. Ici, nous avons constaté une augmentation du poids de la vessie chez les souris PO par rapport à la fois à la chirurgie simulée et aux souris CPO. Les souris CPO n’ont pas montré d’augmentation de poids par rapport aux souris de chirurgie simulée (Figure 2b). L’évaluation histologique des vessies de ces souris a été réalisée avec la coloration H&E et la surface, la circonférence et l’épaisseur de la vessie ont été comparées., Les souris CPO et PO ont montré une augmentation de la surface et de la circonférence par rapport aux souris de chirurgie simulée, reflétant les changements dus à des pressions vésicales élevées après PO (Figures 2F,H). Cependant, une augmentation de l’épaisseur de la vessie n’a été observée que chez les souris PO (Figure 2G). Ceci est corrélé avec le poids inférieur de la vessie chez les souris CPO, suggérant que l’augmentation de la taille de la vessie est principalement due à « l’étirement” du muscle de la vessie par opposition à une véritable hypertrophie ou hyperplasie des muscles de la vessie.

la fibrose vésicale augmente à la suite d’une Obstruction partielle de la sortie de la vessie

afin de déterminer si l’augmentation de la masse vésicale et de l’épaisseur de la paroi vésicale était due uniquement à une hypertrophie / hyperplasie musculaire ou si un composant de la fibrose était en cause, un examen histologique des vessies de souris simulées, PO et CPO a été effectué 4 semaines après l’obstruction. Cela a été fait en utilisant à la fois la coloration au trichrome de Masson et l’immunofluorescence spécifique au marqueur de fibrose (Figure 4)., Comme prévu, chez les souris PO, après obstruction, les vessies ont augmenté les rapports Col / SM. Avec la castration, l’augmentation du rapport Col / SM n’a plus été trouvée (Figure 4B). Bien que le volume de la vessie Luminale ait augmenté chez les souris CPO, la couche musculaire n’a pas montré d’hypertrophie, comme en témoigne la même épaisseur de paroi de la vessie que les souris de chirurgie simulée. De plus, l’évaluation des marqueurs spécifiques de la fibrose vimentine, Col1a1 et FSP-1 par immunofluorescence a démontré une expression accrue chez les souris PO par rapport aux souris simulées, avec une diminution correspondante de l’expression chez les souris CPO., Il semble que la castration crée des conditions dans lesquelles le remodelage de la vessie non fibrotique se produit, plaidant pour un rôle potentiel de la testostérone spécifiquement dans la médiation d’une réponse fibrotique à une lésion de la vessie.

L’Introduction de testostérone exogène inverse les effets bénéfiques de la Castration suite à une Obstruction partielle de la sortie de la vessie

Nous Avons montré que la castration dans le cadre de PO atténuera le remodelage post-obstructif en ce qui concerne l’hypertrophie / hyperplasie de la vessie et la fibrose. Pour démontrer qu’il s’agit d’une réponse spécifique à la testostérone, après la castration, une cohorte de souris a subi une supplémentation en PO et en testostérone. Ici, nous avons utilisé soit la testostérone ou son produit réduit dihydrotestostérone (DHT)., La DHT a 10 fois l’affinité pour le récepteur des androgènes par rapport à la testostérone et ne peut pas être aromatisée en œstrogène, ce qui réduit la probabilité que les changements qui se produisent à partir de la supplémentation en testostérone sont dus à l’augmentation des niveaux d’œstrogènes. Les volumes maximaux annulés tels que déterminés par VSOP étaient significativement plus faibles chez les souris CPO plus testostérone (CPOT) ou CPO plus DHT (CPOD) que chez les souris CPO (Figure 5A). Les changements macroscopiques et microscopiques observés chez les souris PO (mais pas chez les souris CPO) sont réapparus dans les vessies CPOT et CPOD., Le poids de la vessie a été significativement augmenté chez les souris CPOT et CPOD par rapport aux souris CPO (Figure 5B). Les vessies CPOT et CPOD présentaient également des rapports Col/SM plus élevés que les vessies CPO (Figure 5D). Les marqueurs de fibrose ont également été augmentés dans le CPOT et le CPOD par rapport aux vessies de CPO,tout comme la réaction à la tache trichrome de Masson (Figures 5C, E). Ces résultats démontrent que le remplacement exogène de la testostérone chez les souris mâles castrées rétablit complètement les effets pathologiques de l’obstruction de la vessie., En somme, les effets de la castration et du remplacement de la testostérone soutiennent fortement un rôle pour l’androgène masculin dans la pathogenèse de l’obstruction de la vessie.

Discussion

les Garçons nés avec PUV subissent une résection chirurgicale de la obstructive folioles peu après l’accouchement. Cependant, malgré la réduction de l’obstruction de la sortie de la vessie chez ces enfants, de nombreux patients atteints de VPI progressent vers une détérioration de la vessie nécessitant un cathétérisme intermittent propre pour vider adéquatement la vessie (3). Ces changements ont souvent été observés après la puberté., Les changements cliniques chez les patients ayant des valves réséquées étaient auparavant attribués à des changements physiologiques associés à l’adolescence tels qu’une filtration urinaire accrue et non à des changements hormonaux (1, 5, 9). Cependant, nos résultats suggèrent que l’androgène peut jouer un rôle plus important que précédemment apprécié. Nous constatons que la présence ou l’absence d’androgène affecte spécifiquement les changements cellulaires qui se produisent après l’obstruction, en particulier la fibrose.,

Les informations provenant d’études dans lesquelles la testostérone a été complétée chez des patients atteints d’une maladie des voies urinaires inférieures pourraient donner un aperçu des effets des androgènes sur la maladie de la vessie. Ces données sont relativement rares, provenant en grande partie d’études observationnelles rétrospectives ou prospectives et d’études dans lesquelles la testostérone a été administrée à des hommes hypogonadaux ou eugonadaux. Cependant, ces études suggèrent que la supplémentation en testostérone n’aggrave pas les lut (10, 11)., Plus précisément, plusieurs études ont démontré une amélioration du score IPSS chez les hommes recevant une supplémentation en androgènes, bien que beaucoup d’entre eux n’aient pas spécifiquement étudié les hommes présentant une obstruction de la sortie de la vessie connue, mais incluent plutôt une cohorte traitée avec une supplémentation en testostérone et ayant divers degrés de LUTS à la base. Une étude a exclu les patients présentant une obstruction connue du col de la vessie. Koritsiadis et coll., a comparé spécifiquement les symptômes et les paramètres urodynamiques sur des études pression-débit chez des hommes hypogonadaux et eugonadaux et a constaté que le taux sérique de testostérone était négativement corrélé à la pression du détrusor au débit maximal, mais pas à L’IPSS ou à tout autre paramètre urodynamique (12).

L’effet de la testostérone sur le muscle détrusor de la vessie a également été étudié dans des modèles animaux. Tek et ses collègues ont constaté que la supplémentation en testostérone de rats castrés chirurgicalement entraînait une diminution du rapport collagène / muscle lisse et une augmentation de la capacité cystométrique (13). Shortliffe et coll., (14) ont constaté que le remplacement de la testostérone chez les rats castrés chirurgicalement était également associé à une augmentation du muscle lisse de la vessie ainsi qu’à une augmentation de la masse vésicale (14). Ensemble, ces études indiquent que chez les rats non obstrués, la testostérone stimule la croissance du muscle lisse détrusor par un mécanisme encore flou. Dans un modèle de lésion vésicale ischémie-reperfusion chez le lapin mâle, Chuang et al. a démontré que la castration était protectrice en diminuant la fibrose vésicale et en diminuant l’expression de divers marqueurs liés à la fibrose (8)., La supplémentation en testostérone de ces lapins castrés a entraîné une augmentation de la fibrose du détrusor suite à une lésion de la vessie. Nos résultats reflètent ces résultats et représentent la première étude de l’effet de la testostérone sur la réponse à une lésion vésicale de la PO chez des souris juvéniles.

en même temps, le manque de résultats dans la littérature nous a surpris par nos premières conclusions. Une préoccupation potentielle que nous avions était que les souris n’étaient pas suffisamment obstruées et que nos résultats chez les souris castrées représentaient un groupe dans lequel l’obstruction ne se produisait tout simplement pas., En fin de compte, nous savons que ce n’est pas vrai parce que les vessies du groupe CPO avaient initialement des taches annulantes comme le groupe obstrué, avaient des pressions anormales par cystométrie et avaient des vessies remodelées. En fait, les vessies des souris CPO étaient très différentes de celles des shams, ce qui indique que la chirurgie PO a produit des effets profonds. Notre interprétation de ces résultats est que dans les heures suivant la chirurgie, la pression augmente dans la paroi de la vessie et que, chez les souris normales, des collagènes et d’autres matrices de raidissement sont construits pour empêcher la rupture de la vessie dans l’abdomen., Les vessies de souris CPO présentaient très peu de dépôts de collagène dans le muscle détrusor, mais en même temps, devenaient très grandes avec des parois minces. Il est possible que lorsque la réponse fibrotique est altérée dans une vessie à haute pression, elle s’étire pour accueillir l’urine qui s’accumule. Ceci est typique de ce que nous avons observé dans les vessies CPO, mais pas PO et CPOT. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que le rôle de la testostérone peut être spécifiquement dans la médiation de la fibrose dans la paroi de la vessie.,

bien que nos travaux aient spécifiquement utilisé un modèle de vessie pour déterminer le rôle de la testostérone sur la fibrose musculaire en réponse à une lésion musculaire lisse, nous pensons que cette recherche s’avérera importante dans de nombreux processus de maladies fibrotiques qui ont une association sexuelle. En fait, cela a été soutenu par quelques études dans la littérature. Cho et coll. a démontré que l’orchiectomie atténuait la fibrose rénale observée après une obstruction urétérale. Dans un modèle murin d’obstruction urétérale unilatérale, les reins de souris mâles ont montré une expression accrue de l’alpha-SMA et du dépôt de collagène (15)., Semblable à notre modèle d’obstruction de la vessie, cette réponse fibrotique a été minimisée si une orchiectomie concomitante a été réalisée avec une obstruction urétérale. Des résultats analogues ont été rapportés dans un modèle murin de fibrose cardiaque secondaire à une surcharge de pression. Ici, les changements fibrotiques dans le ventricule gauche ont été atténués par orchiectomie. Cela comprenait un émoussement de la voie de signalisation TGFß, connue pour être importante pour promouvoir la différenciation des myofibroblastes (16). La fibrose cardiaque et rénale liée à l’âge a également été atténuée par orchiectomie chez les souris mâles (17)., En outre, dans une étude menée par Zhu et ses collègues, le récepteur des androgènes sur les cellules musculaires lisses vasculaires a été impliqué dans la calcification des muscles lisses stimulée par la testostérone. En utilisant des cellules musculaires lisses vasculaires dérivées d’une souris knockout à récepteur d’androgène spécifique au muscle lisse, la calcification a été émoussée en réponse au traitement à la testostérone par rapport aux cellules musculaires lisses de type sauvage (18). Ainsi, un nombre croissant d’études, y compris la nôtre, trouvent une association entre la testostérone et les changements pathologiques associés à la fibrose.,

le mécanisme derrière le rôle de la testostérone dans la modulation de la réponse du détrusor aux blessures reste inexpliqué. D’autres travaux sur les effets en aval de la testostérone dans le muscle détrusor pourraient révéler de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être utilisées pour prévenir ou au moins améliorer le remodelage tissulaire indésirable observé dans le cadre de PO. De plus, des études dose-réponse pourraient être menées pour déterminer à quelles concentrations sériques de testostérone conduisent à un remodelage indésirable. Il a été démontré que l’œstrogène atténue l’hypoxie tissulaire et les lésions du détrusor associées chez les modèles animaux., Une étude plus approfondie de l’interaction entre la testostérone et l’œstrogène dans la modulation de la réponse du muscle détrusor aux blessures peut également aider à élucider davantage cette voie.

Conclusion

Les souris mâles juvéniles présentant une obstruction partielle de la sortie de la vessie ont des vessies à haute pression plus petites et fibrotiques. La Castration a été associée à des volumes vides plus importants, à un poids de la vessie plus faible et à une fibrose du détrusor moins importante. Le remplacement de la testostérone chez les souris castrées a inversé ces effets., Cela indique que la testostérone joue un rôle dans la modification des altérations du muscle détrusor après une obstruction partielle de la sortie de la vessie chez la souris. Ainsi, nous suggérons que des niveaux accrus de testostérone chez les garçons atteints de VPI peuvent contribuer à la diminution de la fonction vésicale.

énoncé D’éthique

Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations du Comité des directives chirurgicales, des soins et de l’utilisation des animaux. Le protocole a été approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux.

contributions des auteurs

collecte et analyse des données AF, PF, DB, NK et GS., AF, PF, RD et EG conception, conception et écriture manuscrite.

déclaration de conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Financement

cette recherche a été financée par L’Association Hartwell à EG.