les acides gras à chaîne moyenne diminuent le cholestérol sérique par réduction de la réabsorption des acides biliaires intestinaux chez les souris C57BL/6j

animaux et régimes alimentaires

Les souris mâles C57BL/6 J (4 semaines, n = 80) ont été achetées à L’Institut des Sciences Animales de laboratoire, Académie chinoise des Sciences médicales (Licence No. SCXK: JING2009–0007) et logé dans une pièce à température contrôlée (22 ± 2 °C, 40% à 60% d’humidité) avec un cycle lumière/obscurité de 12 h., Le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Hôpital général chinois PLA a approuvé toutes les procédures expérimentales.

Les souris ont reçu un régime basal (régime AIN-93G, acheté à l’Académie des Sciences médicales Militaires) au cours de la première semaine pour s’adapter. Dix souris ont été choisies au hasard et ont reçu un régime de base comme témoin normal, et les souris restantes ont reçu un régime riche en cholestérol (CR) modifié par rapport au régime AIN-96G. Des échantillons de sang ont été prélevés sur le plexus veineux mandibulaire deux semaines plus tard., Les souris dont les taux sériques de TC étaient supérieurs de 2 écarts-types au témoin normal (représentant 67% des souris nourries au régime CR) ont été assignées au hasard à trois groupes (n = 12 dans chaque groupe). Chaque groupe a reçu un régime alimentaire différent pendant 16 Semaines (Tableau 1): triglycérides riches en cholestérol et à chaîne moyenne (CR-MCT), triglycérides riches en cholestérol et à chaîne longue (CR-LCT) ou CR. Nisshin Oillio (Tokyo, Japon) a fait don des SCTM (C8:0 et C10:0) et des LCT (triglycérides à longue chaîne, huile de soja). Le cholestérol a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)., Le Beijing Institute of Nutrition Resources (Beijing, Chine) a mesuré les compositions en acides gras des régimes CR-MCT et CR-LCT (Tableau 2). Le poids corporel et l’apport alimentaire ont été surveillés chaque semaine.,

prélèvement de sang, D’iléon, de bile et de fèces

cinq souris ont été choisies au hasard dans chaque groupe après 16 semaines d’alimentation pour enregistrer l’apport alimentaire et l’excrétion de fèces à l’aide de cages métaboliques séparées pendant 3 jours., Les matières fécales ont été lyophilisées, pesées, pulvérisées et stockées à − 80 °C pour une analyse plus approfondie. Toutes les souris ont été à jeun pendant la nuit (environ 12 h) avant le prélèvement d’un échantillon sanguin dans l’aorte ventrale sous anesthésie (chlorhydrate de xylazine). Le sérum a été prélevé après centrifugation des échantillons de sang. Une microcapsule a été utilisée pour perforer la paroi de la vésicule biliaire et extraire la bile, et chaque échantillon de bile a été centrifugé à 16 000 g pendant 30 min. Le surnageant a été recueilli et stocké à − 80 °C., Les tissus de l’iléon ont été excisés et rincés avec une solution saline glacée, et des portions ont été immédiatement stockées à-80 °C pour une analyse plus approfondie.

mesure des profils lipidiques sériques

La TC sérique et les triglycérides (TG) ont été déterminés à la fin de l’expérience à l’aide de kits commerciaux de Wako (Osaka, Japon). Les lipoprotéines-cholestérol de haute densité (HDL-C) et les lipoprotéines-cholestérol de basse densité (LDL-C) ont été mesurées à l’aide de méthodes de sédimentation et d’un kit commercial D’Abcam (Cambridge, Royaume-Uni). L’acide biliaire total sérique (TBA) a été mesuré à l’aide d’un kit commercial de Blue Gene (Shanghai, Chine)., Toutes les instructions du fabricant ont été strictement suivies.

Analyse des acides biliaires dans les fèces et la bile à l’aide de HPLC-MS

Les méthodes de préparation et de détermination des acides biliaires dans les fèces et la bile ont été effectuées selon notre étude précédente et les rapports de Steiner et al. . Un système de chromatographie liquide haute performance Shimadzu LC-20 AD (Shimadzu, Kyoto, Japon) couplé à un spectromètre de masse Applied Biosystecm 3200 Q TRAP avec une source d’ionisation par électrospray (ESI) (Applied Biosystems, Carlsbad, États-Unis) a été utilisé. Les systèmes HPLC et MS ont été contrôlés à l’aide de l’analyste 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Les matériaux susmentionnés ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). Les acides biliaires primaires, y compris CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA et GCDCA, et les acides biliaires secondaires, y compris DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA et GDCA, dans la bile et les fèces ont été déterminés par les temps de rétention.

PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)

Des échantillons de tissu de l’intestin grêle (environ 100 mg) ont été lavés avec du PBS glacé et homogénéisés. L’ARN total des tissus et des cellules a été isolé à l’aide du réactif Trizol (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, no. R6812). Les amorces ont été conçues à l’aide de Primer Express 3.,0 logiciel basé sur les séquences d’ARNm d’une base de données (Tableau 3) et synthétisé par Invitrogen (Beijing, Chine). Les méthodes d’extraction D’ARN et de PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) sont décrites dans nos publications précédentes. la qRT-PCR a été réalisée à l’aide D’un kit SYBR® PrimeScript® RT-PCR en une étape (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Chine). L’Amplification a été réalisée à l’aide D’un thermocycleur BIO-RAD iCycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Les niveaux d’expression relatifs de l’ARNm ont été déterminés à l’aide de la méthode du seuil critique comparatif (Ct) (dans un tube séparé)., Le gène d’entretien β-actine a été utilisé comme témoin pour la normalisation.

Analyse Western blot

Les analyses Western blot du tissu de l’intestin grêle et des cellules cultivées ont été effectuées comme décrit précédemment . Des quantités équivalentes de protéines de chaque échantillon ont été préparées et séparées à l’aide de SDS-PAGE (12% de gels), suivies d’un électrotransfert aux membranes PVDF., Les Membranes ont été incubées avec une solution de blocage (solution saline tamponnée Tris, lait sec non gras à 8%) pendant 2 h, puis incubées avec des anticorps spécifiques à 4 °C pendant la nuit. Les Membranes ont été largement lavées dans le TBST (solution saline tamponnée Tris avec Tween, contenant 0,5% de Tween-20 dans le SCT) et incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort dans le TBST pendant 1 h. Les Membranes ont été lavées plus loin dans le TBST, et des bandes ont été détectées à l’aide d’agents de détection par chimiluminescence. La densitométrie des taches a été réalisée et les bandes ont été analysées à l’aide du logiciel ImageJ., Des anticorps ciblant le transporteur apical d’acide biliaire dépendant du sodium (ASBT), la protéine de liaison aux acides biliaires iléaux (I-BABP) et le transporteur de soluté organique α/β (Osta/β) ont été achetés auprès D’Abcam (Cambridge, Royaume-Uni). Des anticorps secondaires contre les IgG de chèvre ont été obtenus à partir de Sun Biomedical Technology Co. (Beijing, Chine).

Immunofluorescence

des tissus D’iléon fixés avec du paraformaldéhyde tamponné à 4% ont été incrustés dans la paraffine et des sections de 4 µm d’épaisseur ont été préparées. Les Sections ont été déparaffinisées et trempées dans 3% D’H2O2 pendant 15 min pour bloquer la peroxydase endogène., Les Sections ont été lavées dans du PBS et incubées avec un anticorps anti-I-BABP dans du PBS (dilution 1:50) pendant 1 h à 37 °C. un anticorps conjugué au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) a été ajouté à une dilution 1: 50 et incubé pendant 0,5 h à 37 °C. Les Sections ont été lavées et le PI (iodure de propidium) a été utilisé pour tacher les noyaux. I-BABP a été imagé à l’aide d’un microscope à fluorescence (Bx60, Olympus, Ina, Japon). I-BABP a été observé en fluorescence verte, et le noyau a été observé en fluorescence rouge .,

culture de cellules Caco-2

la lignée cellulaire Caco-2 a été obtenue auprès du Centre de ressources cellulaires, Peking Union Medical College (qui est le siège de L’Infrastructure nationale de ressources de lignées cellulaires) le Septembre. 20, 2016. La PCR et la culture ont confirmé que la lignée cellulaire a été vérifiée exempte de contamination par des mycoplasmes. L’origine spécifique de ces cellules a été confirmée par PCR. L’identité de la lignée cellulaire a été authentifiée à l’aide du profilage STR (FBI, CODIS) . Tous les résultats sont disponibles sur le site (http://cellresource.cn)., Des cellules Caco – 2 ont été cultivées dans le milieu D’Aigle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 1% de pénicilline-streptomycine et 1% d’acides aminés non essentiels. Les cellules Caco – 2 ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 et 95% d’air. Le support a été changé tous les 2 jours. Le DMEM, le FBS, 1% d’acides aminés non essentiels et d’autres matériaux ont été achetés auprès de L’Infrastructure nationale de Cell Line Resource (Beijing, Chine) ou de Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, États-Unis).,

analyse de perméabilité à l’acide caprylique à travers des monocouches de cellules Caco-2

pour des expériences de réabsorption des acides biliaires, se référant au rapport de Y. Wang, et al. , des cellules ont été ensemencées et cultivées sur des Inserts de culture de cellules suspendues Millicell (0,4 µm, Millipore, Molsheim, France) pendant 21 jours pour obtenir des monocouches cellulaires confluentes et hautement différenciées. La formation de monocouches épithéliales fonctionnelles a été surveillée par mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER) à l’aide d’un Millipore (Millipore) avant les expériences., La morphologie cellulaire a été observée au microscope électronique et la perméabilité a été déterminée en utilisant Lucifer Yellow (Sigma, MO, USA) comme marqueur.

la préparation d’acides gras et de CA a été effectuée comme décrit par X. Zhang, et al. . Les acides gras et le CA ont été mesurés et dissous dans l’éthanol, puis dilués avec un milieu de culture cellulaire contenant 20 mg/L de BSA sans endotoxine jusqu’à une concentration finale de 50, 100 ou 200 µmol/L (éthanol< 0,1%). Les acides gras dissous et le CA ont été incubés dans un bain d’eau à 37 °C pendant 1 h avant d’être ajoutés aux cellules., L’acide caprylique (C8:0), l’acide caprique (C10:0), l’acide stéarique (C18:0) et l’acide oléique (C18:1) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA).

les côtés apical (AP) et basolatéral (BL) de la monocouche ont été lavés avec la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et équilibrés dans un milieu complet sans sérum pendant 15 min. Le milieu dans L’AP a été remplacé par un milieu frais contenant du CA (200 µmmol / L) ou mélangé à l’un des acides gras (C8:0, C10:0, C18:0 ou C18:1) à 50, 100 ou 200 µmol/L., La viabilité cellulaire des cellules Caco-2 dans différentes conditions a été évaluée par le test de cytotoxicité des cellules WST – 1 (fig. 1). Le milieu contenant l’un des acides gras a été défini comme le « groupe C8:0, C10:0, C18:0 ou C18:1”. Le  » groupe témoin « ne contenait pas d’acides gras, et le” groupe vide » manquait de CA et d’acides gras. Seul un milieu frais a été utilisé dans le BL. Les milieux des côtés AP et BL ont été enlevés 2 h PLUS TARD et stockés pour des analyses de CA en utilisant HPLC-MS., La perméabilité apparente (Papp) a été calculée à l’aide de L’équation suivante: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ est l’apparence du composé dans le compartiment récepteur, dt est le temps, C0 est la concentration dans le compartiment donneur et A est la surface de l’insert).

niveaux d’expression de I-BABP dans les cellules Caco-2

Les cellules Caco-2 ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits (Corning, NY, USA) et cultivées jusqu’à la confluence totale avec une babp . Le milieu de culture a été remplacé avant les expériences par un milieu contenant du FBS délipidisé pendant 24 h., Les cellules ont été lavées avec une solution saline glacée tamponnée au phosphate (PBS) et incubées avec un milieu frais contenant du CA À 200 µmol/L (défini comme groupe CA) ou du CA mélangé à l’un des acides gras (C8:0, C10:0, C18:0 ou C18:1) à 200 µmol/L (défini comme le « groupe C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA ou C18:1+CA”) ou C10:0 à 200 µmol/L Sans CA (défini comme « groupe C8:0 et groupe C10:0”) pendant 24 h. et le groupe vide était sans acides gras et sans ca. Le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS glacé., L’ARN Total et la protéine ont été isolés et collectés pour des analyses plus poussées des niveaux d’expression de l’ARNm et de la protéine I-BABP.

analyse statistique

toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. Les données ont été analysées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance suivie d’un test T indépendant pour déterminer l’importance de la différence entre les groupes à l’aide du logiciel SPSS version 17.0. P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.