protéines membranaires intégrales
Les protéines membranaires intégrales (PMI) servent de passerelles aux cellules. Toutes les cellules et organites sont enfermés dans une bicouche lipidique imperméable et les PMI que nous étudions sont incorporés dans ces membranes. Ils sont les voies d’entrée et de sortie de nombreux ions, nutriments, déchets, hormones, médicaments et grosses molécules telles que les protéines et L’ADN. Ils sont également responsables d’une grande partie de la communication entre les cellules et leur environnement., Les cellules peuvent fabriquer une grande variété de ces protéines, environ 30% des gènes du code du génome humain pour les protéines membranaires, et pourtant nous savons relativement peu de choses sur ces molécules.
Les protéines membranaires sont malheureusement notoirement difficiles à manipuler et à étudier car elles sont conçues pour se situer dans l’environnement hydrophobe de la bicouche lipidique. Ils ont tendance à être instables lorsqu’ils sont extraits de leur environnement natal et nous devons ajouter des détergents pour couvrir la surface hydrophobe., Afin de comprendre et de contrôler la fonction de ces protéines, il est essentiel d’avoir des informations sur leur structure tridimensionnelle, qui est généralement obtenue par cristallographie aux rayons X. Cependant la difficulté de manipulation de ces protéines a rendu difficile la résolution des structures, et à ce jour il existe moins de 300 structures de protéines membranaires connues, soit moins de 0,5% de toutes les structures connues. Pour les eucaryotes supérieurs, l’histoire est encore plus dure, avec seulement 20 structures d’IMPs humains et moins de 50 IMPs mammifères résolus., Les protéines membranaires sont donc l’une des frontières les plus importantes de la recherche en biologie structurale. Au SGC, nous appliquons maintenant nos méthodes de pointe à haut débit pour surmonter les goulots d’étranglement dans la recherche sur les protéines membranaires, afin de pouvoir fournir de manière fiable des échantillons de protéines membranaires pures et des structures de ces molécules fascinantes et médicalement critiques.
santé
L’importance médicale de cette énorme famille de protéines ne peuvent pas être surestimée., Les Mutations dans les protéines membranaires sont impliquées dans de nombreuses maladies courantes, y compris les maladies cardiaques, où des canaux ioniques défectueux sont souvent impliqués. Les médicaments ciblés sur les canaux calciques peuvent contrôler des problèmes tels que l’hypertension artérielle et l’angine de poitrine. Les protéines membranaires sont impliquées dans le cancer, où des erreurs dans les voies de signalisation peuvent conduire à la division des cellules hors de contrôle. Souvent, des protéines membranaires spécifiques sont surproduites dans les cellules cancéreuses et sont donc des cibles pour le traitement médicamenteux. Les maladies du cerveau telles que la migraine, la dépression et la maladie d’Alzheimer sont toutes liées à des problèmes de transporteurs et de canaux., La fibrose kystique est causée par des mutations dans le gène régulateur de conductance transmembranaire (CFTR) de la fibrose kystique qui code un canal ionique chlorure.
étant donné que de nombreuses protéines membranaires se trouvent à la surface des cellules, elles sont facilement disponibles pour les médicaments à petites molécules circulant dans le sang. Il n’est donc pas surprenant que plus de 50% des médicaments à petites molécules se lient aux protéines membranaires. Les récepteurs et canaux couplés aux protéines G sont particulièrement importants à cet égard, mais les transporteurs ABC et les porteurs de solutés sont également des cibles pour le traitement médicamenteux., Notre compréhension de nombreuses autres maladies et notre capacité à traiter ces maladies bénéficieraient grandement d’informations plus structurelles et fonctionnelles sur les protéines impliquées. Nous espérons qu’en résolvant les structures de ces protéines, en comprenant la biochimie sous-jacente et les interactions avec les substrats et les inhibiteurs, nous pourrons fournir des traitements plus efficaces pour de nombreuses maladies.
le SGC et les protéines membranaires intégrales
le SGC possède une vaste expérience dans la résolution de structures de protéines humaines solubles à l’aide de systèmes très efficaces et à haut débit., Au cours des deux dernières années, nous avons adapté ces méthodes à la résolution de structures pour les protéines membranaires humaines. Nous avons passé au crible 186 protéines membranaires humaines de diverses familles, en sélectionnant une série de constructions pour chaque protéine, en identifiant des détergents appropriés pour la purification, puis en augmentant la purificaiton et en cristallisant ces protéines. Nous avons cristallisé 3 protéines membranaires et résolu notre première structure, un processus qui a pris moins de deux ans du premier clone à la structure.,
Nous avons résolu la première structure d’un transporteur ABC humain, une classe de protéines impliquées dans le transport de petites molécules, la multirésistance aux médicaments et des maladies telles que la fibrose kystique et le diabète. Notre première cible réussie est le transporteur ABC mitochondrial humain, ABCB10, qui est intégré dans la membrane interne des mitochondries. ABCB10 est surexprimé pendant la différenciation érythroïde, le processus qui forme les globules rouges. il est surexprimé dans la moelle osseuse, le cœur et le foie., Il est maintenant prouvé que lorsque L’expression D’ABCB10 est réduite dans les cellules, elles sont plus sensibles au stress oxydatif et que ABCB10 peut être impliqué dans la protection du cœur lors d’une crise cardiaque.
Technologies pour l’étude des PMI
Nous développons des méthodes génériques qui permettent la détermination à haut débit des structures des protéines membranaires humaines. Nous avons sélectionné le système d’expression des cellules baculovirus/insectes qui fournit une composition lipidique proche de celle des cellules humaines et constitue une plate-forme éprouvée à haut débit., Pour chaque protéine cible, nous générons une série de constructions de longueur variable et de balises d’affinité différentes, y compris le gène de longueur totale et une série de troncations pour éliminer les régions potentiellement désordonnées. Un écran d’expression à haut débit est utilisé pour identifier les protéines qui peuvent être utilisées pour purifier des quantités de milligrammes D’IMP pour la cristallisation. Chaque protéine est initialement purifiée dans un détergent dodécyl maltoside (DDM) et est ensuite filtrée pour la stabilité dans une série de détergents différents afin d’identifier les conditions optimales de stabilité et de cristallisation.,
Nous avons établi des méthodes pour la cristallisation nanodrop à haut débit et la manipulation de cristaux de protéines membranaires fragiles. Nous avons développé des systèmes efficaces pour le criblage des cristaux de protéines membranaires pour la qualité de diffraction en tant que méthode d’optimisation des conditions de cristallisation. Nous avons également optimisé notre collecte de données et notre analyse de données de diffraction à l’aide de lignes de faisceau microfocus synchrotron intenses, disponibles dans des ressources telles que Diamond Light Source Ltd, dans L’Oxfordshire., Dans la mesure du possible, la cristallisation est réalisée avec des ligands et des inhibiteurs liés pour capturer une conformation native unique et fournir des informations clés sur la fonction et la conception du médicament. Nous prévoyons également de générer des fragments d’anticorps contre nos protéines purifiées pour les utiliser comme réactifs d’affinité et aides à la cristallisation.
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