Les anticorps sont des glycoprotéines d’immunoglobuline (Ig) produites par les plasmocytes (cellules B) en réponse à des molécules antigéniques étrangères (immunogènes). La fonction principale des anticorps est de se lier spécifiquement à ces antigènes étrangers pour les désactiver et / ou les marquer pour la destruction par le système immunitaire, protégeant ainsi l’hôte contre l’infection. Il existe plusieurs classes d’anticorps., La première partie de ce résumé se concentre sur les anticorps classiques de taille normale, les anticorps de classe IgG et IgM, qui sont fortement utilisés dans une multitude d’applications biomédicales de recherche, de diagnostic et thérapeutiques.
l’Unité de base d’un anticorps classique est une unité de quatre polypeptides composée de deux chaînes lourdes identiques et de deux chaînes légères identiques maintenues ensemble par des liaisons disulfures. Les chaînes légères sont plus courtes, avec des poids moléculaires plus faibles que les chaînes lourdes., La forme générale d’un anticorps est un Y, avec une région de charnière flexible (interdomaine) au centre du Y. La flexibilité de la région de charnière interdomaine est importante pour la liaison bivalente d’un anticorps , permettant aux deux poches de liaison d’interagir avec les sites antigéniques à des distances variables. Chaque chaîne polypeptidique a une région constante qui ne varie pas significativement entre les anticorps, et une région variable, qui est spécifique à chaque anticorps. La notation commune pour la région variable de la chaîne légère est VL et pour la région constante de la chaîne légère est CL (Figure 1)., La notation est similaire pour la variable de chaîne lourde (VH) et les régions constantes (CH) avec CH1, CH2 et CH3 désignant les différents domaines de région constante de la chaîne lourde. Les glucides sont normalement attachés aux domaines CH2 des chaînes lourdes. La région cristallisable de fragment (Fc) ne contient que des régions constantes des chaînes lourdes (CH), mais la région de liaison à l’antigène de fragment (Fab) comprend à la fois un domaine constant et les domaines variables des chaînes lourdes et légères (VH et CL). La région FV de région de variable de fragment contient seulement les deux domaines variables (Figure 1)., Voir anticorps de souris pour une discussion sur les isotypes d’immunoglobuline, les sous-classes et le nombre de domaines d’immunoglobuline.
chaque anticorps complet possède deux poches de liaison à l’antigène, situées dans les régions FV, et peut se lier à deux antigènes (liaison bivalente)., Cependant, si les deux antigènes sont trop proches (≤3 nm) ou trop éloignés (≥29 nm), l’anticorps ne peut se lier qu’à un seul antigène (liaison monovalente). Il existe un changement d’affinité significatif entre les liaisons monovalentes et bivalentes avec un changement de 1 500 fois les valeurs de Kd .
La structure des anticorps spécifiques est disponible à partir de la Base de données des anticorps structuraux (SAbDab), une base de données organisée des structures d’anticorps accessibles au public, ainsi que des outils de modélisation structurelle, qui est mis à jour chaque semaine à partir de la Banque de données sur les protéines (PDB) .,
Les anticorps classiques de taille normale sont utilisés dans la recherche pour la détection des protéines par analyse Western blot , immunohistochimie et tests immunosorbants enzymatiques (ELISA) depuis des décennies. Des anticorps grandeur nature ont également été développés pour des applications diagnostiques telles que les tests de grossesse et la détection de bactéries et de virus dans le sang, comme un ELISA qui détecte le VIH. De plus, les anticorps classiques de taille normale sont couramment utilisés dans les traitements de la maladie., Par exemple, l’infliximab est l’un des nombreux anticorps disponibles qui reconnaissent le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) et il est utilisé dans le traitement de la maladie de Crohn et de la polyarthrite rhumatoïde . Le trastuzumab, ou Herceptin, est un anticorps qui se lie au récepteur 2 du facteur de croissance épidermique et est utilisé dans le traitement du cancer du sein métastatique . Il existe également plusieurs traitements à base d’anticorps, dont le Muromonab , administrés aux receveurs de greffe pour prévenir le rejet d’allogreffe.,
bien que les anticorps classiques de taille normale puissent tous deux être utilisés pour des applications thérapeutiques, l’utilisation de l’anticorps complet présente des avantages et des inconvénients. Un avantage important des anticorps conventionnels est le fait que la région Fc engage la réponse immunitaire du corps et peut cibler les antigènes liés pour la destruction. Cette région Fc peut également être un inconvénient dans certaines applications cliniques, car la réponse immunitaire qu’elle suscite généralement peut être préjudiciable à la santé du patient., De plus, les anticorps de taille normale ne peuvent pas bien pénétrer dans certains tissus en raison de leur taille relativement grande . Dans certains cas, lors de l’utilisation d’anticorps grandeur nature pour des applications de diagnostic, le domaine Fc peut provoquer une liaison non spécifique importante, ce qui peut nuire aux applications de détection.
Pour de nombreuses applications, les fragments d’anticorps sont préférables. Les fragments d’anticorps peuvent être produits par des mécanismes chimiques ou génétiques., La fragmentation chimique utilise des agents réducteurs pour briser les liaisons disulfure dans la région de charnière et la digestion de l’anticorps avec des protéases, y compris la pepsine, la papaïne et la ficine. La construction génétique des fragments offre la possibilité de créer une multitude de molécules contenant des fragments, chacune avec des caractéristiques de liaison et fonctionnelles uniques.
la digestion chimique et protéase d’anticorps IgG ou IgM de grande taille donne des fragments de liaison à l’antigène (Fab; Figure 1) et des fragments Fc, composés uniquement des domaines CH2 et CH3 de la chaîne lourde., Les méthodes biochimiques de génération de fragments d’anticorps produisent des outils utiles pour des applications diagnostiques et thérapeutiques, mais elles sont assez laborieuses et nécessitent une grande quantité de matériau de départ d’anticorps.
Les fragments de liaison à l’antigène produits par la digestion biochimique comprennent Fab, (Fab’)2, Fab’ et FV, tous dépourvus de région Fc. Les fragments monovalents F (ab)ont un site de liaison à l’antigène, tandis que les fragments divalents (Fab’) 2 ont deux régions de liaison à l’antigène qui sont liées par des liaisons disulfures., Deux fragments individuels de F(ab) sont produits quand un anticorps normal est digéré avec l’enzyme de papaïne. Un fragment F (ab’) 2, qui retient une partie de la région charnière, est produit par digestion de pepsine d’anticorps IgG ou IgM. La réduction des fragments F(ab’) 2 produit 2 fragments Fab’ monovalents, qui ont un groupe sulfhydryle libre qui est utile pour la conjugaison à d’autres molécules. Les fragments FV sont le plus petit fragment fabriqué à partir du clivage enzymatique des anticorps de classe IgG et IgM (Figure 1)., Les fragments FV ont le site de liaison à l’antigène constitué des régions VH et VL, mais ils n’ont pas les régions constantes des régions Fab (CH1 et CL) (Figure 1, panneau de droite). La VH et la VL sont maintenues ensemble dans des fragments FV par des interactions non covalentes. Les fragments peuvent être générés par des kits disponibles dans le commerce, par exemple, le kit de Fragmentation F(ab’)2 de G-Biosciences .,
Les méthodes de génie génétique permettent la production de fragments variables à chaîne unique (SCFV), qui sont des fragments de type FV constitués des domaines VH et VL reliés par un peptide linker flexible (Figure 1) . La manipulation de l’orientation des domaines V et de la longueur de l’éditeur de liens crée différentes formes de molécules FV . Lorsque l’éditeur de liens a une longueur d’au moins 12 résidus, les fragments scFv sont principalement monomères (comme le montre la figure 1) ., Les lieurs qui sont des résidus 3-11 longs produisent des molécules scFv qui ne peuvent pas se plier dans un domaine FV fonctionnel. Ces molécules s’associent à une seconde molécule scFv, ce qui crée une diabodie bivalente . Si la longueur de l’éditeur de liens est inférieure à trois résidus, les molécules scFv s’associent en triabodies ou en tétrapodes . Par exemple, Tao Y et al ont généré un VH-VL diabody avec un éditeur de liens ggggs court et scFv avec un éditeur de liens gttaasgssggsssga long ., Les SCFV multivalents possèdent une plus grande affinité de liaison fonctionnelle à leurs antigènes cibles en raison de la présence de deux sites de liaison d’antigène cible supplémentaires, ce qui réduit le taux de décalage du fragment d’anticorps . Les minibodies sont des protéines de fusion scFv-CH3 qui s’assemblent en dimères bivalents . De petits fragments scFv avec deux domaines variables différents peuvent être générés pour produire des fragments bis-scFv bispécifiques capables de lier simultanément deux épitopes différents . Des méthodes génétiques sont également utilisées pour créer des dimères Fab bispécifiques (Fab2) et des trimères Fab trispécifiques (Fab3) ., Ces fragments d’anticorps sont capables de lier simultanément 2 ou 3 antigènes différents, respectivement.
en plus des anticorps conventionnels, les espèces de camélidés et de requins (squalidae) contiennent un sous-ensemble d’anticorps particuliers à chaîne lourde (hcAb) exclusivement composés d’homodimères à chaîne lourde dépourvus de chaînes légères . Les parties Fab de ces anticorps, appelées VHH chez les camélidés et VNAR chez les requins, sont les plus petites régions de liaison à l’antigène naturellement trouvées ., Les nanobodies sont des domaines recombinants dérivés de VHH capables de lier des antigènes, souvent clonés à partir de bibliothèques de phages VHH telles que celles contre les protéines de betacoronarivus . Leur thermodynamique de liaison et leurs structures ont été étudiées (et y font référence)., Les Nanobodies sont très stables et peuvent être facilement produites en grande quantité en utilisant des systèmes d’expression protéique simples courants tels que les bactéries (les anticorps classiques fonctionnels de taille normale sont difficiles à exprimer correctement dans un système bactérien), ce qui représente un outil prometteur pour la recherche et les fins thérapeutiques, en particulier dans les domaines de la microscopie Les Nanobodies peuvent également être délivrées à l’intérieur de cellules vivantes par conjugaison avec des peptides , ou in vivo , ou exprimées directement in vivo et reconnaître ses cibles in vivo., Les nanobodies contre RFP ou GFP, lorsqu’elles sont conjuguées avec des colorants Atto rouge lointain, ont atteint un grossissement de 118 fois des signaux fluorescents sur GFP ou RFP, et ont été utilisées pour générer une connectivité neuronale de souris du corps entier . Ils ont également été utilisés pour stabiliser l’état actif des protéines dans les études structurales . Un système d’expression avec de multiples nanobodies concaténées contre différentes souches de grippe est à l’étude comme moyen de générer un vaccin universel contre la grippe ., Les nanobodies secondaires anti-IgG recombinantes ont un grand potentiel pour remplacer les anticorps secondaires polyclonaux largement utilisés produits à l’aide d’animaux .
Les Nanobodies ont la capacité unique de traverser la barrière hémato-encéphalique ; cependant, les nanobodies ont tendance à être traitées et éliminées très rapidement du corps . Les Nanobodies peuvent être utilisées pour des méthodes telles que l’immunoprécipitation, par exemple, RFP-Trap MA de Chromotek , ou couplées à des protéines fluorescentes pour suivre des cibles intracellulaires dans des cellules vivantes en temps réel .,
Environ 10% des immunoglobulines bovines contiennent une troisième région exceptionnellement longue déterminant la complémentarité de la chaîne lourde (CDR 3H) avec un grand nombre de résidus de cystéine . Ces cystéines s’apparient pour former des liaisons disulfures qui conduisent à une structure semblable à une tige et à un bouton dans le domaine de liaison à l’antigène . Ce domaine CDR3H exceptionnellement long avec la longue tige contribue à la diversité de la spécificité des anticorps bovins.,
Les Intrabodies, ou anticorps intracellulaires, désignent les anticorps ou leurs fragments (généralement de conception scFv) exprimés directement à l’intérieur des cellules ou chez les animaux in vivo à travers un vecteur d’expression. Par exemple, Dong JX et al ont développé plusieurs nanobodies contre des protéines neuronales pour l’expression intracellulaire en tant qu’intrabodies . Une considération/mise en garde importante est l’environnement intracellulaire réducteur qui diminue l’affinité d’un anticorps ou d’un fragment d’anticorps dont la liaison avec l’antigène dépend des liaisons disulfures intradomaines., Une autre considération est que intracorps ont tendance à s’agréger. Kabayama H et al ont conçu des intracorps avec une charge engative nette même au pH cytoplasmique le plus bas 6,6 pour générer des anticorps cytoplasmiques ultra-stables . Les intracorps sont utilisés comme alternatives aux inhibiteurs pharmacologiques pour cibler des participants endocytaires spécifiques., Par exemple, l’expression d’un fragment variable à chaîne unique (scFv) dérivé de l’anticorps monoclonal 3B12A contre le signal d’exportation nucléaire TDP-43 dans des cellules HEK293A ou après électroporation in utero de son vecteur d’expression a favorisé la protéolyse des agrégats TDP-43 dans des cellules cultivées et le cerveau embryonnaire de souris ., L’administration par le Virus dans le système nerveux d’un anticorps scFv contre le motif de reconnaissance de L’ARN 1 du TDP-43 a réduit la microgliose dans un modèle murin de neuroinflammation aiguë et atténué les troubles cognitifs, les défauts moteurs, la protéinopathie TDP-43 et la neuroinflammation chez des souris transgéniques exprimant des mutations TDP-43 liées à la sclérose latérale amyotrophique . Le potentiel des intrabodies en tant que modalité thérapeutique reste à émerger.
un fragment d’anticorps peut également être lié à une balise d’importation de cellules, telle qu’une balise IPTD , pour faciliter son entrée dans les cellules.,
Les fragments d’anticorps offrent certains avantages par rapport à un anticorps grandeur nature pour certaines applications. Ce sujet a été examiné par Nelson . Un avantage des fragments par rapport aux anticorps de taille normale est que les fragments d’anticorps sont plus petits que les anticorps conventionnels et manquent généralement de glycosylation, ce qui permet leur production dans les systèmes d’expression procaryotique, ce qui permet des économies de temps et de coûts., De plus, les fragments sont assez petits pour s’infiltrer dans certains tissus que les anticorps de taille normale sont incapables de pénétrer, ce qui facilite de nombreuses procédures thérapeutiques et immunohistochimiques . De plus, l’absence de domaine Fc est un avantage substantiel pour les anticorps primaires utilisés en immunohistochimie et dans d’autres applications de détection, car ils ont considérablement réduit la liaison non spécifique au récepteur Fc. Un scFv qui est couramment utilisé dans le diagnostic est L’anticorps NC10 contre la neuraminidase de la grippe., L’anticorps MOC – 31 contre la molécule D’adhésion des cellules épithéliales Ep-CAM est un scFv couramment utilisé comme traitement du cancer. Les Diabodies, les triabodies et les tétrapodes ont des utilisations potentielles dans des applications telles que la radioimmunothérapie et l’imagerie diagnostique in vivo . Cependant, les fragments qui n’ont pas le domaine Fc sont dégradés dans le corps beaucoup plus rapidement que les anticorps conventionnels , et sont incapables d’obtenir des processus cytotoxiques médiés par Fc à moins qu’ils ne soient conjugués à une fraction effectrice , ce qui nécessite une optimisation supplémentaire pour les thérapies basées sur des fragments d’anticorps.,
Bien que divers fragments d’anticorps offrent certains avantages, ils ne sont pas couramment utilisés dans les expériences. Dans les plus de 60 000 articles sélectionnés manuellement par Labome, seuls quelques articles citaient des applications de fragments d’anticorps Fab. Les fragments d’anticorps Fab anti-digoxigénine de Roche ( 11093274910) et les fragments d’anticorps Fab anti-fluorescéine ( 11426338910) sont générés chez les moutons et produits par digestion avec de la papaïne. Les fragments Fab anti-digoxigénine ont été utilisés pour des hybridations in situ puisque les sondes ARN sont marquées avec de la digoxigénine ., Ils ont également été utilisés pour effectuer une analyse de pliage de protéines afin d’étudier le processus de pliage d’une molécule de calmoduline unique par spectroscopie de force d’une seule molécule . Des fragments F (ab) d’anticorps secondaires anti-souris sont souvent utilisés pour bloquer les IG endogènes de souris lors de l’immunomodulation, par exemple, des IgG D’Antimouse D’âne de fragment Fab AffiniPure de Biozol (JIM-715-007-003) .,
Invitrogen Alexa Fluor 546-conjugué chèvre anti-lapin IgG F(ab’)2 fragment a été utilisé pour effectuer immunohistochimie pour étudier le rôle de sFLT-1 dans le maintien de la couche de photorécepteur avasculaire dans les modèles de souris et Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2 fragment de lapin anti-chèvre IgG (H+L) a été utilisé en immunohistochimie pour étudier le mécanisme de régénération de la liaison de la pointe dans les cellules ciliées auditives .,
Les récepteurs Fc (FCR) sont des molécules exprimées principalement sur / dans les cellules immunitaires innées, qui reconnaissent et lient le domaine Fc des anticorps et initient ainsi une réponse immunitaire à base de cellules. Les diverses fonctions des FCRS reflètent le large éventail de rôles protecteurs ou modulateurs des anticorps, y compris la médiation de la neutralisation et de la clairance des substrats ciblés, ainsi que la programmation de l’immunité adaptative ., Les fonctions biologiques des FCR sont régulées par des motifs d’activation à base d’immunorécepteur tyrosine (ITAMs) et des motifs inhibiteurs à base d’immunorécepteur tyrosine (ITIMs), qui agissent respectivement comme interface du récepteur avec les voies de signalisation activatrices et inhibitrices. Ainsi, la signalisation par ITAMs peut provoquer l’activation cellulaire, la phagocytose et l’endocytose, tandis que la signalisation par ITIMs a un effet inhibiteur sur l’activation cellulaire . Les FCR ont été décrits pour toutes les classes d’immunoglobulines et certains d’entre eux sont discutés ci-dessous.,
Cette famille comprend FcyRI, FcyRII, FcyRIII et leurs isoformes. Ils sont responsables de la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) et de la phagocytose à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ACDP) .
Un autre récepteur qui lie les IgG est le récepteur Fc néonatal (FcRn), qui est impliqué dans le transfert de l’immunité humorale passive d’une mère à son fœtus. FcRn protège également les IgG de la dégradation in vivo, expliquant leur longue demi-vie dans le sérum ., Ce phénomène a conduit au développement de meilleurs anticorps thérapeutiques en introduisant des altérations dans la région Fc pour favoriser L’interaction Fc-FcRn.
ils comprennent le FceRI de haute affinité, qui est capable de lier Desge monomères, et le fcerii de lectine de type C de faible affinité, qui interagit préférentiellement avec desge complexes. FceRI Médie la réponse d’hypersensibilité immédiate de nombreuses réactions allergiques en stimulant la dégranulation et la libération d’une gamme de médiateurs inflammatoires sur les mastocytes et les basophiles ., FceRII existe à la fois sous une forme liée à la membrane qui délivre un signal de régulation descendante pour la synthèse desgE , ainsi que des fragments solubles qui génèrent une régulation ascendante opposée sur la synthèse desgE . Son rôle dans la transcytose des complexesgE-allergènes dans les voies respiratoires humaines et l’épithélium intestinal est activement étudié en tant que cible potentielle pour l’inflammation allergique des voies respiratoires à la suite d’allergies alimentaires .
Le seul membre du groupe des récepteurs IgA, FcaRI, est exprimé uniquement dans les cellules de la lignée myéloïde., Il joue un rôle dans les Réponses pro – et anti-inflammatoires en fonction de l’état de l’IgA lié. Alors que la liaison des IgA sécrétoires (SIgA) présents sur les sites muqueux a des effets anti-inflammatoires, y compris la prévention de l’invasion des agents pathogènes, la liaison des IgA sériques entraîne des réponses inflammatoires. FcaRI régule également la viabilité des neutrophiles en fonction du microenvironnement inflammatoire .
TRIM21 peut être distingué des autres FCR car il montre une large spécificité d’anticorps. Il peut lier IgG, IgM et IgA . Il est également exprimé par les cellules de la plupart des lignées histogènes ., TRIM21 participe à l’interférence médiée par les anticorps de la réplication virale en ciblant les complexes virus-anticorps cytosoliques pour la dégradation protéasomale.
La liaison des domaines Fc aux FCR peut avoir des effets indésirables dans les méthodes analytiques à base d’anticorps monoclonaux telles que l’immunohistochimie (IHC), le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). La liaison Non spécifique aux FCR peut introduire un bruit de fond pouvant conduire à la détection de faux positifs., Les solutions pour faire face à ce problème incluent l’utilisation de (i) contrôles d’isotype pour gating, (ii) sérum pour concurrencer largement pour les récepteurs impliqués dans la liaison non spécifique, ou (iii) IgG purifié pour bloquer les récepteurs Fc spécifiquement . Innovex Fc Receptor blocker # NB309 peut être utilisé pour bloquer la paraffine ou les sections congelées lors d’expériences IHC ou IC ou BD Biosciences #553142, Miltenyi Biotec Fc receptor block pour la cytométrie en flux. Par exemple, Chopra S et al ont bloqué la liaison FcyR avec 5 µg/ml TruStain fcX (anti-souris CD16/32, clone 93) de BioLegend pendant la cytométrie en flux et le tri cellulaire .,
Le Dr Macarena Fritz Kelly de São José dos Campos, SP, Brésil, a contribué à la section sur les récepteurs Fc en septembre 2018.
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