a mélytengeri Gulper Eel mitokondriális genomok evolúciója: az Angolnákon belüli nagyszabású Génátrendezések

absztrakt

a legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a tipikus gerinces mitokondriális génrendtől való eltérések gyakoribbak, mint azt eredetileg gondolták., Ezek az eltérések azonban vannak kisebb, a inverzió és/vagy a jelen néhány gének hogy részt pedig tandem párhuzamos a gén régiók által követett törlés a gének, amelyek került sor, mint mechanizmusok származó ilyen regény gén érdekében., Az Elopomorpha (angolnák és szövetségeseik) molekuláris filogenetikai vizsgálata során megállapítottuk, hogy a két mélytengeri gulper-angolna, az Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) és a saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae) mitokondriális genomjai (mitogenomes) azonos génrendet mutatnak, amely nagyban különbözik bármely más gerincesétől. Filogenetikai elemzés segítségével a mitogenomikai adatok 59 halfaj nem csak megerősítette egyetlen eredete egy ilyen gén sorrendben bizalommal, hanem azt is jelezte, hogy már származik a tipikus gerinces gén sorrendben., Részletes összehasonlítást a gulper angolna gén érdekében, hogy a tipikus gerincesek azt javasolta, hogy előfordulása egyetlen lépés, nagyszabású párhuzamos gén régió kiterjesztése >12 kb, majd törlés a gének egy közös őse a két faj, a legtöbb parsimoniously számlák ez a szokatlan gén megállapodás.

Bevezetés

a gerinces mitokondriális génrendet kezdetben konzervatívnak tekintették, mivel a mitokondriális genomok (mitogenomok) teljes nukleotidszekvenciái emlősökből (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981) és az afrikai karmos béka (Roe et al. 1985) közös génrendet mutatott. Mivel a teljes mitokondriális DNS-szekvenciát (mtDNA) számos gerincesre (269 fajra 2003.június 11-től; Nemzeti Biotechnológiai Információs Központ weboldal: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html) meghatározták, felismerték, hogy a tipikus génrendtől való eltérések nem ritkák a gerincesekben (ábra. 1; Boore 1999). A placenta emlősök kivételével a példák közé tartoznak a gerincesek minden fő vonala, például a lampreys (Lee and Kocher 1995), a kétéltűek (Macey et al. 1997; Sumida et al., 2001), hüllők (Kumazawa és Nishida 1995; Quinn és Mindell 1996; Macey et al. 1997), birds (Desjardins and Morais 1990, 1991; Quinn and Wilson 1993; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998), marsupials (Pääbo et al. 1991; Janke et al. 1994), és fish (Miya és Nishida 1999; Inoue et al. 2001b; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001). Az ilyen génátrendezések azonban lokálisak (leginkább a tRNS-gének egy csoportján belül), és nem találtak olyan példát, amely genomikus léptékű átrendeződéseket tartalmazna.,

A Gulper angolna jól ismert mélytengeri élőlény, amely négy, a saccopharyngiformes rendbe tartozó családot foglal magában, amelyek a világ óceánjaiban (>1000 m) fordulnak elő (Bertelsen, Nielsen, and Smith 1989). Bizarr megjelenésük (fig. 1), amely eredmények rendkívül kibővült, deformált gapes csúcsán az angolna kígyó -, mint a fej, test, magára vonta a figyelmet a számos kutató (pl., berthelsen lesz, Nielsen, Smith 1989; Robins 1989)., Az ilyen speciális anatómiai jellemzők arra késztették a nyomozókat, hogy feltételezzék, hogy ezeknek az állatoknak a filogenetikai pozíciói kívül esnek a csontos halakon (pl. Tchernavin 1946), bár általában az igazi angolna közeli hozzátartozóinak tekintik őket (Anguilliformes rend), mert levélszerű leptocephalous lárva stádiumuk van (Greenwood et al. 1966; Inoue és Miya 2001).,

az elopomorpha (angolnák és szövetségeseik) molekuláris filogenetikai vizsgálata során mitogenomikai adatok felhasználásával szokatlan mitokondriális génrendet találtunk Az egyik gulper angolna, az Eurypharynx pelecanoides (ábra. 1). Ez a cikk a gulper angolna két fajának, az E. pelecanoides és a saccopharynx lavenbergi mitogenómáinak új génszerveződését írja le. Miya és Nishida (1999) által kifejlesztett polimeráz láncreakció (PCR) alapú megközelítést alkalmaztunk ezeknek a halaknak a teljes mitogenómáinak szekvenálására., Az ilyen egyedi mitogenómák eredetének feltárásához filogenetikai elemzésnek vetettük alá a mitogenomikai adatokat, itt pedig megvitatjuk a lehetséges mechanizmusokat, amelyek ilyen génelrendezést generálnak a két gulper angolnában.

anyagok és módszerek

példányok

a mitokondriális DNS-szekvenciákat a Saccopharyngiformes (Robins 1989) rendjébe tartozó két faj hat egyedéből nyerték. A monotipikus család Eurypharyngidae, egy egyén E., a pelecanoides-t mintaként használták a teljes mtDNS-szekvencia meghatározására, a másik négy egyedet, köztük két leptocephalous lárvát, négy fő géncsomópont részleges szekvenciáinak meghatározására használták (ábra. 2) az E. pelecanoides mitogenome génrendjének megerősítése. A saccopharyngidae család esetében S. lavenbergi egyetlen egyedét használták mintaként a teljes mtDNA-szekvencia meghatározására., Az utalványmintákat a Természettudományi Múzeum halgyűjteményeiben helyezték el & Intézet, Csiba, Japán (CBM-ZF), valamint a Washingtoni Egyetemen (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, Dél-Japán; CBM-ZF 10312, 10313, 10316 és 10317: Egyenlítői közép-Csendes-óceán) és S. lavenbergi (uw 045633: Csendes-óceán keleti része).

DNS extrakció

az epaxiális izomzat egy része (kb. 0,25 g) minden faj friss példányából kivágták, és azonnal 99,5% – os etanolban tartósították., A teljes genomikus DNS-t a QIAGEN QIAamp szövetkészlettel extrahálták a gyártó protokollját követve.

polimeráz láncreakció és szekvenálás

a két gulper angolna teljes mitogenómáját hosszú PCR technikával erősítették (Cheng, Higuchi és Stoneking 1994). Öt hal-univerzális és három fajspecifikus hosszú PCR-alapozó (s-LA-16S-L + h12293-Leu és L12321-Leu + s-LA-16S–H az E. pelecanoides esetében; l2508-16S + Sala-ND4-H és Sala-CO1-l + Sala-ND1-H az S. lavenbergi esetében; ábra. 1)az egyes angolnák teljes mitogenomját két reakcióban erősítették., A másik négy E. pelecanoides egyed teljes mitogenómáit három hal-univerzális primerrel és egy fajspecifikus hosszú PCR alapozóval (L2508-16S + Eupe-ND2–H és L12321-Leu + s-LA-16S-H) erősítették meg. Négy fajspecifikus primert (Eupe-ND2-H az E. pelecanoides esetében; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H és Sala-ND4-H az S. lavenbergi esetében) az E. pelecanoides ND2 génjének, valamint az S. lavenbergi COI, ND1 és ND4 génjeinek részleges nukleotidszekvenciáira való hivatkozással terveztek, amelyeket minden egyes teljes DNS-ből hal-univerzális primerek felhasználásával határoztak meg.,

a hosszú PCR-termékeket TE-pufferrel (1:20) hígították későbbi PCR-sablonként történő felhasználásra, kivéve a két hosszú PCR-alapozó (az S-LA-16S-H és az S-LA-16S-L, valamint a h12293-Leu és az L12321-Leu között az E. pelecanoides esetében; fig. 1), amelyben a teljes genomikus DNS-t alternatív módon alkalmazták.

összesen 82 hal-univerzális alapozó (Miya and Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001B, 2001c, 2001d; Ishiguro, Miya, and Nishida 2001; Kawaguchi, Miya, and Nishida 2001) használták különböző kombinációkban, hogy erősítsék összefüggő, egymást átfedő szegmensek a teljes mitogenome mind a két faj. A fajspecifikus alapozókat olyan esetekben tervezték, amikor nem álltak rendelkezésre megfelelő hal-univerzális alapozók. Egy adott fajhoz használt PCR-primerek listája kérésre elérhető a J. G. I.-től. A hosszú PCR és az azt követő PCR reakciókat a korábban leírtak szerint hajtották végre (pl. Miya és Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

a kettős szálú PCR termékeket, amelyeket egy előre szekvenáló készlet (USB) segítségével tisztítottak, ezt követően a festékkel jelölt terminátorok (alkalmazott Biosystems) segítségével közvetlen ciklusszekvenáláshoz használták. A használt alapozók ugyanazok voltak, mint a PCR esetében. Minden szekvenálási reakciót a gyártó utasításai szerint végeztünk. A címkézett fragmenseket egy 377-es modell DNS-szekvencer (alkalmazott Biosystems) segítségével elemeztük.

szekvencia analízis

a DNS-szekvenciákat a dnasis version 3.2 (Hitachi Software Engineering) számítógépes szoftvercsomag segítségével elemeztük., A 13 protein-kódoló gén helyét a csontos hal mitogenómák DNS-vagy aminosav-szekvenciáinak összehasonlításával határozták meg. A 22 tRNS-gént a cloverleaf másodlagos struktúrái (Kumazawa és Nishida 1993) és az anticodon szekvenciák alapján azonosították. A két rRNA gént szekvencia-hasonlóság és másodlagos szerkezet alapján azonosították (Gutell, Gray, and Schnare 1993). A szekvenciaadatok a DDBJ/EMBL / GenBank–tól érhetők el, az AB046473 és az AB046475-AB046490 csatlakozási számokkal az E. pelecanoides esetében, az Ab047825 pedig az S. lavenbergi esetében.,

filogenetikai analízis

az Inoue et al. (2001d) és Miya, Kawaguchi és Nishida (2001) összevonásra kerültek, a redundáns taxonok pedig megszűntek. A két gulper angolna és két teleoszt (Gymnothorax kidako, AP002976 és Salmo salar, U12143 ) mitogén szekvenciáit adták hozzá. Mivel a két rRNA gén másodlagos szerkezeti modellek alapján történő egyértelmű igazítása nem volt megvalósítható (Miya and Nishida 2000), ezeket nem használták az elemzésekben., Az ND6 gént nem használták a filogenetikai analízisekben heterogén bázisösszetétele és következetesen gyenge filogenetikai teljesítménye miatt (pl. Zardoya and Meyer 1996; Miya and Nishida 2000). Emellett kizárták a tRNA-hurkokat, a tRNASer-t(AGY) (egyes fajok instabil másodlagos struktúrái) és más kétértelműen igazított régiókat, például több fehérje-kódoló gén 5 “és 3” végét., Amellett, 3. kodon pozíciót a fehérje kódoló gének is pozitívan félrevezetni elemzése magasabb szintű kapcsolatok actinopterygians (Miya, valamint Nishida 2000) kizárták az elemzések, így 7,984 rendelkezésre nukleotid pozíció a 12 fehérjét kódoló gén, valamint a 21. trns gének.

Bayesian filogenetikai elemzéseket végeztek MrBayes 2.01 (Huelsenbeck and Ronquist 2001) alkalmazásával., A nukleotid szubsztitúció legjobban illeszkedő modelljének az Általános idő reverzibilis modelljét választották, amelyben egyes helyek változatlanok voltak, és változó helyekkel feltételezték, hogy diszkrét gamma-eloszlást követnek (GTR + i + Γ; Yang 1994) (ModelTest version 3.06; Posada and Crandall 1998). Az MrBayes maximális valószínűségi paramétereit a következőképpen állítjuk be: “lset nst = 6 “(GTR),” rates = invgamma “(i + Γ) és” basefreq = becslés ” (az alaptípusok becsült aránya az adatokból). A Markov-láncot úgy állították be, hogy egyszerre négy lánc (három fűtött és egy hideg) futjon., Két független futást végeztünk 1 millió generáció számára, a fákat 100 generációnként mintavételezték, amelyek mindegyike egy véletlenszerű fáról indult. Két független elemzés konvergált a hasonló log-valószínűségi pontszámokhoz, és legkésőbb 120 000 generációnál elérte a “stationaritást” (az ML-pontszámok javulásának hiánya)., Így, az első az 1200 fák deportáltak minden elemzés, a fennmaradó 17,602 kombinált mintát két, egymástól független elemzések használták fel, hogy létrehoz egy 50% – os többségi szabály konszenzus fa, a százalékos minták gyógyuló különösebb klád képviselő klád van posterior probability (Huelsenbeck, valamint Ronquist 2001).

eredmények

Genomszervezetek

az E. pelecanoides és az S. lavenbergi mitogenomes teljes hossza 18,978 bp és 18,495 bp (kivéve az S. putatív kontroll régió egy részét., lavenbergi), illetve (lásd Kiegészítő anyag online). E két gulper angolna genomtartalma két rRNS-t, 22 tRNS-t és 13 protein-kódoló gént tartalmaz, amint az más gerincesekben is megtalálható (1.ábra). 2). A többi gerinceshez hasonlóan e két faj legtöbb génje a H-szálon van kódolva, kivéve az ND6 és a nyolc tRNS gént. Az összes tulajdonság hossza hasonló a többi csontos haléhoz, kivéve a COI gént és az E. pelecanoides kontroll régióját, valamint az S COI és cyt B géneket., lavenbergi (kb. 100, 800, 150, illetve 30 bp-rel hosszabb, mint más csontos halaknál).

az E. pelecanoides mitogenome három nem kódoló régiót tartalmaz 200 bp-nél hosszabb ideig (ábra. 2; Lásd még: kiegészítő anyagok online; kódolás nélküli régió és ellenőrzési régió). A trnaser(UCN) és a tRNAAsp gének között elhelyezkedő nc1, valamint a TRNAASP és COII gének között elhelyezkedő nc2 két, illetve négy pszeudogént tartalmaz, amelyek megfelelnek a trnaasp gén degeneratív példányainak., Úgy tűnik, hogy a cyt B és a tRNAPhe gének között elhelyezkedő nem kódoló régió (1,818 bp) megfelel a kontroll régiónak. Az S. lavenbergi mitogenome három nem kódoló régiót is tartalmaz 200 bp-nél hosszabb ideig (nem kódoló régió és ellenőrző régiók ). A trnaleu(CUN) és ND5 gének között elhelyezkedő nc legalább két pszeudogént tartalmaz, amelyek megfelelnek a trnaleu(CUN) gén degeneratív példányainak., CR1 (992 bp), között található két trns-gén klaszterek (TP, s IM régióban), valamint CR2 (> 837 bp), között található cyt b-tRNAPhe gének, úgy tűnik, hogy megfelelnek az ellenőrzési régióban, de ezek teljesen azonos szekvenciák több mint 800 bp, jelezve, hogy átesett összehangolt evolúció (lásd Kumazawa et al. 1998).

az S. lavenbergi mitogenomában található két duplikált kontrollrégió (CR1 és CR2) kivételével a két mélytengeri gulper angolna mitogenómái azonos génrendet mutatnak (fig. 2)., A két gulper angolna mitokondriális génrendje azonban nagyban különbözik az eddig ismert összes többi gerincesétől. Amikor néhány tRNA gént kizárták az összehasonlításokból (ábra. 2) öt génblokkot azonosítottunk (a, tRNAGlu–tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; és E, tRNAArg–tRNASer(AGY) génrégiók), amelyek génrendje megegyezik a tipikus gerincesekével.,

Filogenetikai Pozíciók Két Gulper Angolna

3. Ábra az 50% – os többségi szabály konszenzus fa a 17,602 kombinált mintát két, egymástól független Bayes elemzéseket az 59 mitokondriális nukleotid szekvenciák a összefűzött 12 protein-kódoló (nem 3. kodon pozíció), plusz 21 trns gének (szár régiók csak) a GTR + I + Γ modell sorrend alakulása (Yang 1994). A Neoteleostei néhány csomópontja kivételével a legtöbb belső ágat magas Bayes posterior valószínűségek támogatták (≥95%)., Meg kell jegyezni, hogy a keletkező fa egyértelműen bizonyítja, hogy nem csak, hogy a két gulper angolna formában testvér-csoport kapcsolata magas posterior probability (100%), de azt is, hogy ezek a mélyen beágyazott belül a Anguilliformes (igaz, angolna), erősen arra utal, hogy ők már származik angolna -, mint őse.

Vita

a közelmúltban több mint 140 teljes mtDNS-szekvenciát határoztak meg az aktinopterygiai halakból (például Miya és Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001B, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya, and Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya, and Nishida 2001; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003), valamint számos példát gén átrendeződések számoltak be (ábra. 1). Meg kell jegyezni, hogy az ilyen génátrendezési események kevés gént tartalmaznak, és hogy a gulper angolna mitogenómák génrendezése nagyban különbözik a többi gerincesétől.,

Filogenetikai Következményei a Származási Regény Gén Rendelés

következtetni, hogy az evolúció a gének megállapodások a két gulper angolna, következtetés az ősi szervezet alapján egy megbízható filogenetikai keretrendszer szükséges. Bár a gulper angolna már szerepel az Elopomorpha alapuló kizárólag egy külön nyílt tengeri lárva formában, nevezik a leptocephalus, senki sem erősítette meg filogenetikai helyzetük segítségével karakter mátrixok származó morfológiai vagy molekuláris adatok (Inoue és Miya 2001).,

Bayesian analízis 59 faj mitogenomikai adatainak felhasználásával, amelyek teljes mértékben képviselik a teleostean halak sokféleségét (ábra. 3) nemcsak megerősítette, hogy a két gulper angolna új génrendje a két faj közös őséből származik, hanem azt is bizonyította, hogy eredetük független a többi új génrendtől. Úgy tűnik továbbá, hogy a Conger myriaster új génrendje, az Elopomorpha másik tagja, eredete független a gulper angolna eredetétől., Meg kell jegyezni, hogy az Anguilla japonica, amely a tipikus gerinces génrenddel rendelkezik, magabiztosan a két gulper angolna testvérfaja volt. A filogenetikai fán a génátrendezés eseményeinek leginkább parsimonious rekonstrukciója azt mutatta, hogy a két gulper angolna aberráns génrendje a tipikus gerincesekből származik.

lehetséges mechanizmus a gén átrendeződése Gulper angolna

két fő mechanizmusok javasolták megmagyarázni a gén átrendeződések gerinces mitogenómák (Lee and Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Az egyik a génrégiók tandem duplikációja az elcsúszás következtében, amelyet a gének deléciói követnek (Moritz and Brown 1986; Levinson and Gutman 1987). Bár a mitokondriális génmegállapodások dinamikáját néhány gerinctelenben nem magyarázták meg (például Kurabayashi és Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et al. 2002), gerinces mitokondriális gén átrendeződések jól magyarázható egy ilyen mechanizmus (Desjardins and Morais 1990; Quinn and Wilson 1993; Kumazawa and Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999; Inoue et al. 2001B), megvalósíthatóságát az mtDNS-szekvenciák gyakori polimorf duplikációi is alátámasztják (pl. 1994; Gach and Brown 1997; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999). A többi javasolt mechanizmus a trnas replikációjának tiltott alapozására és a tRNA gének kontroll régió körüli integrációjára hivatkozik (Cantatore et al. 1987; Jacobs et al. 1989).,

bár a második modellt ezen a ponton nem zárják ki, az első modellt a gulper angolna mitogenomes gén átrendeződésének mechanizmusaként részesítik előnyben. Feltételezve, hogy egy hosszú DNS–fragmentum a tipikus szervezet tRNAIle-CR régiójában duplikálódik (ábra. 4), a redundáns gének későbbi törlései a gulper angolnák átrendezett génszervezetét eredményeznék. Az ilyen tandem duplikáció és az azt követő deléciók leginkább a megfigyelt génrendet és a kapcsolódó intergén távtartókat eredményezték ebben a két gulper angolnában.,

a redundáns gének többszörös deléciói hiányosnak tűntek a két gulper angolnában, a nem kódoló szekvenciák több szakaszának köszönhetően (ábra. 2) előforduló körül a gének részt vesznek az átrendeződés (ábra. 4). Bár nc1, valamint nc2 az E. pelecanoides nc S. lavenbergi állnak ismétlődő pseudogenes megfelelő sorvadó példányban szomszédos trns-gén, CR1 pedig CR2 S. lavenbergi mitogenome azonos szekvenciák több mint 800 bp, valamint CR1 található a feltételezett duplikált helyzetben van, miközben CR2 található az eredeti helyére a kontroll régióban., Ez a megfigyelés az S. lavenbergi mitogenome-ban támogatja a tandem duplikáció és az azt követő deléciós események fogalmát, mint amelyek a tRNAIle–CR régióban történtek (ábra. 4).

Ha négy, öt összefüggő gén blokkok megduplázódtak együtt egy közös őse a két faj, ha későbbi törlését gének előtt történt a speciation, a feltételezett duplikált részeit gulper angolna, kezdve a tRNAIle gén, hogy CR a tipikus szervezet volt, amely túlnyúlik 12 kb (fig. 1)., Ezt a tanulmányt megelőzően a valaha ismert gerinces átrendeződés feltételezett duplikált régiói a legjobb esetben 4 kb voltak. Továbbá, az összes ismert tandemly ismétlődő kódolási szekvenciát a CR, IQM vagy WANCY régiók melletti régiókra korlátozták, valószínűleg tükrözve a replikációk eredetükön kívüli esetleges pontatlan befejezését. A gulper eel mitogenome-ban a duplikált régió sokkal nagyobb volt, mint az egyre ismert gerinces átrendeződéseké, és szinte az egész mitogenómát érintette (ábra. 1).