az antitestek olyan immunglobulin (Ig) glikoproteinek, amelyeket a plazmasejtek (B sejtek) termelnek idegen antigén molekulákra (immunogének) reagálva. Az elsődleges funkciója antitest kötődik kifejezetten az idegen antigéneket, hogy tiltsa le őket, és/vagy védjegy őket a pusztulástól az immunrendszert, ezáltal véd a fogadó a fertőzés. Az antitestek több osztálya létezik., Az összefoglaló első része a hagyományos, teljes méretű antitestekre, az IgG és IgM osztályú antitestekre fókuszál, amelyeket számos kutatás, diagnosztikai és terápiás orvosbiológiai alkalmazásban erősen hasznosítanak.
Az alapvető egység a hagyományos antitest négy polipeptid egység, amely két azonos nehéz láncok, illetve két azonos könnyű láncok tartanak össze diszulfid kötések. A könnyű láncok rövidebbek, kisebb molekulatömegűek, mint a nehéz láncok., Az antitest általános alakja egy Y, rugalmas csuklópánt (interdomain) régió az Y. az interdomain csuklópánt régió rugalmassága fontos az antitest kétértékű kötődéséhez , lehetővé téve a két kötő zseb számára, hogy változó távolságokon kölcsönhatásba lépjen az antigén helyekkel. Minden polipeptidláncnak állandó régiója van, amely nem változik jelentősen az antitestek között, valamint egy változó régió, amely specifikus az egyes antitestekre. A fénylánc változó régió közös jelölése VL, a fénylánc állandó régiója pedig CL (1.ábra)., A jelölések hasonlóak a nehézlánc változó (VH) és állandó régiók (Ch) CH1, CH2, CH3 jelöli a különböző állandó régió tartományok a nehéz lánc. A szénhidrátok általában a nehéz láncok CH2 doménjeihez kapcsolódnak. A fragmentum kristályosítható (Fc) régió csak a nehéz láncok (CH) állandó régióit tartalmazza, de a fragmentum antigénkötő régió (Fab) magában foglalja mind az állandó tartományt, mind a nehéz és könnyű láncok változó tartományait (VH és CL). Az FV régió fragmentumváltozója csak a két változó tartományt tartalmazza (1.ábra)., Az immunglobulin-izotípusokról, alosztályokról és az immunglobulin-domének számáról az egér antitestet lásd.
minden teljes antitestnek két antigénkötő zsebe van, amelyek az FV régiókban helyezkednek el, és két antigénhez kötődhetnek (kétértékű kötés)., Ha azonban a két antigén túl közel van (≤3 nm), vagy túl messze van egymástól (≥29nm), az antitest csak egy antigénhez (monovalens kötés) kötődhet . Jelentős affinitásváltozás van a monovalens és a kétértékű kötések között, a Kd értékek 1500-szoros változásával .
a specifikus antitestek szerkezete elérhető a Structural antitest adatbázisból (Sabdab), a nyilvánosan elérhető antitestszerkezetek kurátora adatbázisából, valamint a strukturális modellező eszközökből, amelyeket hetente frissítenek a Protein Data bankból (PDB).,
a hagyományos teljes méretű antitesteket a Western blot analízisek , immunhisztokémia és az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatok (ELISA) révén történő fehérjefelismerésre használják évtizedek óta. Olyan diagnosztikai alkalmazásokhoz is kifejlesztettek teljes méretű antitesteket, mint a terhességi tesztek, valamint a baktériumok és vírusok kimutatása a vérben, mint például a HIV-t kimutató ELISA. Ezenkívül a hagyományos teljes méretű antitesteket általában a betegség terápiájában használják., Például Infliximab egy antitest a sok rendelkezésre álló, hogy felismerje a tumor nekrózis faktor alfa (TNFa), és használják a kezelés a Crohn-betegség és a rheumatoid arthritis . A trasztuzumab vagy Herceptin olyan antitest, amely kötődik az epidermális növekedési faktor 2-es receptorához, és metasztatikus emlőrák kezelésére alkalmazzák . Számos antitest – alapú terápia is létezik, beleértve a Muromonabot , amelyet transzplantált recipienseknek adnak az allograft kilökődésének megelőzésére.,
bár a hagyományos teljes méretű antitestek egyaránt alkalmazhatók terápiás alkalmazásokhoz, a teljes antitest használatának előnyei és hátrányai vannak. Fontos előnye a hagyományos antitesteknek, hogy az Fc régió a szervezet immunválaszát veszi fel, és elpusztíthatja a kötött antigéneket. Ez az Fc régió hátrányt jelenthet egyes klinikai alkalmazásokban is, mivel az immunválasz, amelyet általában vált ki, káros lehet a beteg egészségére., Ezenkívül a teljes méretű antitestek viszonylag nagy méretük miatt nem tudnak jól behatolni bizonyos szövetekbe . Bizonyos esetekben, amikor teljes méretű antitesteket használnak diagnosztikai alkalmazásokhoz, az Fc domain jelentős nem specifikus kötődést okozhat, ami károsíthatja az észlelési alkalmazásokat.
sok alkalmazás esetén az antitest fragmensek előnyösebbek. Az antitest fragmensek kémiai vagy genetikai mechanizmusokon keresztül állíthatók elő., A kémiai fragmentáció redukálószereket használ a diszulfidkötések megtörésére a csuklórészen belül, valamint az antitest emésztésére proteázokkal, köztük pepszinnel, papainnal és ficinnal. A fragmentumok genetikai felépítése lehetővé teszi a fragmentum tartalmú molekulák sokaságának létrehozását, amelyek mindegyike egyedi kötési és funkcionális jellemzőkkel rendelkezik.
Kémiai proteáz emésztést, a teljes méretű IgG vagy IgM antitestek hozam antigén-kötelező darabokat (Fab; 1. Ábra), valamint Fc töredékek, amely csak a nehéz lánc CH2, valamint CH3 tartományok., Az antitest fragmentumok előállításának biokémiai módszerei hasznos eszközöket jelentenek a diagnosztikai és terápiás alkalmazásokhoz, de meglehetősen fáradságos, és nagy mennyiségű antitest kiindulási anyagot igényel.
a biokémiai emésztéssel előállított antigénkötő fragmentumok közé tartozik a fab, (Fab’)2, Fab’ és az FV, amelyek mindegyike hiányzik az Fc régióból. Monovalens F(ab) töredékek egy antigén-kötőhely, mivel a kétvegyértékű (Fab’)2 töredékek két antigén-kötelező régiók, hogy kapcsolódik a diszulfid kötések., Két egyedi F(ab) fragmentumot állítanak elő, amikor egy teljes méretű antitestet papain enzimmel emésztünk. Az F (ab”) 2 fragmentumot, amely megtartja a csuklórégió egy részét, az IgG vagy IgM antitestek pepszin emésztésével állítják elő. Az F(ab’)2 fragmentumok csökkentése 2 monovalens Fab’ fragmentumot termel, amelyek szabad szulfhidrilcsoporttal rendelkeznek, amely más molekulákhoz való konjugációhoz hasznos. Az FV fragmentumok az IgG és IgM osztályú antitestek enzimatikus hasításából készült legkisebb fragmentumok (1.ábra)., Az FV-fragmensek antigénkötési helyük a VH és VL régiókból áll, de hiányoznak a Fab (CH1 és CL) régiók állandó régiói (1.ábra, jobb panel). A VH-t és a VL-t FV-fragmensekben nem kovalens kölcsönhatások tartják össze. A töredékeket kereskedelmi forgalomban kapható készletekkel lehet előállítani, például F(ab”) 2 fragmentációs készlet a G-Biosciences-ből .,
géntechnológiai módszerek lehetővé teszik az egyláncú változó fragmensek (scFv) előállítását, amelyek FV típusú fragmensek, amelyek a VH és VL domainekből állnak, amelyeket egy tervezett rugalmas linker peptid köt össze (1 .ábra). A v-tartományok orientációjának manipulálása, valamint a linker hossza különböző FV-molekulákat hoz létre . Ha a linker legalább 12 maradék hosszú, az scFv fragmentumok elsősorban monomerikusak (az 1 .ábrán látható módon)., Linkers, amelyek 3-11 maradványok hosszú hozam scFv molekulák, amelyek nem képesek összehajtani egy funkcionális FV domain. Ezek a molekulák egy második scFv molekulához kapcsolódnak, amely kétértékű diabódiát hoz létre . Ha a linker hossza kevesebb, mint három maradék, az scFv molekulák triabódiákba vagy tetrabodikokba társulnak . Például, Tao Y et al generált VH-VL diabody egy rövid GGGGS linker és scFv egy hosszú gttaasgssggsssga linker ., A többértékű scfv – k nagyobb funkcionális kötődési affinitással rendelkeznek a célantigénekhez, mivel még két célantigén kötőhely van, ami csökkenti az antitest fragmens off-sebességét . A minibódák scFv-CH3 fúziós fehérjék, amelyek kétértékű dimerekké alakulnak . Kis scFv fragmensek két különböző változó tartományok lehet előállítani bispecifikus bis-scFv fragmensek képes kötődni két különböző epitópok egyidejűleg . Genetikai módszereket alkalmaznak bispecifikus Fab dimerek (Fab2) és trispecifikus Fab trimerek (Fab3) létrehozására is ., Ezek az antitest fragmensek képesek egyidejűleg 2 vagy 3 különböző antigént kötni.
amellett, hogy a hagyományos antitestek, camelid, majd cápa (squalidae) fajok tartalmaz egy részét sajátos Nehéz Lánc Antitestek (hcAb) kizárólag tagjai a nehéz lánc homodimers hiányzik a fény láncok . Ezeknek az antitesteknek a Fab-részei, amelyeket a camelidekben VHH-nak, a cápákban pedig VNAR-nak neveznek, a legkisebb antigénkötő régiók, amelyek természetesen megtalálhatók ., A nanobódiák VHH-eredetű rekombináns domének, amelyek képesek antigéneket megkötni, gyakran VHH fágkönyvtárakból klónozva, például a betacoronarivus s fehérjék ellen . A kötelező termodinamikát és struktúrákat tanulmányozták (és hivatkoztak rá)., A nanobódiák nagyon stabilak, és nagy mennyiségben könnyen előállíthatók olyan egyszerű proteinexpressziós rendszerek alkalmazásával, mint a baktériumok (a funkcionális hagyományos teljes méretű antitesteket nehezen lehet megfelelően kifejezni egy bakteriális rendszerben), ezáltal ígéretes eszközt jelentenek kutatási és terápiás célokra, különösen a szuperfelbontású mikroszkópia, a tömegspektrometria és a célzott fehérje lebomlása területén . A nanobódiák élő sejtekben is szállíthatók peptidekkel konjugálva, vagy in vivo, vagy közvetlenül in vivo expresszálódnak, és felismerik céljait in vivo., Az RFP-vel vagy GFP-vel szemben alkalmazott nanobódiák, amikor távoli vörös Atto-színezékekkel konjugáltak, elérték a fluoreszcens jelek 118-szoros nagyítását a GFP vagy RFP felett, és az egész test egér neuronális kapcsolatának létrehozására használták . Ezeket a fehérjék aktív állapotának stabilizálására is alkalmazták a strukturális vizsgálatokban . Egy kifejezés rendszer több összefűzött nanobodies ellen különböző influenza törzsek vizsgálják, mint azt, hogy létrehoz egy univerzális influenza vakcina ., A rekombináns anti-IgG másodlagos nanobódiák nagy potenciállal rendelkeznek az állatok felhasználásával előállított széles körben használt poliklonális másodlagos antitestek helyettesítésére .
A Nanobódiák egyedülálló módon képesek átjutni a vér-agy gáton ; a nanobódiákat azonban általában nagyon gyorsan feldolgozzák és eltávolítják a testből . A nanobódiák olyan módszerekhez alkalmazhatók, mint például az immunprecipitáció, például az RFP-Trap MA a Chromotekből , vagy fluoreszkáló fehérjékhez kötve, hogy valós időben nyomon kövessék az élő sejtekben lévő intracelluláris célokat .,
a szarvasmarha immunglobulinok körülbelül 10%-a szokatlanul hosszú, harmadik nehéz láncú komplementaritást meghatározó régiót (CDR 3H) tartalmaz nagyszámú ciszteinmaradékkal . Ezek a ciszteinek diszulfidkötéseket képeznek, amelyek az antigénkötő doménben szár-és gombszerű szerkezethez vezetnek . Ez a kivételesen hosszú, hosszú szárú CDR3H domén hozzájárul a szarvasmarha antitest specificitásának sokféleségéhez.,
Intrabodes vagy intracelluláris antitestek olyan antitestekre vagy azok fragmenseire utalnak (általában scFv kialakítású), amelyek közvetlenül a sejtekben vagy in vivo állatokban expressziós vektoron keresztül expresszálódnak. Például Dong JX et al több nanobódiát fejlesztett ki a neuronális fehérjék ellen intracelluláris expresszió céljából intratestekként . Az egyik fontos szempont/figyelmeztetés a redukáló intracelluláris környezet, amely csökkenti egy antitest vagy antitest fragmentum affinitását, amelynek az antigénhez való kötődése az intradomain-diszulfid kötésektől függ., Egy másik szempont az, hogy az intratestek általában aggregálódnak. A Kabayama h et al a legalacsonyabb citoplazmatikus pH 6.6-nál is nettó engatív töltésű intratesteket tervezett ultra-stabil citoplazmatikus antitestek előállítására . Az intratesteket a farmakológiai inhibitorok alternatívájaként használják, hogy specifikus endocitikus résztvevőket célozzanak meg., Egyes esetekben a 3B12A monoklonális antitestből származó egyláncú változó fragmentum (scFv) expressziója a HEK293A sejtekben a TDP-43 nukleáris exportjel ellen vagy az expressziós vektor In utero elektroporációja után elősegítette a TDP-43 aggregátumok proteolízisét tenyésztett sejtekben és embrionális egér agyban ., Vírus által közvetített szállítási be az idegrendszer egy scFv elleni antitest az RNS elismerés motívum 1 TDP-43 csökkentett microgliosis egér modellben az akut neuroinflammation, illetve enyhíteni a kognitív, motor hibák, TDP-43 proteinopathy, valamint neuroinflammation a transzgénikus egerek kifejező TDP-43 mutációk kapcsolódó amiotrófiás laterális szklerózis . Az intratesteknek mint terápiás modalitásnak a lehetősége továbbra is fennáll.
egy antitest fragmentum összekapcsolható egy sejtimport címkével , például egy IPSD címkével, hogy megkönnyítse a sejtekbe való belépést.,
az antitest fragmensek bizonyos előnyöket kínálnak a teljes méretű antitesthez képest egyes alkalmazásokhoz. Ezt a témát Nelson áttekintette . A fragmentumok egyik előnye a teljes méretű antitestekkel szemben az, hogy az antitest fragmentumok kisebbek, mint a hagyományos antitestek, és általában nem rendelkeznek glikozilációval, lehetővé téve termelésüket prokarióta expressziós rendszerekben, amelyek időt és költségmegtakarítást biztosítanak., Ezenkívül a fragmentumok elég kicsiek ahhoz, hogy beszivárogjanak bizonyos szövetekbe, amelyek teljes méretű antitestek nem képesek behatolni, ami számos terápiás és immunhisztokémiai eljárásban segít . Továbbá az Fc domain hiánya jelentős előnyt jelent az immunhisztokémiában és más kimutatási alkalmazásokban alkalmazott elsődleges antitestek számára, mivel jelentősen csökkentették az Fc receptorhoz való nem specifikus kötődést. Az egyik scFv, amelyet általában a diagnosztikában használnak, az NC10 antitest az influenza neuraminidáz ellen., A MOC-31 antitest ellen epiteliális sejt adhéziós molekula Ep-CAM egy scFv általánosan használt, mint a rákterápia. Diabodies, triabodies és tetrabodies potenciális felhasználási alkalmazások, mint például a radioimmunotherapy és diagnosztikai in vivo képalkotás . Azonban az Fc doménből hiányzó fragmentumok sokkal gyorsabban lebomlanak a szervezetben, mint a hagyományos antitestek, és nem képesek Fc-mediált citotoxikus folyamatokat kiváltani, hacsak nem konjugálódnak egy effektorhoz, ami további optimalizálást igényel az antitest fragmentum alapú terápiákhoz.,
bár a különböző antitest fragmensek bizonyos előnyöket kínálnak, a kísérletekben nem gyakran használják őket. A Labome által kézzel kurált több mint 60 000 cikkben csak néhány cikk idézett antitest Fab fragmensek alkalmazását. A Roche anti-digoxigenin Fab antitest fragmentumokat ( 11093274910) és anti-fluoreszcein Fab antitest fragmentumokat ( 11426338910) juh-ban állítják elő, és papainnal történő emésztés útján állítják elő. Az anti-digoxigenin Fab fragmentumokat in situ hibridizációkhoz használták, mivel az RNS-szondákat digoxigeninnel címkézték ., Azt is használják, hogy végre fehérje összecsukható elemzés, hogy tanulmányozza a folyamat egyetlen calmodulin molekula összecsukható keresztül egymolekula erő spektroszkópia . Az egérellenes másodlagos antitestek F(ab) fragmentumait gyakran használják az endogén egér Ig blokkolására immunfestés során, például AffiniPure Fab fragmentum Donkey antimouse IgG Biozolból (JIM-715-007-003).,
Invitrogen Alexa Fluor 546-konjugált kecske anti-nyúl IgG-F(ab’)2 részlet végrehajtásához használt immunhisztokémiai, hogy vizsgálja meg a szerepét, sFLT-1 a fenntartó a avascularis photoreceptor réteg egér modellek Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2 darab nyúl anti-kecske IgG (H+L) használták immunhisztokémiai, hogy vizsgálja a mechanizmus tipp link regeneráció a hallás szőrsejtek .,
Fc-receptorok (FcRs) molekulák, kifejezett elsősorban a veleszületett immunrendszer sejtjei, hogy felismerje, illetve megkötni, az Fc domain antitestek, ezáltal kezdeményezni egy sejt-alapú immunválasz. Az FcRs változatos funkciói tükrözik az antitestek védő vagy moduláló szerepének széles skáláját, beleértve a célzott szubsztrátok semlegesítését és clearance-ét, valamint az adaptív immunitás programozását ., Az FcRs biológiai funkcióit immunoreceptor tirozin-alapú aktivációs motívumok (ITAMs) és immunoreceptor tirozin-alapú gátló motívumok (Itim-ek) szabályozzák, amelyek a receptor interfészeként működnek az aktiváló és gátló jelátviteli útvonalakkal. Így jelző által ITAMs lehet kiváltani sejt aktiválás, fagocitózis, valamint endocytosis, mivel a jelző által ITIMs fejt ki gátló hatást a sejt aktiválás . Az immunglobulinok valamennyi osztályára vonatkozóan FcRs-t írtak le, ezek közül néhányat az alábbiakban tárgyalunk.,
ebbe a családba tartoznak az FcyRI, FcyRII, Fcyrii és izoformáik. Ezek felelősek az antitest-függő sejt-mediált citotoxicitásért (ADCC) és az antitest-függő sejt-mediált fagocitózisért (ACDP).
egy másik receptor, amely kötődik az IgG-hez, az újszülött Fc receptor (fcrn), amely részt vesz a passzív humorális immunitás átvitelében az anyától a magzatig. Az Fcrn in vivo is védi az IgG-t a lebomlástól, magyarázva hosszú felezési idejüket a szérumban ., Ez a jelenség jobb terápiás antitestek kialakulásához vezetett azáltal, hogy változásokat vezetett be az Fc régióban az Fc-FcRn interakció előmozdítása érdekében.
ezek közé tartozik a nagy affinitású FceRI, amely képes kötődni a monomer IgE-hez, valamint az alacsony affinitású C-típusú lectin fcerii, amely elsősorban a komplex IgE-vel kölcsönhatásba lép. Az FceRI számos allergiás reakció azonnali túlérzékenységi reakcióját közvetíti a degranuláció stimulálásával és számos gyulladásos mediátor felszabadításával a hízósejteken és a bazofileken ., Az FceRII mind membránhoz kötött formában létezik , amely downreguláló jelet ad az IgE szintézishez, valamint olyan oldható fragmensek, amelyek ellentétes upregulációt generálnak az IgE szintézis során . Az IgE-allergén komplexek transzcitózisában betöltött szerepét az emberi légutakban és a bélhámban aktívan vizsgálják, mint az élelmiszerallergiák következtében fellépő allergiás légúti gyulladás potenciális célpontját .
az IgA receptorcsoport egyetlen tagja, az FcaRI csak a myeloid vonal sejtjeiben expresszálódik., Szerepet játszik mind a pro -, mind a gyulladáscsökkentő válaszokban az IgA kötött állapotától függően. Míg a nyálkahártya helyén jelen lévő szekréciós IgA (SIgA) kötődése gyulladásgátló hatást fejt ki, beleértve a kórokozó invázió megelőzését, a szérum IgA kötődése gyulladásos válaszokhoz vezet. Az FcaRI a gyulladásos mikrokörnyezettől függően szabályozza a neutrofil életképességet is .
TRIM21 megkülönböztethető a többi FcRs-től, mivel széles antitest-specifitást mutat. Képes megkötni az IgG-t, az IgM-et és az IgA-t . A legtöbb hisztogén vonal sejtjei is kifejezik ., A TRIM21 részt vesz a vírusreplikáció antitest-mediált interferenciájában a proteaszomális lebomlás citoszolvírus-antitest komplexeinek célzásával.
Az Fc domének FcRs-hez való kötődése nemkívánatos hatást gyakorolhat a monoklonális antitest alapú analitikai módszerekre, például immunhisztokémiára (IHC), fluoreszcencia aktivált sejtválogatásra (FACS) és kromatin immunprecipitációra (ChIP). Az FcRs-hez való nem specifikus kötődés háttérzajt okozhat, amely hamis pozitívumok észleléséhez vezethet., A probléma kezelésére szolgáló megoldások közé tartozik az (i) isotípus‐kontrollok alkalmazása a gating számára, (ii) szérum, hogy széles körben versenyezzenek a nem specifikus kötődésben részt vevő receptorokért, vagy (iii) tisztított IgG, hogy kifejezetten blokkolja az Fc receptorokat . Innovex Fc Receptor blokkoló #NB309 használható paraffin vagy fagyasztott szakaszok blokkolására IHC vagy IC kísérletek vagy BD Biosciences # 553142, Miltényi Biotec Fc receptor blokk az áramlási citometriához. Például a Chopra s et al blokkolta az fcyr kötődését 5 µg/ml TruStain fcX-szel (Anti-mouse CD16/32, clone 93) a Biolegendből az áramlási citometria és a sejtválogatás során .,
Dr. Macarena Fritz Kelly São José dos Campos, SP, Brazília, hozzájárult az Fc receptorokról szóló szakaszhoz 2018 szeptemberében.
Vélemény, hozzászólás?