Közepes láncú zsírsavak csökken a szérum koleszterin keresztül csökkentése bél epesav visszaszívás a C57BL/6J egerek

Állatok étrend

a Férfi a C57BL/6 J egerek (4 hetes, n = 80) vásároltak az Institute of Laboratory Animal Science, a Kínai tudományos Akadémia Orvosi Tudományok (Licenc Nem. SCXK: JING2009-0007), és 12 órás fény/sötét ciklusú, hőmérséklet-szabályozott helyiségben (22 ± 2 °C, 40-60% Páratartalom) helyezkedik el., A kínai PLA Általános Kórház állatgondozási és használati bizottsága minden kísérleti eljárást jóváhagyott.

az egereket a katonai Orvostudományi Akadémiától vásárolt alap étrend (Ain-93G diéta) táplálta az első héten az alkalmazkodáshoz. Tíz egeret véletlenszerűen választottak ki, és normál kontrollként bazális étrendet tápláltak, a fennmaradó egereket pedig az Ain-96G étrendből módosított koleszterinben gazdag (CR) étrendet táplálták. Két héttel később vérmintákat gyűjtöttek a mandibuláris vénás plexusból., A szérum TC-szinttel rendelkező egereket, amelyek 2 standard eltéréssel voltak nagyobbak, mint a normál kontroll (az egerek 67% – a táplálta a CR étrendet), véletlenszerűen három csoportba osztották (n = 12 minden csoportban). Minden csoport 16 héten át más étrendet táplált( 1. táblázat): koleszterinben gazdag és közepes láncú triglicerid (CR-MCT), koleszterinben gazdag és hosszú láncú triglicerid (CR-LCT) vagy CR. Nisshin Oillio (Tokió, Japán) adományozta az MCTs-t (C8:0 és C10:0) és az LCTs-t (hosszú láncú trigliceridek, Szójababolaj). A koleszterint a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) vásárolta meg., A pekingi Táplálkozási Intézet (Peking, Kína) mérte a CR-MCT és a CR-LCT diéták zsírsavösszetételeit (2.táblázat). A testsúlyt és a táplálékfelvételt hetente ellenőrizték.,

a Vér, ileum, epe, illetve széklettel a mintavétel

Öt egerek voltak véletlenszerűen kiválasztott, minden csoportból 16 hét után etetés rögzíteni bevitel, diéta, illetve széklettel a kiválasztás segítségével külön metabolikus ketrecek 3 napig., A székletet liofilizálták, lemérték, porították, és − 80 °C-on tárolták további elemzés céljából. Az összes egeret egy éjszakán át (körülbelül 12 óra) éheztették, mielőtt az aorta ventralis-ból anaesthesia (xilazin-hidroklorid) alatt vérmintát gyűjtöttek. A szérumot a vérminták centrifugálása után gyűjtötték össze. A mikrokapszula használták szúrt az epehólyag falon, majd bontsa ki az epe, illetve az egyes epe minta centrifugált a 16,000 g 30 perc. A felülúszót − 80 °C-on gyűjtötték és tárolták., Az Ileum szöveteit kivágták és jéghideg sóoldattal leöblítették, a részeket pedig azonnal − 80 °C-on tárolták további elemzés céljából.

A szérum lipidprofilok mérését

szérum TC és triglicerid (TG) a kísérlet végén Wako (Oszaka, Japán) kereskedelmi készletekkel határozták meg. A nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterint (HDL-C) és az alacsony sűrűségű lipoprotein-koleszterint (LDL-C) üledék módszerekkel és az Abcam (Cambridge, UK) kereskedelmi készletével mértük. A szérum teljes epesavat (TBA) a Blue Gene (Shanghai, Kína) kereskedelmi készletével mértük., Minden gyártó utasításait szigorúan betartották.

a székletben és az epében található epesavak HPLC-MS

elemzését a székletben és az epében található epesavak előkészítésére és meghatározására szolgáló módszereket korábbi Vizsgálatunk és Steiner et al. . A Shimadzu LC-20 AD nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás rendszert (Shimadzu, Kyoto, Japán) egy alkalmazott Biosystecm 3200 Q TRAP tömegspektrométerrel, elektrospray ionizációs (ESI) forrással (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) használták. A HPLC és MS rendszereket az Analyst 1.4 segítségével vezérelték.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., A fent említett anyagokat a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) vásárolta meg. Az elsődleges epesavakat, beleértve a CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA és gcdca, valamint a másodlagos epesavakat, beleértve a DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA és GDCA-t, az epében és a székletben a retenciós idők határozták meg.

Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR)

a vékonybél szövetéből (körülbelül 100 mg) vett mintákat jéghideg PBS-szel mostuk és homogenizáltuk. A szövetekből és sejtekből származó összes RNS-t trizol reagenssel izoláltuk (Omega Bio-tek, Norcross, USA, no. R6812). Primers tervezték Primer Express 3.,0 az adatbázis mRNS-szekvenciáin alapuló szoftver (3. táblázat), amelyet az Invitrogen (Peking, Kína) szintetizál. Az RNS-extrakció és a Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) módszereit korábbi publikációinkban ismertetjük. a qRT-PCR-t egy Step SYBR® PrimeScript ® RT-PCR Kit (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Kína). Az erősítést BIO-RAD iCycler termikus Ciklerrel (BIO-Rad, Hercules, CA, USA) végezték. A relatív mRNS expressziós szinteket összehasonlító kritikus küszöbérték (Ct) módszerrel határoztuk meg (külön csőben)., A β-aktin háztartási gént a normalizálás szabályozására használták.

a Western blot vizsgálat

a Western blot analízis a vékonybél szövet, kulturált sejtek végeztek a korábban leírt módon . Az egyes mintákból egyenértékű mennyiségű fehérjét állítottunk elő és különítettünk el SDS-PAGE (12% gélek) alkalmazásával, majd ELEKTROTRANSZFER a PVDF membránokra., A membránokat 2 órán át blokkoló oldattal (trisz-pufferolt sóoldattal, 8% zsírmentes száraz tejjel) inkubáltuk, majd 4 °C-on egy éjszakán át specifikus antitestekkel inkubáltuk. A membránokat tbst-ben (trisz-pufferelt sóoldat Tween-nel, 0,5% Tween-20 TBS-ben) alaposan megmosták, torma-peroxidáz-konjugált másodlagos antitestekkel inkubálták tbst-ben 1 órán keresztül. a membránokat tbst-ben tovább mosták, a sávokat pedig kemilumineszcencia detektáló szerekkel detektálták. Blot denzitometriát végeztek, a sávokat pedig ImageJ szoftver segítségével elemezték., Az apikális nátrium-függő epesav-transzportert (ASBT), az ileális epesavkötő fehérjét (I-BABP) és az α/β (Osta/β) szerves oldottanyag-transzportert (Cambridge, UK) célzó antitesteket Abcam-tól vásárolták. A kecske IgG elleni másodlagos antitesteket a Sun Biomedical Technology Co. (Peking, Kína).

immunfluoreszcencia

a 4% pufferelt paraformaldehiddel rögzített Ileumszövetet paraffinba ágyazták, és 4 µm vastag metszeteket készítettek. A szekciókat depaffinizálták, majd 3% H2O2-ben 15 percig leállították, hogy blokkolják az endogén peroxidázt., Metszeteket mosott PBS-ben, majd inkubáljuk egy anti-én-BABP antitest PBS-ben (1:50 hígítás) 1 h 37 °C. A FITC-konjugált (fluoreszcein isothiocyanate) antitest volt, ki 1:50 hígítás, keltetett 0,5 h a 37 °C-Szakaszok voltak, mosott, majd a PI (propidium-jodid) arra használták, hogy a folt a magok. Az I-BABP-et fluoreszcens mikroszkóppal (Bx60, Olympus, Ina, Japán) utánozták. Az I-BABP-et zöld fluoreszcenciaként figyelték meg, a magot pedig Vörös fluoreszcenciaként.,

Caco – 2 sejtkultúra

a Caco-2 sejtvonalat a pekingi Union Medical College Cellaforrás-központjából (amely a sejtvonal-erőforrás Nemzeti infrastruktúrájának központja) szeptember. 20, 2016. A PCR és a tenyészet megerősítette, hogy a sejtvonalat mycoplasma szennyeződéstől mentesen ellenőrizték. Ezeknek a sejteknek a faj eredetét PCR-vel igazolták. A sejtvonal személyazonosságát STR profilalkotással (FBI, CODIS) hitelesítették . Az összes eredmény elérhető a honlapon (http://cellresource.cn)., A Caco-2 sejteket Dulbecco módosított Eagle ‘ s mediumában (DMEM) tenyésztették, amely 10% magzati szarvasmarha szérumot (FBS), 1% penicillin-sztreptomicint és 1% nem esszenciális aminosavat tartalmaz. A Caco-2 sejteket 37 °C-on tartották 5% CO2-t és 95% levegőt tartalmazó, nedvesített légkörben. A médiumot 2 naponta cserélték. A DMEM, az FBS, az 1% – os nem esszenciális aminosavak és más anyagok a Cell Line Resource (Peking, Kína) vagy a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) Nemzeti infrastruktúrájából vásároltak.,

Caprylic acid permeability assay through Caco-2 cell monolayers

for epesav reabszorpciós kísérletek, hivatkozva a jelentés Y. Wang, et al. , a sejteket millicell akasztós sejttenyészet lapkákon (0,4 µm, Millipore, Molsheim, Franciaország) vetették be és növesztették 21 napig, hogy összefolyós és erősen differenciált sejt monolayereket kapjunk. A funkcionális epithelialis monolayerek kialakulását a transzepitheliális elektromos ellenállás (TEER) mérésével figyelték meg Millicell-ERS mérővel (Millipore) a kísérletek előtt., A sejtmorfológiát elektronmikroszkóppal figyelték meg, a permeabilitást Lucifer Yellow (Sigma, Mo, USA) segítségével határozták meg markerként.

a zsírsavak és a CA előállítását X. Zhang, et al. . A zsírsavakat és a CA-T etanolban mértük és oldottuk, majd 20 mg/L endotoxinmentes BSA-t tartalmazó sejttenyészet-közeggel hígítottuk 50, 100 vagy 200 µmol/L végső koncentrációig (etanol< 0,1%). Az oldott zsírsavakat és a CA-t a sejtek hozzáadása előtt 37 °C-os vízfürdőben 1 órán át inkubáltuk., Kaprilsavat (C8:0), kaprinsavat (C10:0), sztearinsavat (C18:0) és olajsavat (C18:1) vásároltak a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA).

az egyrétegű apikális (AP) és bazolaterális (BL) oldalát Hank kiegyensúlyozott sóoldatával (HBSS) mossuk, majd 15 percig szérummentes, teljes közegben egyensúlyozzuk. Az AP közegét friss, közepes tartalmú CA-val (200 µmol/L) helyettesítették, vagy az egyik zsírsavval (C8:0, C10:0, C18:0 vagy C18:1) keverték 50, 100 vagy 200 µmol/l-en., A Caco-2 sejtek különböző körülmények között való életképességét a WST-1 sejt citotoxicitási vizsgálattal értékelték (ábra. 1). Az egyik zsírsavval rendelkező közeget “C8:0, C10:0, C18:0 vagy C18:1 csoport” – ként határozták meg. A” kontrollcsoport “nem tartalmazott zsírsavakat, az” üres csoport ” pedig nem tartalmazott CA-t és zsírsavakat. Csak friss közeget használtak a BL-ben. Az AP és a BL oldalain lévő médiát 2 órával később eltávolították, és a CA elemzéséhez HPLC-MS-t használva tárolták., A látszólagos permeabilitást (Papp) A következő egyenlet alapján számítottuk ki: Papp = DQ / dt× 1 / C0A (DQ A vevőrekesz összetett megjelenése, dt az idő, C0 a koncentráció a donor rekeszben, A A betét felülete).