Principi generali di transgenesi
Gli organismi transgenici contengono DNA estraneo che è stato introdotto usando la biotecnologia. Il DNA estraneo (il transgene) è qui definito come DNA di un’altra specie, oppure DNA ricombinante della stessa specie che è stato manipolato in laboratorio e poi reintrodotto. I termini organismo transgenico e organismo geneticamente modificato (OGM) sono generalmente sinonimi., Il processo di creazione di organismi transgenici o cellule da venire organismi interi con un cambiamento permanente alla loro linea germinale è stato chiamato trasformazione o trasfezione. (Sfortunatamente, entrambe le parole hanno significati alternativi. La trasformazione si riferisce anche al processo di cellule di mammifero che diventano cancerose, mentre la trasfezione si riferisce anche al processo di introduzione del DNA nelle cellule in coltura, batterica o eucariotica, per un uso temporaneo, non cambiamenti della linea germinale.) Gli organismi transgenici sono importanti strumenti di ricerca e sono spesso usati quando esplorano la funzione di un gene., La transgenesi è anche correlata alla pratica medica della terapia genica, in cui il DNA viene trasferito nelle cellule di un paziente per trattare la malattia. Gli organismi transgenici sono diffusi in agricoltura. Circa il 90% di colza, cotone, mais, soia e barbabietole da zucchero coltivate in Nord America sono transgenici. Nessun altro bestiame o colture transgeniche (ad eccezione di alcuni squash, papaya ed erba medica) sono attualmente prodotti in Nord America.
Per creare una cellula transgenica, il DNA deve prima essere trasferito attraverso la membrana cellulare (e, se presente, attraverso la parete cellulare), senza distruggere la cellula., In alcuni casi, il DNA nudo (che significa plasmide o DNA lineare che non è legato a nessun tipo di vettore) può essere trasferito nella cellula aggiungendo DNA al mezzo e aumentando temporaneamente la porosità della membrana, ad esempio mediante elettroporazione. Quando si lavora con cellule più grandi, il DNA nudo può anche essere microiniettato in una cellula utilizzando un ago specializzato. Altri metodi utilizzano vettori per trasportare il DNA attraverso la membrana. Si noti che la parola “vettore” come usato qui si riferisce a qualsiasi tipo di vettore, e non solo ai vettori plasmidici., I vettori per la trasformazione/trasfezione includono vescicole fatte di lipidi o altri polimeri che circondano il DNA; vari tipi di particelle che trasportano il DNA sulla loro superficie; e virus e batteri infettivi che trasferiscono naturalmente il proprio DNA in una cellula ospite, ma che sono stati progettati per trasferire qualsiasi molecola di DNA di interesse. Di solito il DNA estraneo è un’unità di espressione completa che include i propri regolatori cis (ad esempio promotore) e il gene che deve essere trascritto.
Quando l’obiettivo di un esperimento è quello di produrre una, ereditario) eucariote transgenico, il DNA estraneo deve essere incorporato nei cromosomi dell’ospite. Perché ciò accada, il DNA estraneo deve entrare nel nucleo dell’ospite e ricombinarsi con uno dei cromatidi dell’ospite. In alcune specie, il DNA estraneo viene inserito in una posizione casuale in un cromatide, probabilmente ovunque si verifichi la rottura del filo e l’unione dell’estremità non omologa. In altre specie, il DNA estraneo può essere mirato a un particolare locus, affiancando il DNA estraneo con il DNA che è omologa al DNA dell’ospite in quel locus., Il DNA estraneo viene quindi incorporato nei cromosomi dell’ospite attraverso la ricombinazione omologa.
Inoltre, per produrre organismi multicellulari in cui tutte le cellule sono transgeniche e il transgene è stabilmente ereditato, la cellula che è stata originariamente trasformata deve essere un gamete o deve svilupparsi in tessuti che producono gameti. I gameti transgenici possono eventualmente essere accoppiati per produrre prole transgenica omozigote., La presenza del transgene nella prole è confermata tipicamente facendo uso della PCR o del blotting del sud e l’espressione del transgene può essere misurata facendo uso della PCR della inverso-trascrizione (RT-PCR), del blotting del RNA e dell’occidentale (blotting della proteina).
Il tasso di trascrizione di un transgene è altamente dipendente dallo stato della cromatina in cui è inserito (cioè effetti di posizione), così come altri fattori. Pertanto, i ricercatori spesso generano diverse linee trasformate/transfettate in modo indipendente con lo stesso transgene, e quindi schermano per le linee con la massima espressione., È anche buona pratica clonare e sequenziare il locus transgenico da un organismo transgenico appena generato, poiché errori (troncamenti, riarrangiamenti e altre mutazioni) possono essere introdotti durante la trasformazione/trasfezione.
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