acidi grassi a catena Media diminuire il colesterolo nel siero tramite la riduzione della intestinale degli acidi biliari riassorbimento nei topi C57BL/6J

Animali e diete

topi C57BL/6 topi J (4 settimane, n = 80) sono stati acquistati dall’Istituto di Scienza dell’Animale da Laboratorio, Accademia Cinese di Scienze Mediche (Licenza N. SCXK: JING2009–0007) e alloggiato in una stanza a temperatura controllata (22 ± 2 °C, umidità dal 40% al 60%) con un ciclo luce/buio di 12 ore., Il comitato per la cura e l’uso degli animali dell’ospedale generale cinese PLA ha approvato tutte le procedure sperimentali.

I topi sono stati nutriti con una dieta basale (dieta AIN-93G, acquistata dall’Accademia di Scienze mediche militari) durante la prima settimana per l’adattamento. Dieci topi sono stati scelti a caso e nutriti con una dieta basale come controllo normale, ei topi rimanenti sono stati nutriti con una dieta ricca di colesterolo (CR) modificata dalla dieta AIN-96G. Campioni di sangue sono stati raccolti dal plesso venoso mandibolare due settimane dopo., I topi con livelli sierici di TC che erano 2 deviazioni standard superiori al controllo normale (pari al 67% dei topi alimentati con la dieta CR) sono stati assegnati in modo casuale a tre gruppi (n = 12 in ciascun gruppo). Ad ogni gruppo è stata somministrata una dieta diversa per 16 settimane (Tabella 1): trigliceridi ricchi di colesterolo e a catena media (CR-MCT), trigliceridi ricchi di colesterolo e a catena lunga (CR-LCT) o CR. Nisshin Oillio (Tokyo, Giappone) ha donato il MCTs (C8:0 e C10:0) e LCTS (trigliceridi a catena lunga, olio di soia). Il colesterolo è stato acquistato da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)., Il Beijing Institute of Nutrition Resources (Pechino, Cina) ha misurato le composizioni di acidi grassi delle diete CR-MCT e CR-LCT (Tabella 2). Il peso corporeo e l’assunzione di cibo sono stati monitorati settimanalmente.,

Sangue, ileo, la bile e le feci di campionamento

Cinque topi sono stati scelti in modo casuale da ogni gruppo dopo 16 settimane di allattamento al record di dieta e assunzione di feci escrezione mediante gabbie metaboliche per 3 giorni., Le feci sono state liofilizzate, pesate, polverizzate e conservate a − 80 °C per ulteriori analisi. Tutti i topi sono stati digiunati durante la notte (circa 12 ore) prima della raccolta del campione di sangue dall’aorta ventrale sotto anestesia (xilazina cloridrato). Il siero è stato raccolto dopo la centrifugazione dei campioni di sangue. Una microcapsula è stata utilizzata per forare la parete della cistifellea ed estrarre la bile, e ogni campione di bile è stato centrifugato a 16.000 g per 30 min. Il surnatante è stato raccolto e conservato a – 80 °C., I tessuti dell’ileo sono stati asportati e risciacquati con soluzione salina ghiacciata e le porzioni sono state immediatamente conservate a – 80 °C per ulteriori analisi.

La misurazione dei profili lipidici sierici

TC e trigliceridi sierici (TG) sono stati determinati alla fine dell’esperimento utilizzando kit commerciali di Wako (Osaka, Giappone). Il colesterolo-lipoproteico ad alta densità (HDL-C) e il colesterolo-lipoproteico a bassa densità (LDL-C) sono stati misurati utilizzando metodi di sedimento e un kit commerciale di Abcam (Cambridge, UK). L’acido biliare totale sierico (TBA) è stato misurato utilizzando un kit commerciale di Blue Gene (Shanghai, Cina)., Tutte le istruzioni del produttore sono state rigorosamente seguite.

Analisi degli acidi biliari nelle feci e nella bile utilizzando HPLC-MS

I metodi per la preparazione e la determinazione degli acidi biliari nelle feci e nella bile sono stati eseguiti secondo il nostro precedente studio e rapporti di Steiner et al. . È stato utilizzato un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni Shimadzu LC-20 AD (Shimadzu, Kyoto, Giappone) accoppiato ad uno spettrometro di massa a trappola Biosystecm 3200 Q applicato con una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). I sistemi HPLC e MS sono stati controllati utilizzando Analyst 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., I suddetti materiali sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Gli acidi biliari primari, inclusi CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA e GCDCA, e gli acidi biliari secondari, inclusi DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA e GDCA, nella bile e nelle feci sono stati determinati dai tempi di ritenzione.

PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

I campioni di tessuto dell’intestino tenue (circa 100 mg) sono stati lavati con PBS ghiacciato e omogeneizzati. L’RNA totale da tessuti e cellule è stato isolato usando il reagente Trizol (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, no. R6812). I primer sono stati progettati utilizzando Primer Express 3.,0 software basato sulle sequenze di mRNA da un database (Tabella 3) e sintetizzato da Invitrogen (Pechino, Cina). I metodi per l’estrazione dell’RNA e la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) sono descritti nelle nostre precedenti pubblicazioni. La qRT-PCR è stata eseguita utilizzando un kit SYBR ® PrimeScript ® RT-PCR (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Cina). L’amplificazione è stata eseguita utilizzando un BIO-RAD iCycler Thermal Cycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). I livelli relativi di espressione dell’mRNA sono stati determinati utilizzando il metodo della soglia critica comparativa (Ct) (in un tubo separato)., Il gene di pulizia β-actina è stato usato come controllo per la normalizzazione.

Western blot assay

Le analisi Western blot del tessuto dell’intestino tenue e delle cellule coltivate sono state eseguite come descritto in precedenza . Quantità equivalenti di proteine da ciascun campione sono state preparate e separate utilizzando SDS-PAGE (12% gel) seguita da elettrotrasferimento a membrane PVDF., Le membrane sono state incubate con una soluzione bloccante (soluzione salina tamponata con Tris, latte secco 8% non grasso) per 2 h seguita da incubazione con anticorpi specifici a 4 °C durante la notte. Le membrane sono state lavate estensivamente in TBST (soluzione salina tamponata con Tris con Tween, contenente 0,5% Tween-20 in TBS) e incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano in TBST per 1 h. Le membrane sono state lavate ulteriormente in TBST e le bande sono state rilevate utilizzando agenti di rilevamento a chemiluminescenza. È stata eseguita la densitometria Blot e le bande sono state analizzate utilizzando il software ImageJ., Gli anticorpi che mirano al trasportatore apicale dell’acido biliare sodio-dipendente (ASBT), alla proteina legante l’acido biliare ileale (I-BABP) ed al trasportatore organico α/β del soluto (Ost/β) sono stati acquistati da Abcam (Cambridge, UK). Anticorpi secondari contro IgG di capra sono stati ottenuti da Sun Biomedical Technology Co. (Pechino, Cina).

Immunofluorescenza

Il tessuto ileo fissato con paraformaldeide tamponata al 4% è stato incorporato nella paraffina e sono state preparate sezioni spesse 4 µm. Le sezioni sono state deparaffinizzate e spente in 3% H2O2 per 15 min per bloccare la perossidasi endogena., Le sezioni sono state lavate in PBS e incubate con un anticorpo anti-I-BABP in PBS (diluizione 1:50) per 1 h a 37 °C. Un anticorpo coniugato con FITC (isotiocianato di fluoresceina) è stato aggiunto a una diluizione 1:50 e incubato per 0,5 h a 37 °C. Le sezioni sono state lavate e PI (ioduro di propidio) è stato I-BABP è stato ripreso utilizzando un microscopio a fluorescenza (BX60, Olympus, Ina, Giappone). I-BABP è stato osservato come fluorescenza verde e il nucleo è stato osservato come fluorescenza rossa .,

Coltura cellulare Caco-2

La linea cellulare Caco-2 è stata ottenuta dal Centro risorse cellulare, Peking Union Medical College (che è la sede della National Infrastructure of Cell Line Resource)in settembre. 20, 2016. La PCR e la coltura hanno confermato che la linea cellulare è stata controllata senza contaminazione da micoplasma. L’origine delle specie di queste cellule è stata confermata utilizzando la PCR. L’identità della linea cellulare è stata autenticata utilizzando STR profiling (FBI, CODIS) . Tutti i risultati sono disponibili sul sito web (http://cellresource.cn)., Le cellule Caco-2 sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), l ‘1% di penicillina-streptomicina e l’ 1% di aminoacidi non essenziali. Le celle Caco-2 sono state mantenute a 37 °C in un’atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 e il 95% di aria. Il mezzo è stato cambiato ogni 2 giorni. Il DMEM, FBS, 1% aminoacidi non essenziali, e altri materiali sono stati acquistati dall’infrastruttura nazionale di Cell Line Resource (Pechino, Cina) o Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).,

Test di permeabilità dell’acido caprilico attraverso monostrati di cellule Caco-2

Per esperimenti di riassorbimento degli acidi biliari, riferendosi al rapporto di Y. Wang, et al. , le cellule sono state seminate e coltivate su inserti di coltura cellulare appesi Millicell (0,4 µm, Millipore, Molsheim, Francia) per 21 giorni per ottenere monostrati cellulari confluenti e altamente differenziati. La formazione di monostrati epiteliali funzionali è stata monitorata tramite la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) utilizzando un metro Millicell-ERS (Millipore) prima degli esperimenti., La morfologia cellulare è stata osservata usando un microscopio elettronico e la permeabilità è stata determinata usando Lucifero Giallo (Sigma, MO, USA) come marker.

La preparazione di acidi grassi e CA è stata eseguita come descritto da X. Zhang, et al. . Gli acidi grassi e CA sono stati misurati e disciolti in etanolo, quindi sono stati diluiti con terreno di coltura cellulare contenente 20 mg/L di BSA senza endotossina ad una concentrazione finale di 50, 100 o 200 µmol/L (etanolo< 0,1%). Gli acidi grassi disciolti e CA sono stati incubati a bagnomaria a 37 °C per 1 ora prima dell’aggiunta alle cellule., L’acido caprilico (C8:0), l’acido caprico (C10:0), l’acido stearico (C18:0) e l’acido oleico (C18:1) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

I lati apicale (AP) e basolaterale (BL) del monostrato sono stati lavati con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e equilibrati in mezzo completo senza siero per 15 min. Il mezzo nell’AP è stato sostituito con CA contenente mezzo fresco (200 µmmol / L) o miscelato con uno degli acidi grassi (C8:0, C10:0, C18:0 o C18:1) a 50, 100 o 200 µmol/L., La vitalità cellulare delle cellule Caco-2 in condizioni diverse è stata valutata mediante il test di citotossicità cellulare WST-1 (Fig. 1). Il mezzo con uno degli acidi grassi è stato definito come il”gruppo C8:0, C10:0, C18:0 o C18:1″. Il ” gruppo di controllo “non conteneva acidi grassi e il” gruppo bianco” mancava di CA e acidi grassi. Solo mezzo fresco è stato utilizzato nel BL. I supporti dai lati AP e BL sono stati rimossi 2 h più tardi e conservati per analisi di CA utilizzando HPLC-MS., La permeabilità apparente (Papp) è stata calcolata utilizzando la seguente equazione: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ è l’aspetto composto nel compartimento ricevente, dt è il tempo, C0 è la concentrazione nel compartimento donatore e A è la superficie dell’inserto).