Frontiere della Microbiologia

Introduzione

Bacillus thuringiensis e le altre 7 specie di sporigeni i batteri Gram-positivi, tra cui B. cereus e B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, e B. mycoidesare, sono principalmente rilevati nel suolo. Poiché questi batteri sono molto simili nel genotipo e nel fenotipo, i batteri sono classificati come gruppo B. cereus in tassonomia (Park et al., 2007). B., cereus e B. thuringiensis sono altamente rilevabili negli alimenti poiché sono osservati nelle materie prime provenienti dal suolo agricolo durante la coltivazione e la distribuzione. Inoltre, questi due batteri di solito non sono discriminati nella diagnostica clinica. B. cereus è un secondo gruppo prioritario di rischio di malattie di origine alimentare nei prodotti agricoli freschi e la sua contaminazione è uno dei principali problemi nelle verdure (Felício et al., 2015). In particolare, B., thuringiensis è stato utilizzato come pesticida nella coltivazione di alcune colture ed è ben noto come insetticidi microbici che sono stati utilizzati per ridurre la quantità di pesticidi chimici (Azmi et al., 2015).

B. thuringiensis produce proteine insetticide, che sono il principale tipo di proteine cristalline (Cry) (Kutasi et al., 2016). Al contrario, le cellule vegetative in crescita attiva che mancano di produzione di cristalli portano a effetti non tossici. Le δ-endotossine contengono principalmente citolitici (Cyt) e Cry (Elleuch et al., 2015; Rao et al., 2015)., Tuttavia, Cyt e Cry possiedono diverse omologie di sequenza anche se consistono in modalità di azione simili verso la lisi cellulare, che portano a danni permanenti dell’insetto midgut (Adang et al., 2014).

La variazione strutturale di quattro δ-endotossine (Cry1, Cry2, Cry3 e Cyt2Ah) è stata osservata mediante cristallografia a raggi X (Dehury et al., 2013). Questi geni sono identificati nel cotone transgenico e in altre verdure, che sono considerevolmente efficaci nel controllo dei parassiti., La progettazione di un biomarcatore per il prodotto tradotto varia a seconda delle diverse categorie di proteine cry; quindi, la rilevazione sarà complessa. Le sequenze del gene rRNA 16S basate su primer universali hanno mostrato un’elevata somiglianza (>99%) tra B. cereus e B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), che non può essere classificato utilizzando saggi genetici e fenotipici (Peng et al., 2015). Inoltre, c’è stata una discussione dal 2000 sul fatto che l’intero gruppo B. cereus debba essere trattato come una specie complessa di batteri diversi (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz e Marjańska, 2017). Ci sono anche suggerimenti che la filogenesi di questi batteri si adatta meglio alle loro proprietà ecologiche (psicrotolleranza, virulenza) che all’affiliazione tassonomica (Drewnowska e Swiecicka, 2013; Bartoszewicz e Marjańska, 2017). Per risolvere questo problema, abbiamo preso di mira XRE per rilevare B. thuringiensis, che controlla il principale tipo di produzione di proteine cristalline.

Questi due batteri sono molto simili nei risultati biochimici (Böhm et al., 2015) e proprietà genetiche (Osman et al., 2015). Cho et al., (2015) ha anche riferito che le proprietà genetiche e fenotipiche tra questi batteri sono appena distinguibili. Inoltre, Pfrunder et al. ha riferito che le specie del gruppo B. cereus non possono essere identificate in modo affidabile utilizzando la biotipizzazione classica (Pfrunder et al., 2016). Sulla base di questi, gli esperimenti biochimici potrebbero non essere sufficienti per la differenziazione. Invece, la presenza di una proteina cristallina insetticida è stata utilizzata come caratteristica distinta per differenziare questi batteri (Ekino et al., 2014; Wei et al., 2018).,

Alcuni dei fattori che differenziano questi due batteri si basano sulla loro patogenicità nei campioni. B. cereus causa disturbi gastrointestinali, mentre B. thuringiensis è stato anche coinvolto in epidemie di diarrea. Come riportato, la caratteristica distintiva di B. thuringiensis è la presenza di proteine cristalline insetticide (δ-endotossina) crittografate da geni cry (Osman et al., 2015; Albright et al., 2016). Dal momento che il metodo di identificazione utilizzando il biomarcatore per differenziare B., il gruppo cereus è complesso e richiede molto tempo, un biomarcatore altamente efficiente è urgentemente necessario per sostituire i precedenti che hanno dato un’efficienza inferiore e talvolta hanno anche mostrato risultati falsi. Sulla base dei due geni specifici, il regolatore trascrizionale e i geni delle proteine cristalline per B. thuringiensis (Porcar e Juárez-Pérez, 2003; Han et al., 2006), l’attuale studio è stato eseguito per ispezionare e confrontare l’efficienza del biomarcatore progettato (XRE) con quella del marcatore di proteine cristalline esistente (cry2) nell’identificazione di B. thuringiensis da ceppi del gruppo B. cereus (Bcg) e non-B., ceppi del gruppo cereus (non-B) negli alimenti. cry2è la proteina cristallina più comune presente in B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma et al., 2014).

Materiali e metodi

Preparazione di colture di batteri

Tutti i 120 ceppi, tra cui 111 di Bcg e 9 non-B, sono stati ottenuti da raccolte batteriche negli Stati Uniti e in Corea del Sud (Tabella supplementare 1). Tra le collezioni, B. thuringiensis ATCC 10792 (tipo di ceppo) è stato utilizzato per l’ottimizzazione delle condizioni sperimentali di PCR convenzionale e PCR in tempo reale., Tutti i ceppi sono stati scongelati a temperatura ambiente (25°C) e striati sull’agar nutriente (Difco, MI, Stati Uniti). Dopo la coltura per 24 h a 35°C nell’incubatrice, una colonia pura è stata raccolta e inoculata in brodo di soia triptico (Difco, MI, Stati Uniti) e le colture notturne sono state utilizzate per esperimenti successivi.

Primer Design e isolamento del DNA

I rispettivi primer targeting XRE per differenziare B., thuringiensis (Tabella 1) sono stati progettati secondo la seguente sequenza in Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gene – 3664610-3665047) utilizzando il software Primer Express® (versione 3.0.1) da Applied Biosystems situato in CA, Stati Uniti e sintetizzato da Bioneer Corporation da Daejeon, Corea. Le prestazioni di designed XRE sono state confrontate con cry2 (Ben-Dov et al., 1997). Dopo 24 ore di arricchimento in TSB, un’aliquota di 1 mL di batteri è stata sottoposta all’estrazione del DNA genomico utilizzando il reagente PrepMan® Ultra Sample Preparation (Applied Biosystems, CA, Stati Uniti)., Le concentrazioni di DNA sono state misurate con fluorescenza Eppendorf BioSpectrometer® (Eppendorf, Amburgo, Germania) e regolate a 10 ng/µL. I campioni di DNA sono stati conservati a -20°C prima dell’uso.

PCR convenzionale e analisi PCR in tempo reale

La PCR convenzionale è stata preparata con un ciclatore termico C1000 TouchTM di Bio-Rad situato a Hemel Hempstead, Regno Unito., Il tubo di reazione per la PCR ha utilizzato la premiscela Accu-Power® Pyro Hot Start Taq PCR della Bioneer Corporation con sede a Daejeon, Corea e un volume di 20 µL, di cui 1 µL di ciascun primer (10 pmoL/µL) e 2 µL di DNA. Le condizioni di amplificazione della PCR convenzionale per il regolatore trascrizionale (XRE) erano: denaturazione iniziale a 95°C per 5 min, seguita da 35 cicli di denaturazione a 95°C per 30 s, ricottura a 49°C per 30 s e allungamento a 72°C per 30 s, e un allungamento finale a 72°C per 5 min., Le condizioni di amplificazione per la proteina cristallina (Cry 2) erano: denaturazione iniziale a 95°C per 5 min, seguita da 35 cicli di denaturazione a 95°C per 30 s, ricottura a 55°C per 30 s e allungamento a 72°C per 1 min, e un allungamento finale a 72°C per 5 min. Dopo amplificazioni del DNA, soluzione di gel di agarosio all ‘ 1,5% (P/V) contenente una soluzione di acido nucleico RedsafeTM 20.000 × (Intron Biotechnology, Inc.) è stato preparato e l’elettroforesi su gel è stata eseguita utilizzando il modello Sub-Cell 192 di Bio-Rad situato a Hemel Hempstead, Regno Unito., Le bande sono state visualizzate utilizzando Smart View Pro UVCI-1100 Imager system da Major Science situato in CA, Stati Uniti. L’accuratezza (AC) è stata utilizzata per valutare il metodo PCR utilizzando primer XRE e cry2 nel rilevare B. thuringiensis da Bcg e non-B. Accordo negativo (NA) significa lo stesso risultato negativo per non-B. thuringiensis utilizzando PCR con XRE e cry2. Accordo positivo (PA) significa lo stesso risultato positivo per B. thuringiensis utilizzando PCR con XRE e cry2. La precisione (AC)viene misurata utilizzando la seguente equazione, AC = ×100% (Ma et al., 2014).,

Gli esperimenti di PCR in tempo reale sono stati eseguiti dal sistema di PCR in tempo reale StepOneTM da Applied Biosystems situato in CA, Stati Uniti. Un volume di reazione di 20 µL costituito da 10 µL di Melt DoctorTM High Resolution Melting (HRM) Master Mix, 2 µL di DNA, 0,5 µL del primer F/R (10 pmoL/µL) (Tabella 2). Le condizioni di amplificazione del qPCR erano: denaturazione iniziale a 95°C per 10 min e 40 cicli a 95°C per 15 s e 60°C per 1 min. Quindi, nella successiva analisi della curva di fusione, la temperatura è stata impostata per aumentare da 60 a 95°C a 0,3°C/ciclo per testare la specificità del primer.,

Valutazione del test PCR in tempo reale

Le prestazioni di XRE e cry2 sono state valutate utilizzando 50 ceppi di B. thuringiensis, mentre l’esclusività è stata testata utilizzando 70 batteri non bersaglio, tra cui 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg e 9 non-B (Chelliah et al., 2017). Una curva standard è stata realizzata utilizzando diluizioni 10 volte del DNA estratto da B. thuringiensis ATCC 10792., Le concentrazioni di DNA sono state regolate da 10 ng/µL a 100 fg / µL, corrispondenti a 2,6 × 106 a 2,6 × 10 CFU, e le amplificazioni sono state eseguite mediante PCR in tempo reale con triplicati. Per i controlli negativi, è stata utilizzata acqua distillata. Risultati negativi o nessuna curva di amplificazione sono stati considerati quando i valori della soglia di ciclo (Ct) erano superiori a 40.

Rilevamento di B. thuringiensis in campioni di cibo a spillo

Lattuga (Lactucasativa), Kimbab e spinaci (Spinaciaoleracea) sono stati acquistati da un mercato locale a Chuncheon, in Corea., I campioni sono stati testati per l’assenza di batteri bersaglio secondo la norma ISO 7932 (2004). Un’aliquota di 50 g di ogni tipo di cibo è stata preparata in un sacchetto sterile stomacher da Nasco Whirl-Pak situato a WI, Stati Uniti. Durante la notte le colture di B. thuringiensis sono state diluite in acqua peptonica allo 0,5% e utilizzate per preparare i campioni contaminati artificialmente con livelli di inoculazione da 103 a 105 CFU / g (Chon et al., 2012; Kim et al., 2013). Un’aliquota di 1 mL della sospensione di campioni di cibo è stata trasferita in una nuova provetta sterilizzata e utilizzata per l’estrazione del DNA.,

Risultati e discussione

Rilevamento di B. thuringiensis Utilizzando il gene cry2

Per i 120 ceppi, sono stati ottenuti prodotti di amplificazione di circa 700 bp utilizzando i primer cry2 (Tabella 1). Come mostrato nella Tabella 2 e nella Figura 1, quando si utilizzava la PCR per il targeting di cry2, 6 ceppi di B. cereus e 36 ceppi di B. thuringiensis (72%) sono stati amplificati. Nessun altro gruppo B. cereus o gruppo non-B è stato amplificato. Ciò ha mostrato una precisione dell ‘ 82% di cry2 per la rilevazione dei gruppi di B. cereus. Per i 120 ceppi testati, 100 ceppi hanno dato NAs o PAS, indicando una percentuale di precisione complessiva di 83.,3% (Tabella complementare 1). Mentre Riojas et al. (2015) ha riportato una PCR multiplex di gene non ribosomiale peptide sintasi (NRPS) e cry1 per identificare B. cereus e B. thuringiensis con una specificità del 24,5% in B. cereus e del 15% in B. thuringiensis.

È stato riportato che il ceppo B. thuringiensis può sintetizzare una o più proteine cristalline poiché uno o più geni della tossina cristallina sono stati trovati per B. thuringiensis. La ragione principale della diversità dei geni della tossina è il trasferimento di plasmidi in B. thuringiensis (Adang et al., 2014). È un processo frequente per il trasferimento di plasmidi mediante coniugazione o mobilizzazione (Makart et al., 2017)., Inoltre, gli scambi di geni cry generano B. cereus con un nuovo legame di cry che porta alla somiglianza di B. cereus e B. thuringiensis (Fiuza, 2015). Inoltre, con una diversa fonte di isolamento, i geni cry hanno mostrato una differenza nella diversità e nelle distribuzioni. Ad esempio, un nuovo gene cry può essere trovato in ogni habitat che mostra un’attività insetticida diversa.

Il rilevamento di B. thuringiensis utilizzando il gene XRE

Le sequenze codificanti potenziali (CDS) erano previste come regolatori trascrizionali., CDS contiene un motivo helix-turn-helix (HTH) nella famiglia di proteine simili a XRE e nei regolatori trascrizionali della famiglia MerR, in precedenza le corrispondenti sequenze geniche XRE in pBMB28 di B. thuringiensis YBT-020 e pCT281 di B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, che è correlato al regolatore trascrizionale di tipo HTH, SinR, era identico all’elemento corrispondente pG9842 di B. cereus G9842 (GenBank: CP001187). Le proteine HTH, insieme ai fattori sigma, partecipano a una vasta gamma di vie di segnalazione, ad esempio, come repressori che inibiscono la sporulazione (Murawska et al.,, 2014), formazione di biofilm (Colledge et al., 2011), e la secrezione di proteasi (Pflughoeft et al., 2011). Oltre a Cry1Ab21 e δ-endotossina codificata nel plasmide tossigenico pIS56-63, che sono responsabili della coniugazione e della sporulazione (Martínez-Núñez et al., 2010; Deng et al., 2014) inoltre con 53 diverse proteine putative codificate.

I risultati della PCR con XRE hanno rivelato che nessuno dei 58 B. cereus o non-B ha dato un’amplificazione (Tabella 2 e Figura 1). In totale, su 50 ceppi di B. thuringiensis 47 hanno mostrato risultati positivi (94%). Questo ha mostrato una precisione di 97.,3% di XRE per la rilevazione di B. thuringiensis tra i gruppi di B. cereus testati. Per i 120 ceppi testati, 117 ceppi hanno fornito NAS o PAS, indicando una percentuale di accuratezza complessiva del 97,5% (Tabella supplementare 1).

Curva standard ed efficienza di amplificazione

Il test di PCR in tempo reale è stato eseguito utilizzando gli estratti di DNA provenienti dalle colture pure del ceppo di tipo B. thuringiensis ATCC 10792 mirando al gene XRE. Il saggio di PCR in tempo reale sviluppato è stato efficace per rilevare concentrazioni da 2,6 × 10 a 2,6 × 106 CFU / reazione, che coprivano 6 ordini di grandezza., L’equazione del numero di copia del registro rispetto al valore Ct per B. thuringiensis era y = -3.853 x+21.244 con un valore R-quadrato di 0.993, che indica l’alta linearità (Figura 2).

Rilevamento di campioni di cibo a spillo

Recentemente, B. thuringiensis è stato segnalato per essere rilevato in alimenti come latte, frutta fresca e cereali che sono stati coltivati e raccolti dal suolo al di fuori del paese., Il consumo di verdure crude e minimamente lavorate è considerato naturale e salutare, ma sono state sollevate preoccupazioni per i residui di pesticidi chimici nelle verdure fresche (Chiu et al., 2016). Pertanto, i consumatori hanno rivolto il loro interesse alle verdure biologiche (verdure prive di sostanze chimiche), e si prevede che i bio-pesticidi, tra cui B. thuringiensis, possano rappresentare il 20% del mercato mondiale dei pesticidi entro il 2020 come sostituto dei pesticidi chimici (Watts e Williamson, 2015)., In questo studio, le prestazioni della PCR real-time targeting XRE sono state valutate con 3 tipi di campioni di cibo contaminati artificialmente (lattuga, kimbap e spinaci). Colture notturne fresche di B. thuringiensis sono state inoculate in ciascun campione di cibo. La PCR in tempo reale potrebbe rilevare con successo B. thuringiensis ad una concentrazione di 4,8 × 103, 3,4 × 103 e 1,5 × 103 CFU/g in lattuga, kimbap e spinaci, rispettivamente (Figura 3). Tuttavia, per i campioni di kimbap, i valori Ct erano più alti, poiché di solito contiene materiali più complessi come salsiccia, uovo o carota rispetto alle verdure.,

Conclusione

Poiché il gruppo B. cereus è molto simile nei profili biochimici e genetici, è stato sviluppato un nuovo biomarcatore per identificare e distinguere B. thuringiensis dal gruppo strettamente correlato. Le prestazioni di XRE sono state confrontate con il gene cry2 e sono stati testati anche campioni contaminati artificialmente. Rispetto a cry2, il gene XRE è stato osservato per essere efficientemente accurato nell’identificazione di B. thuringiensis. Inoltre, la PCR in tempo reale sviluppata utilizzando XRE ha identificato con successo B., thuringiensis e potrebbe essere usato per quantificare i numeri di cella con la curva standard generata.

Contributi dell’autore

Finanziamento

Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dal Ministero dell’Agricoltura, della sicurezza alimentare e dei farmaci (Grant No. 14162MFDS085) della Repubblica di Corea e dell’Università Nazionale di Kangwon nel 2015. SW è stato grato per il sostegno finanziario del China Scholarship Council (CSC No: 201408260054). Gli autori vorrebbero ringraziare Hyun-Ah Lee presso il Laboratorio Centrale della Kangwon National University per il supporto tecnico., RC è grato per il sostegno finanziario della National Research Foundation of Korea (NRF) 2018007551.

Dichiarazione sul conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Materiale supplementare