l’Evoluzione del Profondo-Mare Gulper Anguilla Genoma Mitocondriale: su Larga Scala Riarrangiamenti del Gene Originati all’Interno del Anguille

Abstract

studi Recenti hanno dimostrato che le deviazioni dal tipico vertebrati del gene mitocondriale ordine sono più frequenti di quanto inizialmente pensato., Tali deviazioni, tuttavia, sono minori, con inversioni e / o traslocazioni di alcuni geni coinvolti e duplicazione in tandem delle regioni geniche seguite da delezioni di geni che sono state invocate come meccanismi originati in tale nuovo ordine genico., Durante il corso di studi filogenetici molecolari sugli Elopomorpha (anguille e loro alleati), abbiamo scoperto che i genomi mitocondriali (mitogenomi) delle due anguille di mare profondo, Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) e Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), presentano un ordine genetico identico che differisce notevolmente da quello di qualsiasi altro vertebrato. L’analisi filogenetica utilizzando i dati mitogenomici di 59 specie di pesci non solo ha confermato una singola origine di tale ordine genico con sicurezza, ma ha anche indicato che era stato derivato dal tipico ordine genico dei vertebrati., Confronti dettagliati dell’ordine genico dell’anguilla gulper con quello dei vertebrati tipici hanno suggerito che l’occorrenza di un singolo passo, la duplicazione su larga scala della regione genica che si estende >12 kb, seguita da eliminazioni di geni in un antenato comune delle due specie, rappresenta più parsimoniosamente questa disposizione genica insolita.

Introduzione

L’ordine genico mitocondriale dei vertebrati è stato inizialmente considerato conservativo perché le sequenze nucleotidiche complete dei genomi mitocondriali (mitogenomi) dei mammiferi (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981) e la rana artigliata africana (Roe et al. 1985) ha mostrato un ordine genico comune. Poiché le sequenze complete di DNA mitocondriale (mtDNA) sono state determinate per un certo numero di vertebrati (269 specie all ‘ 11 giugno 2003; Sito Web del National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), è stato riconosciuto che le deviazioni dall’ordine genico tipico non sono così rare nei vertebrati (fig. 1; Boore 1999). Ad eccezione dei mammiferi placentari, gli esempi includono tutti i principali lignaggi di vertebrati come lamprede (Lee e Kocher 1995), anfibi (Macey et al. 1997; Sumida et al., 2001), rettili (Kumazawa e Nishida 1995; Quinn e Mindell 1996; Macey et al. 1997), uccelli (Desjardins e Morais 1990, 1991; Quinn e Wilson 1993; Mindell, Sorenson e Dimcheff 1998), marsupiali (Pääbo et al. 1991; Janke et al. 1994), e pesce (Miya e Nishida 1999; Inoue et al. 2001b; Miya, Kawaguchi e Nishida 2001). Tali riarrangiamenti genici, tuttavia, sono locali (in particolare all’interno di un cluster di geni tRNA) e non è stato trovato alcun esempio che coinvolga riarrangiamenti su scala genomica.,

Le anguille Gulper sono ben note creature di acque profonde, incluse collettivamente quattro famiglie poste nell’ordine Saccopharyngiformes, che si trovano a profondità batipelagiche (>1.000 m) in tutti gli oceani del mondo (Bertelsen, Nielsen, and Smith 1989). Il loro aspetto bizzarro (fig. 1), che risulta da aperture estremamente ingrandite e deformate sulla punta della testa e del corpo simili a serpenti dell’anguilla, ha attirato molta attenzione da molti ricercatori (ad esempio, Bertelsen, Nielsen e Smith 1989; Robins 1989)., Tali caratteristiche anatomiche specializzate hanno portato i ricercatori a supporre che le posizioni filogenetiche di questi animali siano al di fuori dei pesci ossei (ad esempio, Tchernavin 1946), sebbene siano stati generalmente considerati parenti stretti delle vere anguille (ordine Anguilliformes), perché hanno uno stadio larvale leptocefalo simile a una foglia (Greenwood et al. 1966; Inoue e Miya 2001).,

Durante il corso di studi filogenetici molecolari degli Elopomorpha (anguille e loro alleati) utilizzando dati mitogenomici, abbiamo trovato un insolito ordine genico mitocondriale per una delle anguille gulper, Eurypharynx pelecanoides (fig. 1). Questo articolo descrive la nuova organizzazione genica nei mitogenomi di due specie di anguille gulper, E. pelecanoides e Saccopharynx lavenbergi. Abbiamo impiegato un approccio basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) sviluppato da Miya e Nishida (1999) per sequenziare i mitogenomi completi di questi pesci., Per esplorare l’origine di tali mitogenomi unici, abbiamo sottoposto i dati mitogenomici ad analisi filogenetiche, e discutiamo qui i possibili meccanismi che generano una tale disposizione genica nelle due anguille gulper.

Materiali e metodi

Campioni

Sequenze di DNA mitocondriale sono state ottenute da sei individui di due specie che rappresentano due famiglie nell’ordine Saccopharyngiformes (Robins 1989). Per la famiglia monotipica Eurypharyngidae, un individuo di E., pelecanoides è stato utilizzato come campione per la determinazione della sequenza mtDNA completa, e gli altri quattro individui, tra cui due larve leptocephalous, sono stati utilizzati per la determinazione di sequenze parziali di quattro principali giunzioni geniche (fig. 2) per confermare l’ordine del gene nel mitogenoma E. pelecanoides. Per la famiglia Saccopharyngidae, un singolo individuo di S. lavenbergi è stato utilizzato come campione per la determinazione della sequenza mtDNA completa., Voucher campioni sono stati depositati nel pesce collezioni del Museo di Storia Naturale & Istituto, Chiba, Giappone (CBM-ZF), e presso l’Università di Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, sud del Giappone; CBM-ZF 10312, 10313, 10316, e 10317: equatoriale centrale dell’Oceano Pacifico) e di S. lavenbergi (UW 045633: Pacifico Orientale).

Estrazione del DNA

Una porzione della muscolatura epassiale (ca. 0,25 g) è stato asportato da campioni freschi di ciascuna specie e immediatamente conservato in etanolo al 99,5%., Il DNA genomico totale è stato estratto utilizzando il kit di tessuti Qiagen QIAamp seguendo il protocollo del produttore.

Reazione a catena della polimerasi e sequenziamento

Gli interi mitogenomi di due anguille gulper sono stati amplificati utilizzando una tecnica long-PCR (Cheng, Higuchi e Stoneking 1994). Cinque primer fish-universal e tre specie-specific long-PCR (S-LA-16S-L + H12293-Leu e L12321-Leu + S-LA-16S-H per E. pelecanoides; L2508–16S + Sala-ND4-H e Sala-CO1 – L + Sala-ND1-H per S. lavenbergi; fig. 1) sono stati usati per amplificare l’intero mitogenoma di ogni anguilla in due reazioni., Gli interi mitogenomi degli altri quattro individui di E. pelecanoides sono stati amplificati con tre primer universali per pesci e un primer per PCR lungo specifico per specie (L2508-16S + Eupe-ND2-H e L12321–Leu + S-LA-16S-H). Quattro primer specie-specifici (Eupe-ND2-H per E. pelecanoides; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H e Sala-ND4-H per S. lavenbergi) sono stati alternativamente progettati con riferimento alle sequenze nucleotidiche parziali del gene ND2 di E. pelecanoides e dei geni COI, ND1 e ND4 di S. lavenbergi determinati da ciascun DNA totale utilizzando primer fish-universal.,

I prodotti long-PCR sono stati diluiti con TE buffer (1:20) per un uso successivo come modelli di PCR, ad eccezione di una regione che interviene tra i due primer long-PCR (tra S-LA-16S-H e S-LA-16S-L, e H12293-Leu e L12321-Leu per E. pelecanoides; fig. 1), in cui il DNA genomico totale è stato utilizzato in alternativa.

Un totale di 82 primer fish-universal (Miya e Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d; Ishiguro, Miya e Nishida 2001; Kawaguchi, Miya e Nishida 2001) sono stati utilizzati in varie combinazioni per amplificare segmenti contigui e sovrapposti dell’intero mitogenoma per ciascuna delle due specie. I primer specifici per specie sono stati progettati nei casi in cui non fossero disponibili primer universali per pesci appropriati. Un elenco di primer PCR utilizzati per una specie specifica è disponibile presso J. G. I. su richiesta. La PCR lunga e le successive reazioni di PCR sono state eseguite come descritto in precedenza (ad esempio, Miya e Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

I prodotti PCR a doppio filamento, purificati utilizzando un kit di pre-sequenziamento (USB), sono stati successivamente utilizzati per il sequenziamento a ciclo diretto utilizzando terminatori etichettati con colorante (Applied Biosystems). I primer utilizzati erano gli stessi di quelli per la PCR. Tutte le reazioni di sequenziamento sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore. I frammenti etichettati sono stati analizzati mediante un sequencer del DNA modello 377 (Applied Biosystems).

Analisi delle sequenze

Le sequenze di DNA sono state analizzate utilizzando il programma DNASIS versione 3.2 (Hitachi Software Engineering)., Le posizioni dei 13 geni codificanti proteine sono state determinate mediante confronti di sequenze di DNA o amminoacidi di mitogenomi di pesci ossei. I 22 geni tRNA sono stati identificati dalle loro strutture secondarie quadrifoglio (Kumazawa e Nishida 1993) e sequenze di anticodoni. I due geni rRNA sono stati identificati dalla somiglianza di sequenza e dalla struttura secondaria (Gutell, Gray e Schnare 1993). I dati di sequenza sono disponibili da DDBJ / EMBL / GenBank con i numeri di adesione AB046473 e AB046475–AB046490 per E. pelecanoides e AB047825 per S. lavenbergi.,

Analisi filogenetica

Le matrici di dati di Inoue et al. (2001d) e Miya, Kawaguchi e Nishida (2001) sono stati combinati e i taxa ridondanti sono stati eliminati. Sono state aggiunte sequenze mitogenomiche da due anguille gulper e due teleostei (Gymnothorax kidako, AP002976 e Salmo salar, U12143). Poiché non erano possibili allineamenti univoci dei due geni rRNA sulla base di modelli di struttura secondaria (Miya e Nishida 2000), non sono stati utilizzati nelle analisi., Il gene ND6 non è stato utilizzato nelle analisi filogenetiche a causa della sua composizione di base eterogenea e delle prestazioni filogenetiche costantemente scarse (ad esempio, Zardoya e Meyer 1996; Miya e Nishida 2000). Inoltre, i loop tRNA, tRNASer (AGY) (strutture secondarie instabili inferite in alcune specie) e altre regioni ambiguamente allineate, come le estremità 5′ e 3′ di diversi geni codificanti proteine, sono stati esclusi dalle analisi., Inoltre, sono state escluse dalle analisi le posizioni del 3 ° codone nei geni codificanti proteine che potrebbero indurre in errore un’analisi delle relazioni di livello superiore degli actinopterigi (Miya e Nishida 2000), lasciando 7.984 posizioni nucleotidiche disponibili dai geni codificanti proteine 12 e dai geni tRNA 21.

Le analisi filogenetiche bayesiane sono state condotte utilizzando MrBayes 2.01 (Huelsenbeck e Ronquist 2001)., Il modello reversibile del tempo generale con alcuni siti ritenuti invariabili e con siti variabili assunti per seguire una distribuzione gamma discreta (GTR + I + Γ; Yang 1994) è stato selezionato come il modello più adatto della sostituzione nucleotidica (ModelTest versione 3.06; Posada e Crandall 1998). Impostiamo i parametri di massima verosimiglianza in MrBayes come segue: “lset nst = 6 “(GTR),” rates = invgamma “(I + Γ) e” basefreq = estimate ” (proporzione stimata dei tipi di base dai dati). Il processo Markov chain Monte Carlo è stato impostato in modo che quattro catene (tre riscaldate e una fredda) corressero contemporaneamente., Abbiamo condotto due corse indipendenti per 1 milione di generazioni, con alberi campionati ogni 100 generazioni, ognuno dei quali è partito da un albero casuale. Due analisi indipendenti hanno converguto su punteggi di log-verosimiglianza simili e hanno raggiunto la “stazionarietà” (mancanza di miglioramento nei punteggi ML) non più tardi di 120.000 generazioni., Pertanto, i primi 1.200 alberi sono stati scartati da ciascuna analisi e i restanti 17.602 campioni combinati da due analisi indipendenti sono stati utilizzati per generare un albero di consenso della regola di maggioranza del 50%, con la percentuale di campioni che recuperano un particolare clade che rappresenta la probabilità posteriore di quel clade (Huelsenbeck e Ronquist 2001).

Risultati

Organizzazioni del genoma

Le lunghezze totali dei mitogenomi E. pelecanoides e S. lavenbergi sono 18.978 bp e 18.495 bp (ad eccezione di una parte della regione di controllo putativa per S., lavenbergi), rispettivamente (vedi Materiale supplementare online). Il contenuto del genoma di queste due anguille gulper include due rRNA, 22 tRNA e 13 geni codificanti proteine, come si trova in altri vertebrati (fig. 2). Anche come in altri vertebrati, la maggior parte dei geni di queste due specie sono codificati sul filamento H, ad eccezione dei geni ND6 e otto tRNA. Tutte le caratteristiche sono simili in lunghezza a quelle di altri pesci ossei, ad eccezione del gene COI e della regione di controllo per E. pelecanoides e dei geni COI e cyt b per S., lavenbergi (circa 100, 800, 150 e 30 bp più lunghi di quelli di altri pesci ossei, rispettivamente).

Il mitogenoma E. pelecanoides contiene tre regioni non codificanti più lunghe di 200 bp (fig. 2; vedi anche Materiali supplementari online; regione di non codifica e regione di controllo). L’nc1, situato tra i geni tRNASer (UCN) e tRNAAsp, e l’nc2, situato tra i geni tRNAAsp e COII, contengono rispettivamente due e quattro pseudogeni corrispondenti a copie degeneranti del gene tRNAAsp., Una regione non codificante (1.818 bp) situata tra i geni cyt b e tRNAPhe sembra corrispondere alla regione di controllo. Il mitogenoma di S. lavenbergi contiene anche tre regioni non codificanti più lunghe di 200 bp (regione non codificante e regioni di controllo ). L’nc, situato tra i geni tRNALeu(CUN) e ND5, contiene almeno due pseudogeni corrispondenti a copie degeneranti del gene tRNALeu (CUN)., CR1 (992 bp), situato tra due cluster di geni tRNA (regioni TP e IM), e CR2 (> 837 bp), situato tra i geni cyt b e tRNAPhe, sembrano corrispondere alla regione di controllo e hanno sequenze completamente identiche oltre 800 bp, indicando che stanno subendo un’evoluzione concertata (vedi Kumazawa et al. 1998).

Ad eccezione delle due regioni di controllo duplicate (CR1 e CR2) nel mitogenoma di S. lavenbergi, i mitogenomi delle due anguille di mare profondo presentano un ordine genetico identico (fig. 2)., Tuttavia, l’ordine genico mitocondriale delle due anguille gulper differisce notevolmente da quello di tutti gli altri vertebrati conosciuti fino ad oggi. Quando alcuni geni tRNA sono stati esclusi dai confronti (fig. 2), abbiamo identificato cinque blocchi genici(A, tRNAGlu–tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; ed E, tRNAArg–tRNASer (AGY) regioni geniche), il cui ordine genico è identico a quello dei vertebrati tipici.,

Posizioni filogenetiche di due Anguille Gulper

La figura 3 è un albero di consenso della regola di maggioranza del 50% dei 17.602 campioni combinati da due analisi bayesiane indipendenti delle 59 sequenze nucleotidiche mitocondriali dalle 12 codificanti proteine concatenate (nessuna 3a posizione del codone), più 21 geni tRNA (solo regioni staminali) utilizzando il modello GTR + I + Γ di evoluzione delle sequenze (Yang 1994). Con l’eccezione di alcuni nodi all’interno del Neoteleostei, la maggior parte dei rami interni erano supportati da alte probabilità posteriori bayesiane (≥95%)., Va notato che l’albero risultante dimostra esplicitamente non solo che le due anguille gulper formano una relazione sorella-gruppo con un’alta probabilità posteriore (100%), ma anche che sono profondamente annidate all’interno degli Anguilliformes (vere anguille), suggerendo fortemente che sono state derivate da un antenato simile all’anguilla.

Discussione

Recentemente, sono state determinate più di 140 sequenze mtDNA complete dai pesci actinopterigi (ad esempio, Miya e Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya e Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya e Nishida 2001; Miya, Kawaguchi e Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003), e sono stati riportati diversi esempi di riarrangiamenti genici (fig. 1). Va notato che tali eventi di riarrangiamento del gene coinvolgono pochi geni e che la disposizione genica dei mitogenomi dell’anguilla gulper differisce notevolmente da quella di altri vertebrati.,

Implicazioni filogenetiche sull’origine del nuovo Ordine genico

Per dedurre l’evoluzione degli arrangiamenti genici nelle due anguille gulper, è necessaria l’inferenza per l’organizzazione ancestrale basata su un quadro filogenetico affidabile. Sebbene le anguille gulper siano state incluse negli Elopomorpha basandosi esclusivamente su una forma larvale pelagica distinta, chiamata leptocephalus, nessuno ha confermato la loro posizione filogenetica usando matrici di caratteri derivate da dati morfologici o molecolari (Inoue e Miya 2001).,

Analisi bayesiana utilizzando i dati mitogenomici di 59 specie che rappresentano pienamente la diversità dei pesci teleostei (fig. 3) non solo ha confermato che il nuovo ordine genico delle due anguille gulper ha avuto origine in un antenato comune delle due specie, ma ha anche dimostrato che la loro origine era indipendente da quelle degli altri nuovi ordini genici. Sembra anche che il nuovo ordine genico di Conger myriaster, un altro membro degli Elopomorpha, abbia un’origine indipendente da quella delle anguille gulper., Va notato che Anguilla japonica, che ha il tipico ordine genico dei vertebrati, è stata tranquillamente collocata come specie sorella delle due anguille gulper. La ricostruzione più parsimoniosa degli eventi di riarrangiamento del gene sull’albero filogenetico ha indicato che l’ordine genico aberrante delle due anguille gulper deriva da quello dei vertebrati tipici.

Possibile meccanismo per il riarrangiamento genico nelle anguille Gulper

Due meccanismi principali sono stati proposti per spiegare i riarrangiamenti genici nei mitogenomi dei vertebrati (Lee e Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Uno è la duplicazione in tandem delle regioni geniche a seguito di un errore di accoppiamento del filamento scivolato, seguito dalle eliminazioni dei geni (Moritz e Brown 1986; Levinson e Gutman 1987). Sebbene la dinamica degli arrangiamenti dei geni mitocondriali non sia stata spiegata in alcuni invertebrati (ad esempio, Kurabayashi e Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et al. 2002), i riarrangiamenti dei geni mitocondriali dei vertebrati possono essere spiegati da un tale meccanismo (Desjardins e Morais 1990; Quinn e Wilson 1993; Kumazawa e Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson e Dimcheff 1998; Miya e Nishida 1999; Inoue et al. 2001b), e la sua fattibilità è supportata anche dalle frequenti duplicazioni polimorfiche di sequenze mtDNA (ad esempio, Stanton et al. 1994; Gach e Brown 1997; Mindell, Sorenson e Dimcheff 1998; Miya e Nishida 1999). Gli altri meccanismi suggeriti invocano l’innesco illecito della replicazione da parte dei TRNA e la conseguente integrazione dei geni tRNA attorno alla regione di controllo (Cantatore et al. 1987; Jacobs et al. 1989).,

Sebbene il secondo modello non sia escluso a questo punto, il primo modello è favorito come meccanismo di riarrangiamento del gene nei mitogenomi dell’anguilla gulper. Supponendo che un lungo frammento di DNA nella regione tRNAIle–CR dell’organizzazione tipica sia duplicato (fig. 4), successive eliminazioni di geni ridondanti darebbero origine all’organizzazione genica riorganizzata nelle anguille gulper. Tale duplicazione in tandem e successive eliminazioni hanno portato più parsimoniosamente all’ordine genico osservato e ai distanziatori intergenici associati in queste due anguille gulper.,

Le eliminazioni multiple di geni ridondanti sembravano essere incomplete nelle due anguille gulper, a causa di diversi tratti di sequenze non codificanti (fig. 2) che si verificano intorno ai geni coinvolti nel riarrangiamento (fig. 4). Sebbene nc1 e nc2 in E. pelecanoides e nc in S. lavenbergi siano composti da pseudogeni ripetitivi corrispondenti a copie degeneranti del gene tRNA adiacente, CR1 e CR2 in S. lavenbergi mitogenome hanno sequenze identiche oltre 800 bp, e CR1 si trova nella posizione duplicata putativa mentre CR2 si trova nella posizione originale della regione di controllo., Questa osservazione nel mitogenoma di S. lavenbergi supporta il concetto di duplicazione tandem e successivi eventi di delezione come si sono verificati nella regione tRNAIle–CR (fig. 4).

Se quattro dei cinque blocchi genici contigui sono stati duplicati insieme in un antenato comune delle due specie, e se la successiva delezione dei geni si è verificata prima della speciazione, le porzioni duplicate presunte di anguille gulper, che vanno dal gene tRNAIle al CR dell’organizzazione tipica, si estendevano oltre 12 kb (fig. 1)., Prima di questo studio, le presunte regioni duplicate del riarrangiamento dei vertebrati mai conosciuto erano al massimo 4 kb. Inoltre, tutte le note sequenze codificanti ripetute in tandem erano limitate alle regioni adiacenti alle regioni CR, IQM o WANCY, probabilmente riflettendo occasionali terminazioni imprecise di repliche oltre le loro origini. La regione duplicata nel mitogenoma dell’anguilla gulper era molto più grande di quella dei riarrangiamenti vertebrati mai conosciuti e coinvolgeva quasi l’intero mitogenoma(fig. 1).