Potenziali effetti antiproteolitici della L-leucina: osservazioni di studi in vitro e in vivo

L’atrofia muscolare scheletrica è considerata un importante problema di salute pubblica a causa delle sue conseguenze primarie (alterazioni metaboliche) e secondarie (perdita di forza, diminuzione dell’autonomia). Come noto, il processo di atrofia diventa evidente quando la degradazione delle proteine del muscolo scheletrico viene aumentata al di sopra della sintesi proteica durante un periodo di tempo prolungato., In questo contesto, l’integrazione di leucina sembra essere una promettente terapia anti-atrofia, che agisce inibendo la proteolisi del muscolo scheletrico e / o aumentando la sintesi proteica, un effetto che può eventualmente essere sia dipendente dalla dose che dall’atrofia muscolare scheletrica. Questa revisione discuterà gli effetti della supplementazione di leucina nella regolazione della proteolisi del muscolo scheletrico sia negli studi in vitro che in vivo.,

Effetti anti-atrofia della supplementazione di leucina

Gli effetti proteici risparmiatori della supplementazione di leucina sono noti sin dagli studi iniziali di Buse& Reid (1975) ., A causa delle sue proprietà di azione isolata, la leucina è in realtà considerata non solo una proteina costituente AA, ma anche un’entità fisiofarmacologica, la cui somministrazione è in grado di promuovere importanti azioni anti-cataboliche, come l’attenuazione del catabolismo muscolare scheletrico durante la perdita di peso, la facilitazione di un processo di guarigione e il miglioramento del turnover proteico,

In generale, la supplementazione di leucina dimostra costantemente una diminuzione della proteolisi del muscolo scheletrico quando viene infusa per via endovenosa , incubata con l’intero muscolo , incubata con cellule muscolari scheletriche e sotto alimentazione orale . Va notato che l’entità dell’inibizione è diversa a seconda della specie, della condizione patologica e, in particolare, del modello di atrofia., È importante sottolineare che nelle colture di cellule muscolari scheletriche si verificano anche gli effetti antiproteolitici della supplementazione di leucina, ma in questo sistema l’effetto dose-dipendente della leucina sembra essere spostato in un intervallo di concentrazione bassa rispetto all’intera incubazione muscolare .

Negli studi cronici l’efficacia della supplementazione di leucina non è ben dimostrata come in quelli acuti, ma in questo livello la supplementazione di leucina mostra anche importanti effetti antiproteolitici. Infatti, un recente studio condotto da Combaret et al. (2005) ha mostrato che la supplementazione di leucina cronica orale (~0.,7 g/kg/die per un periodo di 10 giorni) ha presentato effetti inibitori di lunga durata sulla proteolisi muscolare scheletrica di circa ~30%, ripristinando l’inibizione postprandiale difettosa della proteolisi proteosoma-dipendente. Sostenendo anche l’evidenza di una diminuzione della proteolisi indotta dalla supplementazione di leucina, uno studio condotto da Ventrucci et al. (2004) ha dimostrato che nei ratti indotti da cachessia tumorale, il consumo di una dieta arricchita di leucina (3%) per un periodo di 20 giorni ha ridotto la degradazione proteica nei muscoli gastrocnemio di circa l ‘ 11%, aumentando il contenuto di catena pesante di miosina di circa il 47%., Recentemente, con lo stesso design dello studio, Eley et al. (2007) ha dimostrato che il consumo di 1 g/kg/die di BCAA per 12-15 giorni sopprime la perdita di peso corporeo di circa il 33% e diminuisce la degradazione proteica di circa il 62% nei muscoli solei. Tuttavia, al contrario, Sadiq et al. (2008) ha dimostrato che nei vitelli, 5 giorni di infusione endovenosa di EAA (rendendo i livelli plasmatici di leucina ~0,24 mm) sotto deficit energetici e proteici hanno migliorato l’equilibrio dell’azoto, ma la proteolisi del muscolo scheletrico non è stata attenuata., Nel complesso, gli studi cronici hanno dimostrato che l’integrazione di leucina è un’importante strategia anti-atrofia, ma la mancanza di standardizzazione relativa alla dose di integrazione di leucina (ingerita e assorbita) compromette le principali conclusioni relative all’entità dell’effetto. La tabella 1 riassume importanti studi relativi agli effetti della leucina sulla proteolisi del muscolo scheletrico sia nell’uomo che negli animali.,

Acuta integrazione di Leucina: Relazione tra la Dose e l’Effetto

portare circa l’efficacia delle AA supplementazione, è necessario capire la sua dose-effetto proprietà., A questo proposito, il gruppo di Michael Rennie ha fatto importanti scoperte relative all’esistenza di una relazione dose-risposta curvilinea tra l’EAA extra cellulare (in particolare la leucina tra questi) e la sintesi proteica del muscolo scheletrico umano . Il concetto è che in condizioni normali, un singolo pasto sembra promuovere i massimi effetti sulla sintesi proteica. Questa scoperta si basa su studi condotti sia nei ratti adulti che negli esseri umani adulti, mostrando che la concentrazione plasmatica di leucina nello stato PA è approssimativamente 0.,1 mM e allo stato PP, è aumentato di circa l ‘ 80% o più, rendendo valori medi di 0,2 mM. Questo valore sembra essere in grado di promuovere il massimo aumento della sintesi proteica e di saturare il sistema .

Quando il problema è l’inibizione della degradazione delle proteine, molto meno è noto su questa proprietà di dose-effetto, anche negli studi sugli animali. I risultati presentati in letteratura mostrano variazioni, basate sul muscolo scheletrico studiato, l’isotopo utilizzato per misurare il metabolismo delle proteine e il sistema studiato (studi in vitro vs in vivo)., Tuttavia, un’analisi più approfondita di questi studi, in particolare studi in vitro (dove è possibile rilevare simultaneamente la sintesi proteica e il metabolismo della degradazione proteica), rivela nuove scoperte nonostante le differenze metodologiche. Pertanto, una reinterpretazione di questi studi è giustificata per generare un nuovo concetto su una relazione dose-effetto leucina.,

Nelle colture di cellule muscolari scheletriche, l’assenza di aminoacidi (specialmente leucina), sembra controllare la degradazione delle proteine principalmente attraverso l’attivazione della proteolisi lisosoma-dipendente Inoltre, durante le incubazioni muscolari intere, l’integrazione di leucina porta ad una diminuzione dell’attività proteolitica ATP-ubiquitina-dipendente . Tuttavia, non ci sono ancora informazioni meccanicistiche attuali su come il segnale nutrizionale indotto da AA sia percepito dalla cellula muscolare (cioè intracellulare o extracellulare). Diversi studi di Mortimore e colleghi e Pösö et al., (1982) , ha dimostrato che nel fegato, la concentrazione extra cellulare di AA detta in modo dose-dipendente, l’inibizione della proteolisi all’interno delle cellule epatiche e che tra AA, la leucina era l’inibitore più forte.

Quando correlato al muscolo scheletrico, la concentrazione intracellulare di AA non è disponibile nella maggior parte degli studi., Tuttavia, sulla base delle concentrazioni extra cellulari di AA (livelli plasmatici e/o livelli extra cellulari) è possibile supporre che la concentrazione di leucina presente per controllare la sintesi proteica sia disponibile anche per controllare la degradazione proteica, indipendentemente dal processo del meccanismo. Sulla base di questa ipotesi, i risultati di diversi studi sono riassunti di seguito. Essi suggeriscono che la dose di leucina in grado di causare i massimi effetti sulla degradazione delle proteine può essere superiore a quella in grado di causare i massimi effetti sulla sintesi proteica in condizioni di equilibrio proteico negativo., Tuttavia, questo effetto dose-dipendente sembra non verificarsi in colture di cellule muscolari scheletriche .

Studi sugli animali

In uno studio precedente del 1977, Buse& Weigand ha dimostrato che i muscoli del diaframma del ratto incubati con una concentrazione di leucina di 0,5 mm (due volte quella della concentrazione di leucina trovata nello stato PP) erano in grado di aumentare la sintesi proteica del muscolo scheletrico nel 36-38%. Tuttavia, la degradazione della proteina è stata inibita in 4.,7%, indicando che un’elevata concentrazione fisiologica di leucina è in grado sia di stimolare fortemente la sintesi proteica sia, in misura minore, di inibire la degradazione proteica, anche in assenza di un apporto ormonale. In accordo con questo, Tischler et al. (1982), muscoli del diaframma del ratto incubati con un’ampia concentrazione di leucina (che va dallo stato PA a PP). Hanno osservato che una concentrazione di leucina di 0,1 mm aumentava significativamente la sintesi proteica del muscolo scheletrico. Tuttavia, questa stessa concentrazione di leucina (0.,1 mM) non ha influenzato i tassi di degradazione delle proteine, che sono stati alterati solo quando la concentrazione di leucina è stata aumentata a un intervallo da 0,2 a 0,5 mm.All’interno di questo intervallo di concentrazione, la degradazione proteica è diminuita progressivamente di una quantità assoluta maggiore di quella che stimolava la sintesi proteica (Tabella 1).

Al fine di verificare se questi risultati sono stati osservati solo quando AA sono stati somministrati in vitro, Kee et al., (2003) ha effettuato uno studio utilizzando i muscoli estensori del digitorum longus, con l’apporto nutrizionale fornito durante le condizioni in vivo (infuse), in presenza di fattori ormonali endogeni. I risultati hanno mostrato che in 48 ore di ratti affamati, 4 ore di infusione di AA hanno elevato i livelli plasmatici di leucina a valori di circa 0,57 mm. Questo aumento dei livelli plasmatici di leucina è stato in grado di ripristinare i livelli di insulina e corticosterone ai valori osservati nei ratti controllati, aumentando contemporaneamente la sintesi proteica del muscolo scheletrico nel 55,6%., Tuttavia, alla stessa concentrazione di leucina, la proteolisi del muscolo scheletrico è stata ridotta a solo il 17,9% (valore non statisticamente diverso dal gruppo affamato), suggerendo che anche in presenza di fattori ormonali, la concentrazione di leucina in grado di stimolare la sintesi proteica è attenuata rispetto alla degradazione proteica.

In un altro studio, Hong& Layman (1984) ha analizzato i muscoli solei di ratti affamati (24 h e 72 h di digiuno) incubati con leucina (0,5 mm)., Hanno osservato che nei ratti 24 h e 72 h digiunati, la sintesi proteica è stata aumentata rispettivamente del 59% e del 24%, ma la degradazione proteica non è stata alterata utilizzando questa concentrazione di leucina nei muscoli solei. Al contrario, Busquets et al. (2000), hanno incubato i muscoli del soleo di ratto con una maggiore concentrazione di leucina di 5 mM e 10 mm. Hanno osservato che la proteolisi del muscolo scheletrico era inibita in modo dose-risposta, cioè concentrazioni di leucina di 5 mm causavano un’inibizione del 5,7% nella proteolisi, mentre 10 mm avevano causato un’inibizione del 24,5%., Questo studio rivela che l’aumento della concentrazione di leucina a valori 10-20× rispetto a quelli osservati negli altri studi, era in grado di determinare diminuzioni della proteolisi del muscolo scheletrico, un risultato che è in accordo con un altro studio condotto da Mitchell et al. (2004) che ha osservato che l’incubazione delle cellule muscolari scheletriche con una concentrazione di leucina di 5 mm era in grado di inibire la proteolisi muscolare scheletrica nell ‘ 8-12%., Pertanto, un plateau per una concentrazione di leucina correlata all’inibizione della degradazione delle proteine del muscolo scheletrico durante le condizioni in vitro non è stato ancora stabilito, ma questi studi suggeriscono che una concentrazione di leucina 10-20× superiore a quella avuta nello stato PP (~0,2 mm) è ancora in grado di esercitare i suoi effetti anti-proteolitici.,

Una limitazione degli studi di cui sopra era che sebbene le misurazioni in vitro riflettessero qualitativamente i tassi di turnover proteico presenti nell’animale intatto prima del periodo di incubazione, il metabolismo proteico misurato nell’intero muscolo durante le condizioni in vitro era sempre in uno stato pronunciato di equilibrio proteico negativo anche nei muscoli di controllo . Tuttavia, questa situazione potrebbe imitare quella osservata in una condizione atrofica in vivo, in cui la degradazione delle proteine del muscolo scheletrico è aumentata rispetto alla sintesi proteica ., Pertanto, in determinate condizioni atrofiche, è possibile che la quantità di leucina integrata in grado di inibire al massimo la proteolisi muscolare possa essere maggiore di quella utilizzata per produrre i massimi effetti sulla sintesi proteica.

Studi sull’uomo

Al momento sono state utilizzate metodologie accurate per misurare la sintesi proteica in vivo, ma quando il problema è la degradazione delle proteine, diversi metodi hanno presentato importanti limitazioni, specialmente se correlati alla degradazione delle proteine nel muscolo., Ad esempio, l’escrezione urinaria di 3-metil-istidina (3-MH) è stata ampiamente utilizzata per stimare la disgregazione proteica muscolare, sia negli animali da esperimento che nell’uomo . La logica per usando 3-MH urinario come misura della proteolisi del muscolo scheletrico è che la parte principale di 3-MH è presente in actina e miosina del muscolo ed importante, 3-MH non è riutilizzata per la sintesi delle proteine, essendo un indice di degradazione della proteina ., Tuttavia, la specificità dell’escrezione urinaria di 3-MH è stata contestata, specialmente in condizioni in vivo, perché in alcune condizioni atrofiche come il trauma chirurgico è stata osservata una sovrapproduzione sproporzionata di 3-MH da fonti non muscolari . Un’altra metodologia adottata in vivo per misurare la degradazione delle proteine è quella di seguire la perdita di radioattività da proteine precedentemente etichettate dalla somministrazione di traccianti radioisotopi. Quando viene utilizzato questo metodo, una delle principali preoccupazioni è che AA radioattivo derivato dalla disgregazione delle proteine, entra nel pool di precursori e viene riutilizzato per la sintesi proteica., Tale riciclaggio di AA etichettati si traduce in tassi di rottura apparenti che sottovalutano i veri tassi di degradazione . Infine, una domanda importante è il contributo di tutto il corpo rispetto al tessuto muscolare scheletrico nei tassi di degradazione delle proteine. Per risolvere questa domanda, diversi studi sull’uomo hanno utilizzato la tecnica artero-venosa net balance (NB) per valutare i tassi di sintesi proteica e la scomposizione proteica negli arti (che sono per lo più muscolari) e l’amminoacido fenilalanina è stato utilizzato per tracciare la proteina muscolare perché non è né prodotta né metabolizzata nel muscolo., Utilizzando questa tecnica, la ripartizione delle proteine muscolari può essere stimata dal valore calcolato per il tasso di comparsa della fenilalanina alla vena, durante uno stato stazionario nella concentrazione di aminoacidi nel sangue. Tuttavia, un problema generale con l’uso della tecnica artero-venosa NB dell’avambraccio o della gamba per valutare il metabolismo muscolare in modo acuto, è che questo approccio ha limitazioni pratiche associate al tempo e al sangue richiesto e, ancora più importante, non consente la valutazione di effetti di breve durata sul metabolismo delle proteine muscolari , difficili studi dose-risposta di proteolisi., A tutti, mentre vi è una mancanza di metodi affidabili per misurare la degradazione proteica in vivo nel muscolo scheletrico, la degradazione proteica dell’intero corpo può essere stimata dal flusso di isotopi radiomarcati o stabili nel plasma o nell’azoto nelle urine.

Diversi autori hanno dimostrato che la leucina e la supplementazione di BCAA (orale o infusa) sono in grado di entrambi, aumentando la sintesi proteica o diminuendo la degradazione proteica nell’uomo ., C’è una tendenza generale nella maggior parte degli studi sull’uomo a dimostrare che l’integrazione di leucina è in grado di promuovere gli effetti di risparmio proteico, principalmente a causa dell’inibizione della degradazione proteica . Sebbene il declino della proteolisi sembrasse verificarsi in diversi studi, non vi è consenso su una relazione dose-risposta. Ad esempio, Tessari et al. (1987) ha infuso una soluzione AA in soggetti (stato PA) per 180 min, raggiungendo livelli plasmatici di leucina di 0,2 mm e non sono stati trovati effetti sulla soppressione della proteolisi endogena, mentre Castellino et al., (1987) ha infuso una soluzione AA (soggetti nello stato PA) che ha reso una concentrazione plasmatica di leucina di 0,28 mm per un periodo di 180 min e ha dimostrato che il flusso endogeno di leucina (un indicatore di proteolisi) è stato ridotto del 41,8% rispetto al periodo basale. Queste differenze possono essere correlate a diverse metodologie utilizzate per analizzare la degradazione delle proteine, come suggerito da Matthews (2005) o anche correlate a forme differenziali di somministrazione di leucina/AA in questi studi, una limitazione osservata anche negli studi che studiano la sintesi proteica del muscolo scheletrico.,

Come indicato sopra, non vi è consenso su una relazione dose-risposta negli studi sull’uomo relativi alla supplementazione di leucina e alla proteolisi del muscolo scheletrico. Tuttavia, uno studio condotto da Sherwin (1978) ha dimostrato che i soggetti obesi sottoposti a 3 giorni di digiuno presentavano livelli basali di leucina quasi raddoppiati (0,22 mm) rispetto ai soggetti controllati nel periodo PA, una concentrazione di leucina normalmente in grado di stimolare al massimo la sintesi proteica del muscolo scheletrico nel periodo PP, in condizioni normali., In questo studio, l’infusione di leucina ha aumentato la concentrazione plasmatica di leucina nel 68% sopra i soggetti controllati dopo due ore di infusione e nel 124% sopra i soggetti controllati dopo 12 ore (0,81 mm), alla stessa velocità di infusione. Questa infusione acuta di leucina (giorno 4 di digiuno) era ancora in grado di migliorare il bilancio azotato, tornando ai livelli precedenti il giorno dopo l’infusione. Questi risultati suggeriscono che il set point del metabolismo del turnover proteico correlato alla concentrazione di leucina infusa era regolato in questi soggetti., In questo studio, la degradazione delle proteine non è stata inibita dall’infusione di leucina (misurata dal rilascio di 3-metil-istidina), ma il bilancio azotato è stato migliorato del 23% dopo 12 ore di infusione di leucina. Un recente studio condotto da Bohé et al. (2001) , ha indicato che nell’uomo, infondendo una soluzione composta da AA miste in una velocità che rendeva una concentrazione plasmatica di leucina di 0,4 mm, era in grado di stimolare la sintesi proteica per sole due ore, tornando agli stati basali dopo questo periodo di tempo., Pertanto, è possibile che l’inibizione della degradazione del muscolo scheletrico possa anche contribuire alla risposta di risparmio di azoto durante le 12 ore di infusione di leucina, almeno nei tessuti non muscolari.

Molto recentemente, un interessante studio fatto da Katsanos et al. (2006) , ha confrontato, nei soggetti giovani e anziani, il consumo di una soluzione orale composta da EAA contenente una concentrazione di leucina del 26% (che conteneva valori di leucina simili riscontrati nelle proteine del siero di latte) contro il consumo di una soluzione di EAA arricchita con leucina 41%, sul metabolismo delle proteine del muscolo scheletrico., Hanno osservato che nei soggetti giovani, la supplementazione di leucina a basse dosi (26%) era in grado di aumentare la sintesi proteica del muscolo scheletrico, mentre nei soggetti anziani non è stato osservato alcun effetto (sebbene in entrambi i gruppi, livelli plasmatici simili di leucina siano stati raggiunti ~0,45 mm)., Tuttavia, quando una miscela contenente un’alta concentrazione di leucina (41%) è stata integrata, il gruppo anziano ha aumentato la sintesi proteica del muscolo scheletrico a valori comparabili osservati nei soggetti giovani, ripristinando la risposta nutrizionale difettosa osservata in una bassa dose integrata di leucina (anche se ancora una volta, in entrambi i gruppi, livelli plasmatici simili di leucina sono stati raggiunti ~0,65 mm). È importante sottolineare che solo i soggetti anziani integrati con la soluzione di leucina arricchita al 41% presentavano una forte tendenza ad inibire la degradazione delle proteine., È possibile che negli anziani, una dose più alta di integrazione di leucina sia in grado di inibire ancora di più la degradazione delle proteine muscolari, ma questa ipotesi non è stata ancora testata.

Riassumendo, negli studi sull’uomo, l’integrazione di leucina induce chiaramente un’inibizione della proteolisi del muscolo scheletrico e ci sono alcuni risultati scarsi che suggeriscono che la concentrazione di leucina in grado di diminuire la degradazione proteica può essere maggiore di quella in grado di stimolare al massimo la sintesi proteica, specialmente in condizioni atrofiche.