Proteine di membrana integrali
Le proteine di membrana integrali (IMP) fungono da gateway per le cellule. Tutte le cellule e gli organelli sono racchiusi in un doppio strato lipidico impermeabile e gli IMP che studiamo sono incorporati in queste membrane. Sono le vie di ingresso e di uscita per molti ioni, nutrienti, prodotti di scarto, ormoni, farmaci e grandi molecole come proteine e DNA. Sono anche responsabili di gran parte della comunicazione tra le cellule e il loro ambiente., Le cellule possono produrre un’enorme varietà di queste proteine, circa il 30% dei geni nel genoma umano codificano per le proteine di membrana, eppure sappiamo relativamente poco di queste molecole.
Le proteine di membrana sono purtroppo notoriamente difficili da maneggiare e studiare poiché sono progettate per sedersi all’interno dell’ambiente idrofobo del doppio strato lipidico. Tendono ad essere instabili quando vengono estratti dal loro ambiente nativo e dobbiamo aggiungere detergenti per coprire la superficie idrofoba., Per comprendere e controllare la funzione di queste proteine è essenziale avere informazioni sulla loro struttura tridimensionale, che di solito è ottenuta dalla cristallografia a raggi X. Tuttavia la difficoltà di maneggiare queste proteine ha reso difficile risolvere le strutture, e ad oggi ci sono meno di 300 strutture di proteine di membrana conosciute, meno dello 0,5% di tutte le strutture conosciute. Per gli eucarioti superiori la storia è ancora più dura, con solo 20 strutture di folletti umani e meno di 50 FOLLETTI di mammiferi risolti., Le proteine di membrana sono quindi una delle più importanti frontiere rimanenti della ricerca sulla biologia strutturale. Alla SGC stiamo ora applicando i nostri metodi high-throughput all’avanguardia per superare i colli di bottiglia nella ricerca sulle proteine di membrana, in modo da poter fornire in modo affidabile campioni di proteine di membrana pure e strutture di queste molecole affascinanti e clinicamente critiche.
Importanza medica
L’importanza medica di questa enorme famiglia di proteine non può essere sopravvalutata., Le mutazioni nelle proteine di membrana sono coinvolte in molte malattie comuni, tra cui le malattie cardiache, dove i canali ionici malfunzionanti sono spesso implicati. I farmaci mirati ai canali del calcio possono controllare problemi come l’ipertensione e l’angina. Le proteine di membrana sono coinvolte nel cancro, dove errori nelle vie di segnalazione possono portare alla divisione delle cellule fuori controllo. Spesso specifiche proteine di membrana sono sovraprodotte nelle cellule tumorali e sono quindi bersagli per la terapia farmacologica. Le malattie del cervello come l’emicrania, la depressione e l’Alzheimer sono tutte legate a problemi con trasportatori e canali., La fibrosi cistica è causata da mutazioni nel gene del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) che codifica un canale ionico cloruro.
Poiché molte proteine di membrana siedono sulla superficie delle cellule, sono prontamente disponibili per i farmaci a piccole molecole che circolano nel sangue. Non sorprende quindi che oltre il 50% dei farmaci di piccole molecole si leghino alle proteine di membrana. I recettori e i canali accoppiati alla proteina G sono particolarmente importanti a questo riguardo, ma i trasportatori ABC e i portatori di soluto sono anche obiettivi per la terapia farmacologica., La nostra comprensione di molte altre malattie e la nostra capacità di trattare queste malattie trarrebbero grande beneficio da informazioni più strutturali e funzionali sulle proteine coinvolte. Speriamo che risolvendo le strutture di queste proteine, comprendendo la biochimica sottostante e le interazioni con substrati e inibitori, possiamo fornire trattamenti più efficaci per molte malattie.
SGC e proteine di membrana integrali
SGC ha una vasta esperienza nella risoluzione di strutture di proteine umane solubili utilizzando sistemi altamente efficienti e ad alto rendimento., Negli ultimi due anni abbiamo adattato questi metodi per risolvere le strutture per le proteine di membrana umane. Abbiamo esaminato 186 proteine di membrana umane provenienti da diverse famiglie, selezionando una serie di costrutti per ogni proteina, identificando detergenti adatti per la purificazione e quindi scalando il purificaiton e cristallizzando queste proteine. Abbiamo cristallizzato 3 proteine di membrana e risolto la nostra prima struttura, un processo che ha richiesto meno di due anni dal primo clone alla struttura.,
Abbiamo risolto la prima struttura di un trasportatore ABC umano, una classe di proteine che sono coinvolte nel trasporto di piccole molecole, nella resistenza multi-farmaco e in malattie come la fibrosi cistica e il diabete. Il nostro primo obiettivo di successo è il trasportatore mitocondriale umano ABC, ABCB10, che è incorporato nella membrana interna dei mitocondri. ABCB10 è sovraespresso durante la differenziazione eritroide, il processo che forma i globuli rossi. è sovraespresso nel midollo osseo, nel cuore e nel fegato., Ora ci sono prove che quando l’espressione ABCB10 è ridotta nelle cellule, sono più suscettibili allo stress ossidativo e che ABCB10 può essere coinvolto nella protezione del cuore durante un attacco di cuore.
Tecnologie per lo studio di IMPs
Stiamo sviluppando metodi generici che consentono la determinazione ad alto rendimento delle strutture delle proteine di membrana umane. Abbiamo selezionato il sistema di espressione delle cellule baculovirus / insetto che fornisce una composizione lipidica vicina a quella delle cellule umane ed è una piattaforma ad alta produttività comprovata., Per ogni proteina bersaglio generiamo una serie di costrutti di lunghezza variabile e diversi tag di affinità, incluso il gene a lunghezza intera e una serie di troncamenti per rimuovere le regioni potenzialmente disordinate. Uno schermo di espressione ad alto rendimento è usato per identificare le proteine che possono essere usate per purificare le quantità di milligrammo di IMP per cristallizzazione. Ogni proteina viene inizialmente purificata in detersivo dodecil maltoside (DDM) e successivamente viene sottoposta a screening per la stabilità in una serie di detergenti diversi per identificare le condizioni ottimali per la stabilità e la cristallizzazione.,
Abbiamo stabilito metodi per la cristallizzazione nanodrop ad alto rendimento e la manipolazione di fragili cristalli proteici di membrana. Abbiamo sviluppato sistemi efficienti per lo screening dei cristalli proteici di membrana per la qualità della diffrazione come metodo per l’ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione. Abbiamo anche ottimizzato la nostra raccolta di dati e l’analisi dei dati di diffrazione utilizzando intense linee di luce a microfocus di sincrotrone, disponibili presso risorse come Diamond Light Source Ltd, nell’Oxfordshire., Laddove possibile la cristallizzazione viene eseguita con leganti e inibitori legati per catturare una singola conformazione nativa e fornire informazioni chiave sulla funzione e sulla progettazione del farmaco. Abbiamo anche in programma di generare frammenti di anticorpi contro le nostre proteine purificate da utilizzare come reagenti di affinità e aiuti alla cristallizzazione.
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