Gli anticorpi sono immunoglobuline (Ig) glicoproteine prodotte dalle plasmacellule (cellule B) in risposta a molecole antigeniche estranee (immunogeni). La funzione primaria degli anticorpi è quella di legarsi specificamente a questi antigeni estranei per disabilitarli e / o contrassegnarli per la distruzione da parte del sistema immunitario, proteggendo così l’ospite dall’infezione. Esistono diverse classi di anticorpi., La prima parte di questo riassunto si concentra sugli anticorpi convenzionali a grandezza naturale, gli anticorpi della classe IgG e IgM, che sono pesantemente utilizzati in una moltitudine di applicazioni biomediche di ricerca, diagnostica e terapeutica.
L’unità di base di un anticorpo convenzionale è un’unità di quattro polipeptidi costituita da due catene pesanti identiche e due catene leggere identiche tenute insieme da legami disolfuro. Le catene leggere sono più corte, con pesi molecolari inferiori rispetto alle catene pesanti., La forma generale di un anticorpo è una Y, con una cerniera flessibile (interdominio) regione al centro della Y. La flessibilità della regione cerniera interdominio è importante per il legame bivalente di un anticorpo , permettendo le due tasche di legame di interagire con i siti antigenici a distanze variabili. Ogni catena polipeptidica ha una regione costante, che non varia significativamente tra gli anticorpi, e una regione variabile, che è specifica per ogni particolare anticorpo. La notazione comune per la regione variabile della catena leggera è VL e per la regione costante della catena leggera è CL (Figura 1)., La notazione è simile per la variabile della catena pesante (VH) e le regioni costanti (CH) con CH1, CH2 e CH3 che denotano i diversi domini della regione costante della catena pesante. I carboidrati sono normalmente attaccati ai domini CH2 delle catene pesanti. La regione frammento cristallizzabile (Fc) contiene solo regioni costanti dalle catene pesanti (CH), ma la regione frammento antigene-binding (Fab) comprende sia un dominio costante e domini variabili di entrambe le catene pesanti e leggeri (VH e CL). La regione variabile frammento regione FV contiene solo i due domini variabili (Figura 1)., Vedere anticorpo di topo per la discussione sugli isotipi di immunoglobuline, sottoclassi e il numero di domini di immunoglobuline.
Ogni anticorpo completo ha due tasche antigene-leganti, situate nelle regioni di FV e può legarsi a due antigeni (legame bivalente)., Tuttavia, se i due antigeni sono troppo vicini (≤3 nm) o troppo distanti (≥29 nm), l’anticorpo può legarsi a un solo antigene (legame monovalente). C’è un cambiamento significativo di affinità tra binding monovalenti e bivalenti con un cambiamento di 1.500 volte nei valori Kd .
La struttura degli anticorpi specifici è disponibile dal Database degli anticorpi strutturali (SAbDab), un database curato di strutture anticorpali pubblicamente disponibili, nonché strumenti di modellazione strutturale, che viene aggiornato settimanalmente dalla Protein Data Bank (PDB) .,
Gli anticorpi convenzionali a grandezza naturale sono stati utilizzati nella ricerca per il rilevamento di proteine tramite analisi Western blot , immunoistochimica e saggi immunoassorbenti enzimatici (ELISA) per decenni. Anticorpi full-size sono stati sviluppati anche per applicazioni diagnostiche come test di gravidanza e rilevamento di batteri e virus nel sangue, come un ELISA che rileva l’HIV. Inoltre, gli anticorpi convenzionali a grandezza naturale sono usati comunemente nella terapia delle malattie., Ad esempio, Infliximab è un anticorpo di molti disponibili che riconoscono il fattore di necrosi tumorale alfa (TNFa) ed è usato nel trattamento della malattia di Crohn e dell’artrite reumatoide . Trastuzumab, o Herceptin, è un anticorpo che si lega al recettore del fattore di crescita epidermico 2 e viene utilizzato nel trattamento del carcinoma mammario metastatico . Esistono anche diverse terapie a base di anticorpi, tra cui Muromonab, somministrate a pazienti sottoposti a trapianto per prevenire il rigetto allotrapianto.,
Sebbene gli anticorpi full-size convenzionali possano entrambi essere utilizzati per applicazioni terapeutiche, ci sono vantaggi e svantaggi nell’utilizzo dell’anticorpo completo. Un importante vantaggio degli anticorpi convenzionali è il fatto che la regione Fc impegna la risposta immunitaria del corpo e può indirizzare gli antigeni legati alla distruzione. Questa regione Fc può anche essere uno svantaggio in alcune applicazioni cliniche perché la risposta immunitaria che suscita in genere può essere dannosa per la salute del paziente., Inoltre, gli anticorpi full-size non possono penetrare bene in alcuni tessuti a causa della loro dimensione relativamente grande . In alcuni casi, quando si utilizzano anticorpi full-size per applicazioni diagnostiche il dominio Fc può causare un legame significativo non specifico, che può compromettere le applicazioni di rilevamento.
Per molte applicazioni sono preferibili frammenti di anticorpi. I frammenti di anticorpi possono essere prodotti attraverso meccanismi chimici o genetici., La frammentazione chimica utilizza agenti riducenti per rompere i legami disolfuro all’interno della regione della cerniera e la digestione dell’anticorpo con proteasi tra cui pepsina, papaina e ficina. La costruzione genetica dei frammenti offre la capacità di creare una moltitudine di molecole contenenti frammenti, ognuna con caratteristiche di legame e funzionali uniche.
La digestione chimica e proteasi di anticorpi IgG o IgM a grandezza naturale produce frammenti di legame con l’antigene (Fab; Figura 1) e frammenti Fc, composti solo dalla catena pesante CH2 e dai domini CH3., I metodi biochimici di generazione dei frammenti dell’anticorpo producono gli strumenti utili per le applicazioni diagnostiche e terapeutiche, ma è abbastanza laborioso e richiede una grande quantità di materiale di partenza dell’anticorpo.
I frammenti legati all’antigene prodotti dalla digestione biochimica includono Fab, (Fab’)2, Fab’ e FV, tutti privi della regione Fc. I frammenti monovalenti F(ab) hanno un sito di legame con l’antigene, mentre i frammenti bivalenti (Fab’)2 hanno due regioni di legame con l’antigene collegate da legami disolfuro., Due singoli frammenti di F (ab) vengono prodotti quando un anticorpo a grandezza naturale viene digerito con l’enzima papaina. Un frammento F (ab’) 2, che conserva una parte della regione della cerniera, è prodotto dalla digestione della pepsina di anticorpi IgG o IgM. La riduzione dei frammenti F(ab’)2 produce 2 frammenti monovalenti Fab’, che hanno un gruppo sulfidrilico libero utile per la coniugazione con altre molecole. I frammenti FV sono il più piccolo frammento ottenuto dalla scissione enzimatica degli anticorpi di classe IgG e IgM (Figura 1)., I frammenti FV hanno il sito di legame dell’antigene costituito dalle regioni VH e VL, ma mancano delle regioni costanti delle regioni Fab (CH1 e CL) (Figura 1, pannello di destra). Il VH e VL sono tenuti insieme in frammenti FV da interazioni non covalenti. I frammenti possono essere generati attraverso kit disponibili in commercio, ad esempio il kit di frammentazione F(ab’)2 di G-Biosciences .,
consentono la produzione di frammenti variabili a catena singola (scFv), che sono frammenti di tipo FV costituiti dai domini VH e VL collegati da un peptide linker flessibile ingegnerizzato (Figura 1) . La manipolazione dell’orientamento dei domini V e della lunghezza del linker crea diverse forme di molecole FV . Quando il linker è lungo almeno 12 residui, i frammenti scFv sono principalmente monomerici (come mostrato in Figura 1) ., I linker che sono residui 3-11 producono molecole scFv lunghe che non sono in grado di piegarsi in un dominio FV funzionale. Queste molecole si associano con una seconda molecola scFv, che crea un diabody bivalente . Se la lunghezza del linker è inferiore a tre residui, le molecole di scFv si associano in triabodie o tetracorpi . Ad esempio, Tao Y et al hanno generato un diabody VH-VL con un linker GGGGS corto e scFv con un linker GTTAASGSSGSSSGA lungo ., Gli SCFV multivalenti possiedono una maggiore affinità di legame funzionale con i loro antigeni bersaglio come risultato di avere altri due siti di legame dell’antigene bersaglio, che riduce la off-rate del frammento anticorpale . I minibodies sono proteine di fusione scFv-CH3 che si assemblano in dimeri bivalenti . Piccoli frammenti scFv con due diversi domini variabili possono essere generati per produrre frammenti bispecifici bis-scFv in grado di legare contemporaneamente due epitopi diversi . I metodi genetici sono anche usati per creare dimeri Fab bispecifici (Fab2) e trimeri Fab trispecifici (Fab3) ., Questi frammenti anticorpali sono in grado di legare contemporaneamente 2 o 3 antigeni diversi, rispettivamente.
Oltre agli anticorpi convenzionali, le specie di camelidi e squali (squalidae) contengono un sottoinsieme di anticorpi particolari a catena pesante (hcAb) composti esclusivamente da omodimeri a catena pesante privi di catene leggere . Le porzioni Fab di questi anticorpi, chiamati VHH nei camelidi e VNAR negli squali, sono le più piccole regioni antigene-leganti naturalmente trovato ., I nanobodies sono domini ricombinanti derivati da VHH in grado di legare gli antigeni, spesso clonati da librerie di fagi VHH come quelle contro le proteine di betacoronarivus S. La loro termodinamica vincolante e le strutture sono state studiate (e di riferimento in esso)., Nanobodies sono molto stabili e possono essere facilmente prodotto in grandi quantità utilizzando semplici comuni di espressione della proteina, quali sistemi di batteri (funzionale convenzionale full-size anticorpi sono difficili da esprimere correttamente in un sistema batterico), rappresentando così uno strumento promettente per la ricerca e per scopi terapeutici, in particolare nelle aree di super-risoluzione microscopia, spettrometria di massa, e la degradazione delle proteine bersaglio . I nanobodies possono anche essere consegnati all’interno delle cellule viventi attraverso coniugati con peptidi , o in vivo , o espressi direttamente in vivo e riconoscono i suoi obiettivi in vivo., I nanobodies contro RFP o GFP, quando coniugati con coloranti Atto di gran lunga rosso, hanno raggiunto un ingrandimento di 118 volte dei segnali fluorescenti su GFP o RFP e sono stati utilizzati per generare connettività neuronale del topo di tutto il corpo . Sono stati anche usati per stabilizzare lo stato attivo delle proteine negli studi strutturali . Un sistema di espressione con più nanobodies concatenati contro diversi ceppi influenzali è in fase di esame come mezzo per generare un vaccino antinfluenzale universale ., I nanobodies secondari anti-IgG ricombinanti hanno un grande potenziale per sostituire gli anticorpi secondari policlonali ampiamente utilizzati prodotti utilizzando animali .
I nanobodies hanno la capacità unica di attraversare la barriera emato-encefalica; tuttavia, i nanobodies tendono ad essere elaborati e eliminati molto rapidamente dal corpo . I nanobodies possono essere utilizzati per metodi come l’immunoprecipitazione , ad esempio RFP-Trap MA di Chromotek, o accoppiati a proteine fluorescenti per tracciare bersagli intracellulari in cellule vive in tempo reale .,
Circa il 10% delle immunoglobuline bovine contiene una terza regione che determina la complementarità della catena pesante (CDR 3H) insolitamente lunga con un gran numero di residui di cisteina . Queste cisteine si accoppiano per formare legami disolfuro che portano a una struttura simile a gambo e manopola nel dominio di legame dell’antigene . Questo dominio CDR3H eccezionalmente lungo con il gambo lungo contribuisce alla diversità della specificità dell’anticorpo bovino.,
Gli intrabodies, o anticorpi intracellulari, si riferiscono agli anticorpi o ai loro frammenti (di solito di design scFv) espressi direttamente all’interno delle cellule o negli animali in vivo attraverso un vettore di espressione. Ad esempio, Dong JX et al hanno sviluppato diversi nanobodies contro proteine neuronali per l’espressione intracellulare come intrabodies . Una considerazione/avvertimento importante è l’ambiente intracellulare riducente che diminuisce l’affinità di un anticorpo o di un frammento dell’anticorpo di cui legare con l’antigene dipende dai legami del disolfuro di intradomain., Un’altra considerazione è che gli intracorpi tendono ad aggregarsi. Kabayama H et al hanno progettato intrabodies con una carica engativa netta anche al pH citoplasmatico più basso 6.6 per generare anticorpi citoplasmatici ultra-stabili . Gli intracorpi sono usati come alternative agli inibitori farmacologici per colpire specifici partecipanti endocitari., Per le istanze, l’espressione di un frammento variabile a catena singola (scFv) derivato dall’anticorpo monoclonale 3B12A contro il segnale di esportazione nucleare TDP-43 nelle cellule HEK293A o dopo l’elettroporazione in utero del suo vettore di espressione ha promosso la proteolisi degli aggregati TDP-43 in cellule coltivate e cervello di topo embrionale ., Il rilascio mediato dal virus nel sistema nervoso di un anticorpo scFv contro il motivo di riconoscimento dell’RNA 1 di TDP-43 ha ridotto la microgliosi in un modello murino di neuroinfiammazione acuta e deterioramento cognitivo mitigato, difetti motori, proteinopatia TDP-43 e neuroinfiammazione in topi transgenici che esprimono mutazioni TDP-43 legate alla sclerosi laterale amiotrofica . Il potenziale degli intracorpi come modalità terapeutica deve ancora emergere.
Un frammento di anticorpo può anche essere collegato con un tag di importazione delle cellule, come un tag IPTD , per facilitare il suo ingresso nelle cellule.,
I frammenti dell’anticorpo offrono determinati vantaggi sopra un anticorpo full-size per alcune applicazioni. Questo argomento è stato recensito da Nelson . Un vantaggio dei frammenti rispetto agli anticorpi full-size è che i frammenti anticorpali sono più piccoli degli anticorpi convenzionali e generalmente mancano di glicosilazione, consentendo la loro produzione in sistemi di espressione procariotica, che forniscono risparmi di tempo e costi., Inoltre, i frammenti sono abbastanza piccoli da infiltrarsi in alcuni tessuti che gli anticorpi a grandezza naturale non sono in grado di penetrare, il che aiuta in molte procedure terapeutiche e immunoistochimiche . Inoltre, la mancanza di dominio Fc è un vantaggio sostanziale per gli anticorpi primari utilizzati in immunoistochimica e altre applicazioni di rilevamento perché hanno notevolmente ridotto il legame non specifico al recettore Fc. Uno scFv che è comunemente usato nella diagnostica è l’anticorpo NC10 contro la neuraminidasi influenzale., L’anticorpo MOC-31 contro la molecola Ep-CAM di adesione delle cellule epiteliali è un scFv comunemente usato dentro come terapia del cancro. Diabodies, triabodies e tetrabodies hanno potenziali usi in applicazioni come la radioimmunoterapia e l’imaging diagnostico in vivo . Tuttavia, i frammenti che mancano del dominio Fc sono degradati nel corpo molto più rapidamente degli anticorpi convenzionali e non sono in grado di suscitare processi citotossici mediati da Fc a meno che non siano coniugati a una porzione effettrice , il che richiede un’ulteriore ottimizzazione per le terapie basate su frammenti anticorpali.,
Sebbene i vari frammenti dell’anticorpo offrano determinati vantaggi, non sono comunemente utilizzati negli esperimenti. Negli oltre 60.000 articoli curati manualmente da Labome solo pochi articoli hanno citato applicazioni di frammenti di anticorpi Fab. I frammenti anticorpali Roche anti-digoxigenin Fab (11093274910) e anti-fluoresceina Fab ( 11426338910) sono generati nelle pecore e prodotti attraverso la digestione con papaina. I frammenti Fab anti-digoxigenin sono stati utilizzati per ibridazioni in situ poiché le sonde a RNA sono marcate con digoxigenina ., Sono stati anche utilizzati per eseguire l’analisi di piegatura delle proteine per studiare il processo di piegatura di una singola molecola di calmodulina attraverso la spettroscopia di forza a molecola singola . F (ab) frammenti di anticorpi secondari anti-mouse sono spesso utilizzati per bloccare Ig endogeni del mouse durante immunosociazione, per esempio, AffiniPure Fab frammento Asino antimouse IgG da Biozol (JIM-715-007-003).,
Invitrogen Alexa Fluor 546 di capra coniugato anti-IgG di coniglio F(ab’)2 frammento è stato utilizzato per eseguire immunoistochimica per indagare il ruolo di sFLT-1 nel mantenimento della avascolare fotorecettori livello in modelli murini e Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2 frammento di coniglio anti-goat IgG (H+L) è stato utilizzato nell’immunoistochimica per indagare il meccanismo di punta link rigenerazione delle cellule ciliate uditive .,
I recettori Fc (FCR) sono molecole espresse principalmente su / in cellule immunitarie innate, che riconoscono e legano il dominio Fc degli anticorpi e quindi iniziano una risposta immunitaria basata sulle cellule. Le diverse funzioni degli FCR riflettono l’ampia gamma di ruoli protettivi o modulanti degli anticorpi, tra cui la mediazione della neutralizzazione e della clearance dei substrati mirati, nonché la programmazione dell’immunità adattativa ., Le funzioni biologiche delle FCR sono regolate da motivi di attivazione a base di tirosina immunorecettori (ITAMS) e motivi inibitori a base di tirosina immunorecettori (ITIMs), che fungono rispettivamente da interfaccia del recettore con le vie di segnalazione attivanti e inibitorie. Pertanto, la segnalazione da parte di ITAMS può suscitare attivazione cellulare, fagocitosi ed endocitosi, mentre la segnalazione da parte di ITIMs ha un effetto inibitorio sull’attivazione cellulare . Le FCR sono state descritte per tutte le classi di immunoglobuline e alcune di esse sono discusse di seguito.,
Questa famiglia include FcyRI, FcyRII, FcyRIII e le loro isoforme. Sono responsabili della citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC) e della fagocitosi cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ACDP) .
Un altro recettore che lega le IgG è il recettore Fc neonatale (FcRn), che è coinvolto nel trasferimento dell’immunità umorale passiva da una madre al suo feto. FcRn protegge anche le IgG dalla degradazione in vivo, spiegando la loro lunga emivita nel siero ., Questo fenomeno ha portato allo sviluppo di anticorpi terapeutici migliori introducendo alterazioni nella regione Fc per promuovere l’interazione Fc-FcRn.
Includono l’FceRI ad alta affinità, che è in grado di legare le IgE monomeriche, e la lectina FceRII di tipo C a bassa affinità, che interagisce preferenzialmente con le IgE complesse. FceRI media la risposta immediata di ipersensibilità di molte reazioni allergiche stimolando la degranulazione e il rilascio di una serie di mediatori infiammatori su mastociti e basofili ., FceRII esiste sia in una forma legata alla membrana che fornisce un segnale downregulating per la sintesi di IgE, così come i frammenti solubili che generano un upregulation opposto sulla sintesi di IgE . Il suo ruolo nella transcitosi dei complessi IgE-allergenici nelle vie aeree umane e nell’epitelio intestinale è attivamente studiato come potenziale bersaglio per l’infiammazione allergica delle vie aeree a causa di allergie alimentari .
L’unico membro del gruppo dei recettori IgA, FcaRI, è espresso solo nelle cellule del lignaggio mieloide., Svolge un ruolo nelle risposte pro-e anti-infiammatorie a seconda dello stato del legame IgA. Mentre il legame delle IGA secretorie (SIgA) presenti nei siti della mucosa ha effetti antinfiammatori, inclusa la prevenzione dell’invasione dei patogeni, il legame delle IgA sieriche porta a risposte infiammatorie. FcaRI regola anche la vitalità dei neutrofili a seconda del microambiente infiammatorio .
TRIM21 può essere distinto da altri FCR in quanto mostra un’ampia specificità anticorpale. Può legare IgG, IgM e IgA . È anche espresso dalle cellule della maggior parte dei lignaggi istogenici ., TRIM21 partecipa all’interferenza mediata da anticorpi della replicazione virale mirando ai complessi citosolici virus-anticorpi per la degradazione proteasomica.
Il legame dei domini Fc con gli FCR può avere effetti indesiderati nei metodi analitici basati su anticorpi monoclonali come l’immunoistochimica (IHC), lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) e l’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Il legame non specifico alle FCR può introdurre rumore di fondo che può portare al rilevamento di falsi positivi., Le soluzioni per affrontare questo problema includono l’uso di (i) controlli di isotipo per gating, (ii) siero per competere ampiamente per i recettori coinvolti nel legame non specifico, o (iii) IgG purificato per bloccare specificamente i recettori Fc . Innovex Fc Receptor blocker # NB309 può essere utilizzato per bloccare sezioni di paraffina o congelate durante esperimenti IHC o IC o BD Biosciences # 553142, Miltenyi Biotec Fc receptor block per citometria a flusso. Ad esempio, Chopra S et al hanno bloccato il legame FcyR con 5 µg/ml di TruStain fcX (anti-mouse CD16/32, clone 93) da BioLegend durante la citometria a flusso e lo smistamento cellulare .,
Il Dr. Macarena Fritz Kelly di São José dos Campos, SP, Brasile, ha contribuito alla sezione sui recettori Fc a settembre, 2018.
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