La Green fluorescent protein (GFP) è una proteina presente nella medusa AequoreaVictoria che presenta fluorescenza verde quando esposta alla luce. La proteina ha 238 aminoacidi, tre di loro (numeri da 65 a 67)formano una struttura che emette luce fluorescente verde visibile. Inla medusa, la GFP interagisce con un’altra proteina, chiamata aequorina,che emette luce blu quando viene aggiunta al calcio. I biologi usano GFP per studiare le cellule in embrioni e feti durante lo sviluppoprocessi.,
I biologi usano la GFP come proteina marker. GFP può attaccare ad andmark un’altra proteina con fluorescenza, permettendo che gli scienziati vedano la presenza della proteina particolare in una struttura organica.Gfp si riferisce al gene che produce fluorescentprotein verde. Usando la tecnologia ricombinante del DNA, gli scienziati combinano il gene GFP a un altro gene che produce una proteina che vogliono studiare e quindi inseriscono il complesso in una cellula. Se la cella producesthe fluorescenza verde, gli scienziati deducono che la cella esprime thetarget gene pure., Inoltre, gli scienziati usano GFP per etichettare specificiorganelle, cellule, tessuti. Poiché il gene Gfp è ereditabile, i discendenti delle entità etichettate presentano anche fluorescenza verde.
Edmund N. Harvey, professore alla Princeton University di Princeton, New Jersey, ha avviato gli studi sulla bioluminescenza negli Stati Uniti. Nel 1921, Harvey descrisse i tessuti gialli nell’ombrello delle meduse come luminosi in condizioni particolari, come la notte o quando la medusa viene stimolata con elettricità., Nel 1955,Demorest Davenport all’Università della California a Santa Barbara, California, e Joseph Nicol al Plymouth MarineLaboratory di Plymouth, Inghilterra, usarono metodi di registrazione fotoelettrica e istologici per confermare le descrizioni di Harvey, e identificarono i materiali fluorescenti verdi nel canale marginale dell’ombrello.
Nello stesso anno, Osamu Shimomura divenne assistente di ricerca all’Università Nagoya di Nagoya, in Giappone, e cristallizzò la luciferina,un composto emettitore di luce trovato nella lucciola marina Vargulahilgendorfii., Shimomura pubblicò i suoi risultati nel 1957. Uno degli studenti di Harvey, Frank H. Johnson, ha studiato bioluminescenza all’Università di Princeton. Johnson seguì il lavoro di Shimomura e lo invitò a lavorare negli Stati Uniti, e nel 1960 Shimomura ricevette una borsa di viaggio ultraluminosa e iniziò a lavorare con Johnson. Poco dopo che Shimomura arrivò negli Stati Uniti, Johnson introdusse la bioluminescenza di Aequorea Victoria a Shimomura. Negli Stati Uniti,le meduse vivono solo sulla costa occidentale, quindi Shimomura si è recato Alfriday Harbor Laboratories dell’Università di Washington a SanJuan Island, Washington, durante l’estate del 1961., Dopo aver catturato circa 10.000 meduse, Shimomura prese gli estratti della medusa e la conservò in ghiaccio secco per riportarla a Princeton nel settembre del 1961.
A Princeton, Shimomura ei suoi colleghi hanno iniziato a purificare ilsostanza bioluminescente, e hanno scoperto che si trattava di una proteina,che hanno chiamato aequorina. Quando hanno purificato aequorin, hanno anchescoperto tracce di un’altra proteina, che ha mostrato la fluorescenza verde. Il team di Shimomura pubblicò i risultati in “Exraction, Purification, and Properties of Aequorin” nel 1962., La carta eracirca aequorin, ma ha anche descritto una proteina verde, che ha mostrato fluorescenza verde sotto la luce del sole. John W. Hasting andJames G. Morin, che più successivamente ha ricercato aequorin, ha definito la proteina fluorescente verde di proteinas nel 1971.
Shimomura si concentrò sull’aequorina, purificò la proteina, cristallizzò e chiarì la sua struttura sottostante. Ha anche studiato thepropries di GFP, e pubblicato il suo ultimo articolo su GFP nel 1979. In1981, dopo aver lasciato l’Università di Princeton per il laboratorio di biologia marina a Woods Hole, Massachusetts, Shimomura non ha più fatto ricerche sulla GFP., Dal 1979 al 1992, molti ricercatori hanno studiato vari aspetti della GFP, tra cui l’uso della risonanza magnetica nucleare per studiare gli amminoacidi della proteina, l’uso dei raggi X per studiare il suo cristallo e l’evoluzione della GFP.
Nei primi anni 1990, il biologo molecolare Douglas Prasher,presso il Marine Biology Laboratory, utilizzò la GFP per progettare sonde, atecnologia che coinvolgeva frammenti di DNA per rilevare la presenza di sequenze nucleotidiche. Prasher ha isolato il DNA complementare (cDNA)del gene Gfp e ha pubblicato la sequenza del gene nel 1992.,Dopo la pubblicazione della sequenza cDNA nel 1992, il finanziamento di Prasher da theAmerican Cancer Society di Atlanta, Georgia, è scaduto. Quando ha fatto domanda per il finanziamento dell’Istituto Nazionale della Sanità degli Stati Uniti a Bethesda, Maryland, il recensore ha sostenuto che la ricerca di Prasher mancava di contributi alla società. Poiché Prasher non ha potuto ottenere finanziamenti per sostenere ulteriormente la sua ricerca, ha lasciato il laboratorio di biologia marina per lavorare per il Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti inMassachusetts.,
Dopo la pubblicazione di Prasher nel 1992, molti scienziati hanno cercato di trasferire ed esprimere il gene Gfp in organismi diversi dai meduse utilizzando la tecnologia ricombinante del DNA, e Martin Chalfie è statoil primo che ci è riuscito. Chalfie, professore alla Columbia Universitàa New York, New York, ha studiato lo sviluppo del nematode Caenorhabditiselegans. Chalfie sentito parlare della proteina GFP in una conferenza, e ha ipotizzato che GFP potrebbe facilitare il suo studio di geneexpression in C. elegans., Il team di Chalfie ha ottenuto il cDNA del gene Gfp da Prasher e ha inserito solo la sequenza di codifica del gene Gfp prima nel batterio EscherichiaColi e poi in C. elegans. Chalfie e il suo team hanno scoperto che il gene Gfp produceva GFP senza enzimi aggiunti o substrati in entrambi gli organismi. Nel 1994, Chalfie pubblicò i suoi risultatiin “Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression”. Il rilevamento di GFP aveva bisogno solo di luce ultravioletta. Successivamente, moltii biologi hanno introdotto la GFP nei loro esperimenti per studiare la geneexpression., Satoshi Inouye e Frederick Tsuji a PrincetonUniversity hanno anche espresso Gfp in E. Coli nel 1994.
Molti scienziati hanno cercato di mutare il gene Gfp per far sì che la proteina risultante reagisse a lunghezze d’onda più ampie e emanasse colori diversi. Altrigli scienziati hanno studiato diverse proteine fluorescenti (FPs). RogerTsien, professore presso l’Università della California di San Diego, a SanDiego, California, reingegnerizzato il gene Gfp per produrre theprotein in diverse strutture. La sua squadra ha anche riprogettato altri FPS.,A causa degli sforzi di Tsien e di altri bioingegneri, GFP potrebbe non soloeshibire una fluorescenza più luminosa, ma anche rispondere a una gamma più ampia di lunghezze d’onda, oltre a emettere quasi tutti i colori, ad eccezione del rosso.Le scoperte di Tsien hanno permesso agli scienziati di etichettare più GFP colorati con diverse proteine, cellule o organelli di interesse e gli scienziati potrebbero studiare l’interazione di tali particelle. Red FP è diventatodisponibile nel 1999,quando il team di Sergey Lukyanov presso l’Istituto di Chimica bioorganica Emyakin-Ovchinnikov di Mosca, in Russia, ha scoperto che alcuni coralli contenevano la proteina fluorescente rossa, chiamata DsRed., Altri laboratori hanno sviluppato fluorescentisensori per calcio, proteasi e altre molecole biologiche. Da allora, gli scienziati hanno segnalato più di 150 distinte proteine simili a GFP in molte specie.
Poiché la GFP non interferisce con i processi biologici quando viene utilizzatain vivo, i biologi lo usano per studiare come si sviluppano gli organismi.Ad esempio, dopo il 1994, Chalfie ei suoi colleghi hanno applicato la GFP inlo studio dello sviluppo dei neuroni di C. elegans., In un 2002paper, Chalfie ei suoi colleghi descrivono come prima etichettato gene aspecifico coinvolto nella percezione tattile nelle cellule neuronali withGFP, e poi osservato la quantità di fluorescenza emessa da thosecells. Poiché le cellule mutanti producevano meno o più GFP rispetto alle normali cellule, la quantità anormale di produzione di fluorescenza indicava lo sviluppo anormale dei mutanti. Da allora, questo campo di ricercasi è esteso a molti altri organismi, tra cui moscerini della frutta, topi e pesci zebra.,
Il 10 dicembre 2008, la Royal Swedish Academy of Science academyha conferito il Premio Noble in Chimica a Tsien, Chalfie e Shimomura per le loro scoperte sulla GFP.
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