Antistoffer er immunglobulin (Ig) glycoproteins produsert av plasma celler (B-celler) i respons til utenlandske antigene molekyler (immunogens). Den primære funksjon av antistoffer er å binde seg spesifikt til disse fremmede antigener for å deaktivere dem og/eller merke dem for ødeleggelse av immunforsvaret, og dermed beskytter verten fra infeksjon. Det er flere klasser av antistoffer., Den første delen av denne oppsummeringen fokuserer på vanlig full-size-antistoffer, IgG-og IgM klasse antistoffer, som er sterkt utnyttet i et mangfold av forskning, diagnostiske og terapeutiske biomedisinske applikasjoner.
Den grunnleggende enhet av en konvensjonell antistoff er en fire polypeptid enhet som består av to identiske tunge kjeder og to identiske lette kjeder som holdes sammen av disulfide obligasjoner. Den lette kjeder er kortere, med lavere molekylvekt enn den tunge kjettinger., Den generelle formen av et antistoff er et Y, med en fleksibel hengsel (interdomain) område i sentrum av Y. fleksibilitet av interdomain hengsel regionen er viktig for den bivalente binding av et antistoff , slik at de to bindende lommer til å samhandle med antigene nettsteder på variable avstander. Hver polypeptid-kjeden har en konstant regionen, som ikke varierer betydelig mellom antistoffer, og en variabel regionen, som er spesifikk for hver bestemt antistoff. Den vanlige notasjonen for lett kjede variabel regionen er VL og for lett kjede konstant regionen er CL (Figur 1)., Notasjonen er lik for tung kjede variabel (VH) og konstant regioner (CH) med CH1, CH2 og CH3 betegner de ulike konstant regionen domener av tung kjede. Karbohydrater er normalt knyttet til CH2 domener av tunge kjettinger. Fragment crystallizable (Fc) området inneholder bare konstant regioner fra tunge kjettinger (CH), men fragment antigen-bindende regionen (Fab) inneholder både en konstant domene og variabel domener av både tunge og lette kjeder (VH og CL). Fragment variabel regionen FV regionen inneholder bare to variable domener (Figur 1)., Se mus antistoff for diskusjon på immunglobulin isotypes, underklasser, og antall immunglobulin domener.
Hver hele antistoff har to antigen-bindende lommer, som ligger i FV regioner, og kan binde seg til to antigener (bivalent bindende)., Imidlertid, hvis de to antigener er for nær (≤3 nm), eller for langt fra hverandre (≥29nm), antistoff kan bare binde seg til et antigen (monovalent bindende) . Det er en betydelig affinitet endre mellom monovalent og bivalent bindinger med et 1500-brett endring i Kd-verdier .
strukturen av spesifikke antistoffer er tilgjengelig fra Strukturelle Antistoff Database (SAbDab), kuratert database av offentlig tilgjengelig antistoff strukturer, samt strukturell modellering verktøy, som oppdateres ukentlig fra Protein Data Bank (PDB) .,
Konvensjonelle full størrelse antistoffer har blitt benyttet i forskning om protein deteksjon via Western blot analyser , immunohistochemistry , og enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) i flere tiår. Full-size-antistoffer har også blitt utviklet for diagnostiske anvendelser som for eksempel graviditet tester og påvisning av bakterier og virus i blodet, slik som ELISA som oppdager HIV. I tillegg til konvensjonelle full størrelse antistoffer er ofte benyttet i sykdom therapeutics., For eksempel, Infliximab er et antistoff av mange som gjenkjenner tumor nekrose faktor alfa (TNFa), og det er brukt i behandling av Crohns sykdom og revmatoid artritt . Trastuzumab, eller Herceptin, er et antistoff som binder seg til epidermal vekstfaktor reseptor 2 og brukes i behandling av metastatisk brystkreft . Det er også flere antistoff-basert terapi, inkludert Muromonab , gitt til transplantasjon mottakere for å hindre allograft avvisning.,
selv Om konvensjonelle full-size-antistoffer kan både brukes til terapeutiske programmer, det er fordeler og ulemper med å bruke hele antistoff. En viktig fordel med konvensjonelle antistoffer er det faktum Fc regionen engasjerer kroppens immunforsvar, og kan målrette bundet antigener for ødeleggelse. Denne Fc regionen kan også være en ulempe i noen kliniske applikasjoner fordi immunforsvaret at det vanligvis utløser kan være skadelig for pasientens helse., I tillegg, full-size-antistoffer ikke kan trenge godt inn i visse vev på grunn av deres relativt stor størrelse . I noen tilfeller, når du bruker full-størrelse antistoffer for diagnostiske anvendelser Fc domene kan føre til betydelige uspesifikk binding, noe som kan svekke deteksjon programmer.
For mange programmer antistoff fragmenter er å foretrekke. Antistoff fragmenter kan produseres gjennom kjemiske eller genetiske mekanismer., Kjemiske fragmentering benytter reduksjonsmidler til å bryte disulfide obligasjoner i hengsel regionen og fordøyelse av antistoff med proteases inkludert pepsin, papain, og ficin. Genetisk bygging av fragmenter tilbyr muligheten til å lage et mangfold av fragment som inneholder molekyler, hver med unike bindende og funksjonelle egenskaper.
Kjemisk og protease fordøyelsen av full størrelse IgG-eller IgM-antistoffer gi antigen-bindende fragmenter (Fab; Figur 1), og Fc fragmenter, som består bare av tung kjede CH2 og CH3-domener., Biokjemiske metoder for å generere antistoffer fragmenter produsere nyttig verktøy for diagnostiske og terapeutiske programmer, men det er ganske arbeidskrevende og krever en stor mengde antistoff starter materiale.
antigen-bindende fragmenter produsert av biokjemiske fordøyelsen inkluderer Fab, (Fab’)2, Fab’, og FV, alle som mangler Fc regionen. Monovalent F(ab) fragmenter har et antigen-bindende nettstedet, mens divalent (Fab’)2 fragmenter har to antigen-bindende regioner som er knyttet sammen av disulfide obligasjoner., To individuelle F(ab) fragmenter er produsert ved en full-size-antistoff er fordøyd med enzymet papain. A F(ab’)2 fragment, som beholder en del av hengslene regionen, er produsert av pepsin fordøyelsen av IgG-eller IgM-antistoffer. Reduksjon av F(ab’)2 fragmenter produserer 2 monovalent Fab’ fragmenter, som har en gratis sulfhydryl-gruppe som er nyttig for konjugasjon til andre molekyler. FV fragmenter er den minste fragment laget av enzymatisk spalting av IgG og IgM klasse antistoffer (Figur 1)., FV fragmenter har antigen-bindende nettstedet er laget av VH og VL regioner, men de mangler den konstante regioner av Fab (CH1 og CL) regioner (Figur 1, høyre panel). Den VH og VL er holdt sammen i FV fragmenter av ikke-covalent interaksjoner. Fragmentene kan være generert gjennom kommersielt tilgjengelig kits, for eksempel, F(ab’)2 Fragmentering Kit fra G-Biovitenskap .,
Genetisk engineering metoder tillate produksjon av enkelt kjede variabel fragmenter (scFv), som er FV type fragment som består av VH og VL domener som er knyttet sammen av et konstruert fleksibel linker peptid (Figur 1) . Manipulering av orientering V-domener og linker lengde skaper ulike former for FV molekyler . Når den som lenker er minst 12 rester lang, scFv fragmenter er først og fremst monomeric (som vist i Figur 1) ., Linkers som er 3-11 rester lang gi scFv molekyler som ikke er i stand til å kaste inn en funksjonell FV domene. Disse molekylene sammen med et annet scFv molekyl, noe som skaper en bivalent diabody . Hvis den som lenker lengde er mindre enn tre rester, scFv molekyler knytte til triabodies eller tetrabodies . For eksempel, Tao Y et al generert en VH-VL diabody med en kort GGGGS linker og scFv med en lang GTTAASGSSGGSSSGA linker ., Flervalente scFvs har større funksjonelle bindende affinitet til sine mål antigener som et resultat av å ha to flere target-antigen bindende områder, noe som reduserer off-pris av antistoff-fragment . Minibodies er scFv-CH3 fusion proteiner som samles inn bivalent dimers . Små scFv fragmenter med to forskjellige variable domener kan bli generert til å produsere bispecific bis-scFv fragmenter i stand til å binde to forskjellige epitopes samtidig . Genetiske metoder er også brukt til å lage bispecific Fab dimers (Fab2) og trispecific Fab trimers (Fab3) ., Disse antistoff fragmenter er i stand til samtidig bindende 2 eller 3 forskjellige antigener, henholdsvis.
I tillegg til konvensjonelle antistoffer, camelid og hai (squalidae) arter inneholder et delsett av særegne Tung Kjede Antistoffer (hcAb) utelukkende består av tung kjede homodimers mangler lys kjeder . Fab deler av disse antistoffene, som kalles VHH i camelids og VNAR i haier, er den minste antigen-bindende regioner naturlig finnes ., Nanobodies er VHH-avledet rekombinant domener i stand til å binde antigener, ofte klonet fra VHH phage biblioteker, for eksempel de som er mot betacoronarivus S proteiner . Deres bindende termodynamikk og strukturer har blitt studert ( og referanse her)., Nanobodies er veldig stabil og kan enkelt produseres i stort antall ved hjelp av vanlige enkle protein uttrykk systemer, for eksempel bakterier (funksjonell konvensjonelle full størrelse antistoffer er vanskelig å uttrykke riktig i en bakteriell system), noe som representerer en lovende verktøy for forskning og terapeutiske formål, spesielt i de områdene av super-oppløsning mikroskopi, mass spectrometry, og målrettet protein nedbrytning . Nanobodies kan også leveres inne i levende celler gjennom conjugated med peptider , eller in vivo , eller uttrykt direkte i vivo og gjenkjenne sine mål i vivo., Nanobodies mot RFP eller GFP, når conjugated med langt rødt Atto fargestoffer, oppnådd 118-gangers forstørrelse av fluorescerende signaler over GFP eller RFP, og ble brukt til å generere hele kroppen musen neuronal-tilkobling . De har også blitt brukt til å stabilisere den aktive tilstanden av proteiner i strukturelle studier . Et uttrykk system med flere sammenhengende nanobodies mot ulike influensa stammer som er undersøkt som et middel til å generere en universell influensa-vaksine ., Rekombinant anti-IgG videregående nanobodies har stort potensial til å erstatte mye brukt polyklonale sekundær antistoffer produsert ved hjelp av dyr .
Nanobodies har den unike evnen til å krysse blod-hjerne-barrieren, men nanobodies har en tendens til å bli behandlet og ryddet veldig raskt fra kroppen . Nanobodies kan brukes for metoder som immunoprecipitation, for eksempel, RFP-Felle MA fra Chromotek , eller er koblet til fluorescerende proteiner for å spore intracellulære mål i levende celler i real-time .,
Om lag 10% av storfe immunglobuliner inneholde en uvanlig lang tredje tung-kjeden gjensidighet-bestemme-regionen (CDR 3H) med et stort antall av cystein rester . Disse cysteines par å danne disulfide obligasjoner som fører til en stilk-og-knott som struktur i antigen-bindende domene . Denne usedvanlig lang CDR3H domene med lang stilk bidrar til mangfold av storfe antistoff-spesifisitet.,
Intrabodies, eller intracellulære antistoffer, se antistoffer eller deres fragmenter (vanligvis av scFv design) uttrykt direkte i celler eller dyr i vivo gjennom et uttrykk vektor. For eksempel, Dong JX et al utviklet flere nanobodies mot neuronal proteiner for intracellulære uttrykk som intrabodies . En viktig vurdering/forbeholdet er å redusere intracellulære miljø som reduserer affinitet av et antistoff eller antistoff-fragment som bindende med antigenet er avhengig av intradomain disulfide obligasjoner., En annen vurdering er at intrabodies har en tendens til å samle. Kabayama H et al designet intrabodies med en netto engative kostnad, selv ved de laveste pH i cytoplasma 6.6 til å generere ultra-stabil cytoplasma antistoffer . Intrabodies er brukt som alternativ til medikamentell hemmere for å målrette bestemte endocytic deltakere., For tilfeller, uttrykk for en enkelt-kjeden variabel fragment (scFv) avledet fra 3B12A monoklonalt antistoff mot TDP-43 kjernefysiske eksport signal i HEK293A celler eller etter i fosterlivet electroporation av uttrykket vektor fremmet protolyse av TDP-43 aggregater i celler dyrket i kultur og embryonale musen hjernen ., Virus-mediert levering i nervesystemet av en scFv antistoff mot RNA anerkjennelse motiv 1 av TDP-43 redusert microgliosis i en mus modell av akutt neuroinflammation og redusert kognitiv svikt, motoriske defekter, TDP-43 proteinopathy, og neuroinflammation i transgene mus som uttrykker TDP-43 mutasjoner knyttet til amyotrofisk lateral sklerose . Potensialet for intrabodies som en terapeutisk modalitet er fortsatt å dukke opp.
Et antistoff fragment kan også være forbundet med en celle-import-tag, eksempel en IPTD-tag , for å gjøre sin inntreden i cellene.,
Antistoff fragmenter tilbyr visse fordeler i forhold til en full-size antistoff for enkelte programmer. Dette emnet ble gjennomgått av Nelson . En fordel med fragmenter over i full størrelse antistoffer er at antistoff fragmenter er mindre enn konvensjonelle antistoffer og generelt mangel glycosylation, slik at deres produksjon i prokaryotic uttrykk systemer, som gir tid og kostnadsbesparelser., I tillegg, fragmenter er små nok til å infiltrere inn i noen vev som i full størrelse antistoffer er i stand til å trenge, som hjelpemidler i mange terapeutiske og immunohistochemical prosedyrer . Videre er det mangel på Fc domene er en betydelig fordel for primær-antistoffer som brukes i immunohistochemistry og andre deteksjon programmer fordi de har sterkt redusert, ikke-spesifikk binding til Fc-reseptor. En scFv som vanligvis brukes i diagnostikk er NC10 antistoffer mot influensa neuraminidase., De MOC-31 antistoff mot epithelial cell adhesion molecule Ep-CAM er en scFv vanligvis brukes i som en kreftbehandling. Diabodies, triabodies og tetrabodies har potensielle bruker i programmer, for eksempel radioimmunotherapy og diagnostiske in vivo avbildning . Imidlertid, fragmenter som mangler Fc domenet er dårligere i kroppen mye raskere enn konvensjonelle antistoffer , og er ikke i stand til å lokke fram Fc-mediert cytotoksiske prosesser med mindre de er konjugert til et effector fraksjonen , som krever ytterligere optimalisering for antistoff fragment-basert therapeutics.,
Selv om ulike antistoff fragmenter tilbyr visse fordeler, de blir ikke ofte brukt i eksperimenter. I mer enn 60 000 artikler manuelt kuratert av Labome bare et par artikler sitert anvendelser av antistoff Fab-fragmenter. Roche anti-digoxigenin Fab antistoff fragmenter ( 11093274910) og anti-fluorescein Fab antistoff fragmenter ( 11426338910) er generert i sau og produsert gjennom fordøyelsen med papain. Anti-digoxigenin Fab-fragmenter, ble benyttet for in situ hybridizations siden RNA-prober er merket med digoxigenin ., De ble også brukt til å utføre protein folding analyse for å studere prosessen med enkelt calmodulin-molekylet folding gjennom single-molekylet kraft spektroskopi . F(ab) fragmenter av anti-mus sekundær antistoffer er ofte brukt for å blokkere endogene musen Ig under immunostaining, for eksempel, AffiniPure Fab-fragment Esel antimouse IgG fra Biozol (JIM-715-007-003) .,
Invitrogen Alexa Fluor 546-conjugated geit anti-kanin IgG F(ab’)2-fragment ble brukt til å utføre immunohistochemistry å undersøke rollen sFLT-1 i vedlikehold av avascular photoreceptor lag i mus modeller og Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2 fragment av kanin anti-geit IgG (H+V) ble brukt i immunohistochemistry å undersøke mekanismen for tips link regenerering i auditiv hår celler .,
Fc-reseptorer (Fcr) er molekyler til uttrykk først og fremst på/i medfødt immunceller, som gjenkjenner og binder seg Fc domenet av antistoffer og dermed starte en celle-basert immunrespons. Ulike funksjoner i Fcr reflektere bredt utvalg av beskyttende eller modulerende roller av antistoffer, inkludert formidling av nøytralisering og rydding av målrettede underlag, samt programmering av adaptiv immunitet ., Den biologiske funksjoner av Fcr er regulert av immunoreceptor tyrosin-basert aktivering motiver (ITAMs) og immunoreceptor tyrosin-basert hemmende motiver (ITIMs), som fungerer som reseptoren grensesnitt med aktiverende og hemmende signaliserer trasé, henholdsvis. Dermed signaliserer ved ITAMs kan lokke fram celle aktivering, phagocytosis og endocytosis, mens signalering av ITIMs har en hemmende effekt på celle-aktivering . Fcr har blitt beskrevet for alle klasser av immunglobuliner, og noen av dem er omtalt nedenfor.,
Denne familien omfatter FcyRI, FcyRII, FcyRIII og deres isoforms. De er ansvarlig for antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC) og antistoff-avhengig celle-mediert phagocytosis (ACDP) .
en Annen reseptor som binder IgG er neonatal Fc-reseptor (FcRn), som er involvert i overføring av passiv humoral immunitet fra en mor til hennes foster. FcRn beskytter også IgG fra nedbrytning i vivo, forklarer sin lange halveringstid i serum ., Dette fenomenet har ført til utvikling av bedre terapeutiske antistoffer ved å innføre endringer i Fc regionen for å fremme Fc-FcRn samhandling.
De har høy affinitet FceRI, som er i stand til å binde seg monomeric IgE, og lav affinitet C-type lectin FceRII, som samhandler fortrinnsvis med komplekse IgE. FceRI formidler umiddelbar reaksjon av overfølsomhet for mange allergiske reaksjoner ved å stimulere degranulation og utslipp av en rekke inflammatoriske mediatorer på mastceller og basophils ., FceRII finnes både i en membran-bundet form, som gir en downregulating signal for IgE-syntese , samt løselig fragmenter som genererer en motstridende upregulation på IgE-syntese . Dens rolle i transcytosis av IgE-allergen komplekser i menneskelig luftveiene og tarmens epitel er aktivt blir etterforsket som et potensielt mål for allergisk betennelse i luftveiene som følge av matallergier .
Den eneste medlem av IgA-reseptor gruppe, FcaRI, er uttrykkes bare i cellene i myelogen avstamning., Det spiller en rolle i både pro – og anti-inflammatorisk respons avhengig av staten for IgA-bundet. Mens binding av secretory IgA (SIgA), som er tilstede i slimhinnene nettsteder har anti-inflammatoriske effekter inkludert forebygging av patogen invasjon, binding av serum IgA fører til en inflammatorisk respons. FcaRI regulerer også nøytrofile levedyktighet avhengig av inflammatorisk microenvironment .
TRIM21 kan skilles fra andre Fcr som den viser et bredt antistoff-spesifisitet. Det kan binde seg IgG, IgM og IgA . Det er også uttrykt av celler i de fleste histogenic linjene ., TRIM21 deltar i antistoff-mediert forstyrrelser av viral replikasjon av målretting cytosolic virus-antistoff komplekser for proteasomal nedbrytning.
Bindende for Fc domener til Fcr kan ha uønskede effekter i monoklonalt antistoff-basert analytiske metoder som immunohistochemistry (IHC), fluorescens aktivert celle-sortering (FACS) og chromatin immunoprecipitation (ChIP). Ikke-spesifikk binding til Fcr kan skape støy som kan føre til oppdagelse av falske positiver., Løsninger for å håndtere dette problemet er bruk av (i) isotype kontroller for avgrensning, (ii) serum vidt å konkurrere om reseptorer som er involvert i ikke‐spesifikk binding, eller (iii) renset IgG å blokkere Fc-reseptorer spesielt . Innovex Fc Receptor blocker #NB309 kan brukes til å blokkere parafin eller frosne seksjoner under IHC eller IC-eksperimenter eller BD Biovitenskap #553142 , Miltenyi Biotec Fc-reseptor blokkere for flowcytometri. For eksempel, Chopra S et al blokkert FcyR binding med 5 µg/ml TruStain fcX (anti-mus CD16/32, klone 93) fra BioLegend i løpet av flowcytometri og celle-sortering .,
Dr. Macarena Fritz Kelly fra São José dos Campos, SP, Brasil, bidro den delen som handler om Fc-reseptorer i September 2018.
Legg igjen en kommentar