Epilering induserer hår og hud pigmentering gjennom en EDN3/EDNRB-avhengige regenerativ svar på melanocyte stamceller

Epilering induserer hår og hud, hyperpigmentering i C57BL/6J mus

Vanligvis, hårsekker på dorsal huden på mus viser en synkronisert første håret cycle15., Hårsekkene på hele dorsal huden er vanligvis i anagen fra postnatal dag 1-12, i catagen fra dag 16-19, og i telogen deretter til neste anagen11, 22, 23. For å visualisere hud pigmentering endringer i løpet av postnatal hår syklus, vi depilated dorsal stammen og hodet regioner av C57BL/6J mus på postnatal dag 11 (P11) (anagen VI scenen i første håret syklus), P21 (telogen fase), eller P30, henholdsvis. Som vist i Fig. 1A, hele huden var homogeneously svart på P11 og homogeneously rosa på P21., Intriguingly, men på P30, hodebunnen hud fortsatt var rosa mens huden var svart (Fig. 1A). Disse dataene tyder på at selv om McSCs i hodebunnen og hårsekkene skille i modne melanocytter i løpet av de første håret syklus, de er ikke aktivert for å regenerere melanocytter på et tidspunkt når de er tilbake håret follicles er allerede i anagen av andre hår syklus. Vi har derfor testet om epilering kan aktivere McSCs i hodebunnen på dette tidspunkt., Dette epilering behandling betydelig indusert uttrykk av inflammatoriske faktorer, men nivået er mye lavere enn det som er indusert av sår, skader, noe som tyder på at epilering induserer bare en mild form for hud skade (Fig. S1). Det er interessant, når hodebunnen og hår av C57BL/6J mus ble epilated på P21 (som nevnt, i telogen fase av den første håret syklus), hodebunnen pigmentering ble økt betraktelig (6.06 ± 1.5 brett, n = 9) allerede 7 dager senere, på P28 (Fig. S2A,B) og epilering området produsert en pigmentert island (Fig. 1B)., Tilsvarende, epilering-indusert regenererende hår var hyperpigmentert (2.68 ± 0.87 brett, n = 5) sammenlignet med hår av ikke-epilated kontroller (Fig. 1C,D). Disse resultatene indikerer at i hodebunnen, epilering kan indusere tidlig huden repigmentation og hår hyperpigmentering.

Fordi hårene fysiologisk regenerere på baksiden av C57BL/6J mus i løpet av de første postnatal hår syklus (Fig. 1A), vi lurte også på om epilering ville indusere endringer i håret gjenfødelse på baksiden. Faktisk, 7 dager etter epilering på P21, den epilated området var hyperpigmentert sammenlignet med unepilated ett (Fig. S2C,D), som var den enkelte regenerert hår (Fig. S2E)., Disse dataene tyder på at epilering-indusert hyperpigmentering er ikke begrenset til hodebunnen. Gitt disse observasjonene, vi spurte også om virkninger av epilering-indusert hyperpigmentering fortsatt ville jobbe i gamle mus. Intriguingly, den regenererende hår i ryggen på 1,5 år gamle mus ble betydelig hyperpigmentert 30 dager etter epilering (på 1,07 ± 0.08 brett, n = 3), sammenlignet med unepilated, hviler hår (0.84 ± 0.03) (Fig. 1E,F). I tillegg, HPLC-analyse viste at epilering induserer eumelanin syntese (1.79 ± 0.09 brett, n = 3) i stedet for pheomelanin syntese (0.97 ± 0.,12 brett, n = 3) i ryggen hår (Fig. S3). Dette tyder på at epilering fører til aktivering av McSCs å generere enten mer modne melanocytter, eller at det øker syntesen av melanin i modne melanocytter i håret lyspærer av alderen mus.

Epilering-skader stimulerer McSC spredning og induserer generasjon dermal og epidermal melanocytter og uttrykk for melanogenesis-relaterte gener

Gitt at melanogenesis er koblet til anagen24, vi undersøkt om epilering-indusert pigmentering i hodebunnen er forårsaket av anagen induksjon. Som vist i Fig., 2A, epilering-indusert hårsekkene startet anagen umiddelbart, mens i ikke-epilated kontroll mus, hårsekkene er fortsatt på telogen for en lengre tidsperiode. Derfor, den rolege. hårsekken McSCs svarte til epilering ved å bli aktivert. Sju dager etter epilering, pigmentert melanocytter ble observert ikke bare i et modent hår pærer, men også i dermis, kroppsåpninger av hårsekkene, og interfollicular epidermis (Fig. 2A)., Tilsvarende, melanocyte-spesifikke markører for eksempel PMEL17 og TYR ble oppdaget i epilering-indusert pigmentert regioner, men ikke kontroll hårsekkene (Fig. S4A). I tillegg, western blot data viste at nivåene av melanogenesis-relaterte proteiner TYRP1 (4.22 ± 0.96 brett, n = 6) og TYR (9.75 ± 2.76 brett, n = 6) var både økt betydelig ved epilering (Fig. S4B og S9). Resultatene tyder på at epilering ikke bare aktiverer McSCs men også induserer regenerering av melanocytter å fylle interfollicular områder.,

I ryggen hud, 7 dager etter epilering på P21, totalt melanocyte nummer i hvert hår lyspære (20 ± 1.9) var signifikant økt sammenlignet med fysiologiske regenerering (15.7 ± 1.4) (Fig. 2B)., Tilsvarende var det også mer melanosomes i epilering-indusert regenerert hår pærer enn i fysiologisk regenerert hår pærer (Fig. 2C og Fig. S4C,D). Disse dataene tyder på at epilering indusert McSC hyperproliferation i løpet av de første postnatal hår syklus. Faktisk, 3 dager etter epilering, vil den McSCs’ spredning prisen var høyere (86.2 ± 3,5% av cellene ble Ki67-positiv etter epilering i forhold til 45.6 ± 3,4% av cellene positive for Ki67 i kontroller) (Fig. 2D)., Interessant nok KIT-positive celler ble ikke funnet i overhuden, men de eksisterte i håret bule 1 dag etter epilering og tydelig til stede i epidermis 3 dager etter epilering (Fig. 2E og Fig. S5). Antall Kit+ celler i epilated epidermis (2.32 ± 0.72/snitt, n = 4) er økt betydelig sammenlignet med fysiologiske epidermis (0.77 ± 0.68/snitt, n = 4) (Fig. 2F). Tilsvarende 7 dager etter epilering, pigmenterte celler ble også funnet i epidermis (Fig. 2E,F)., Videre kvantitativ RT-PCR 7 dager etter epilering avslørt induksjon av mange melanogenesis-relaterte gener, inkludert Tyr (2.84 ± 1.13 kaste seg over kontrollen, n = 3), Tyrp1 (3.89 ± 0.72 brett, n = 3), Mitf (3.47 ± 0.38 brett, n = 3), Sox10 (2.13 ± 1.13 brett, n = 3), Pax3 (3.18 ± 0.43 brett, n = 3) og Ednrb (3.28 ± 0.62 brett, n = 3) (Fig. S6A). Til sammen utgjør disse resultatene tyder på at epilering induserer McSCs spredning, migrasjon i overhuden, og stimulering av melanogenesis programmet.,

Epilering induserer EDN3 uttrykk i hårsekkene og epidermis

Blant de gener som er indusert av epilering, EDNRB var av spesiell interesse på grunn av sin velkjente engasjement i reguleringen av melanocyte lineage1, 12. Nylig, uttrykk for sin ligander Edn1 og Edn2 har blitt rapportert å være økt i løpet av fysiologiske anagen hår, men sin ligand Edn3 uttrykk var ikke affected12. Derfor, vi lurte på om epilering tilbake hår ville få disse ligander., I bekreftelse av resultatene over, fant vi at i løpet av fysiologiske regenerasjon, uttrykk for Edn1 og Edn2 ble økt i ryggen huden på P26, men Edn3 uttrykk viste ingen endring (Fig. 3A og Fig. S11). Overraskende, men epilering ikke bare indusert uttrykk for Edn1 og Edn2 men også at av Edn3 (Fig. 3A), som er kodet produkt, EDN3, har tidligere vist seg å være involvert i melanocyte development1, 25, 26. Derfor har vi fokusert vår studie på EDN3 og signaliserer sin vei. Vi fant at nivået av EDN3 proteinet var signifikant økt i epilated hud (D0, 0.,94 ± 0.2 brett; D3, 1.81 ± 0.09 brett; D5, 4.57 ± 0.67 brett; n = 6), men er fortsatt lav i kontroll hud (D0, 1.25 ± 0.47 brett; D3, 0.83 ± 0.14 brett; D5, 1.21 ± 0.2 brett; n = 6) (Fig. 3B og Fig. S12). Immunohistochemistry viste at på epilering dag 1, EDN3 protein ble økt i dermal papilla, epidermis, og sekundær hår bakterie. På dag 7, det var også økt i kroppsåpninger av hårsekkene (Fig. 3C). Regioner med høy epilering-indusert EDN3 nivåer var i nær kontakt med McSCs i videregående hår bakterie (sHG) eller med hår pære melanocytter., Ved hjelp av voksen heterozygot Ednrb lacZ /+ mus, så vi fant ut at EDNRB er uttrykt i pigmentert melanocytter av hår pærer og i sHG lignende uttrykk for Dct-lacZ i hårsekkene (Fig. 3D). Videre, immunostaining data viste at β-Gal positive celler var co-merket med KIT-positive celler i sHG og med MITF-positive celler i håret lyspære (Fig. 3E), noe som tyder på at EDNRB er uttrykt i McSCs og melanocytter., As expected, 7 days after epilation, western blot analysis and immunostaining data showed that Ednrb-lacZ expression is significantly increased in melanocytes (Figs S6B,C and S13). These results suggest that epilation induces EDN3, which then stimulates its receptor EDNRB to regulate McSCs and melanocytes.

EDN3 er godt kjent for sine virkninger på å stimulere til vekst og differensiering av melanocyte precursors1, 25, 26., Nylig, transgene overexpression av EDN3 har blitt rapportert å hindre håret gråning forårsaket av gjentatte ganger epilation27, noe som tyder på at EDN3 påvirker også McSCs. For å undersøke effekten av EDN3 på McSCs, vi isolert DCT+ celler fra E16.5 villtype epidermis og stimulert dem med EDN3 eller BQ788 (en EDNRB inhibitor). Som vist i Fig. S7A, stimulering med EDN3 betydelig økt spredning pris for DCT+ celler (fra 43,7 ± 2% opp til 61.4 ± 7.5%, n = 5), men denne effekten av EDN3 var helt blokkert av BQ788 (26.4 ± på 1,56%, n = 5)., Basert på de fakta som for unpigmented celler, DCT er en spesifikk markør for McSCs og at det ikke er modne melanocytter i E16.5 epidermis4, 28, resultatet tyder på at EDN3/EDNRB er nødvendig for McSC spredning.

Ednrb er nødvendig for epilering-indusert hår og hud pigmentering

for Å evaluere betydningen av EDNRB signalering for epilering-indusert hud, hyperpigmentering, vi brukte homozygote Ednrb lacZ/lacZ (Ednrb−/−) mus. Slike mus er i stor grad fri for pigment cellene, men beholde pigmenterte flekker på undersiden av hodet og halen., Fjorten dager etter epilering i hodet regionen, regenererende hår var hyperpigmentert i villtype-mus (2.41 ± 0.55 brett, n = 5), men ikke i Ednrb−/− mus (Fig. 4A,B). I unepilated Ednrb−/− mus, melanin nivåer av håret sjakter var lavere (0.51 ± 0.06 brett, n = 5) sammenlignet med de som er i kontroll villtype-mus (1.02 ± 0.14 brett, n = 5) (Fig. 4B). I tillegg, hud repigmentation var signifikant økt i villtype-mus, men bare litt i Ednrb−/− mus (Fig. 4C). Huden melanin nivåer indusert ved epilering var betydelig lavere i Ednrb−/− mus (1.85 ± 0.,79 brett, n = 9) sammenlignet med de i villtype-mus (5.1 ± 0.62 brett, n = 9). Disse resultatene tyder på at sletting av Ednrb forstyrrer epilering-indusert hår hyperpigmentering og hud repigmentation. Videre, tap av EDNRB er forbundet med hår gråning. Melanin nivåer av farget håret sjakter Ednrb−/− mus ble redusert fra en måned av alder (0.96 ± 0.1 brett, n = 4) og opp til 12 måneders alder (0.37 ± 0.12 brett, n = 4), i motsetning til sine nivåer i håret sjakter av villtype-mus (1.96 ± 0.17 brett, n = 4 i en måned; 2.15 ± 0.43 brett, n = 4, ved 12 måneder) (Fig. S7B).,

for Å undersøke om EDNRB signalering er nødvendig for epilering-indusert hyperpigmentering i ryggen hud, har vi utført intradermal injeksjon av BQ788, etter epilering av villtype-mus. Som vist i Fig., 4D, mens kontroll intradermal injeksjon av NaCl etter epilering er tillatt for hud, hyperpigmentering (fra 0.23 ± 0.06 brett opp til 1.0 ± 0.15 brett, n = 3), injeksjon av BQ788 betydelig redusert epilering-indusert hud pigmentering (0.76 ± 0.1 brett, n = 3). Dette funnet tyder på at farmakologiske forstyrrelse av EDNRB kan blokkere epilering-indusert hud, hyperpigmentering i ryggen hud. Til sammen utgjør disse data tyder på at EDNRB signalering er nødvendig for epilering-indusert hyperpigmentering.,

EDNRB påvirker McSC spredning i hårsekkene og regulerer melanogenesis-relaterte genuttrykk

for Å undersøke hvordan mangel på Ednrb reduserer pigmentering, vi histologically analysert pigmentering av hårsekkene i hodebunnen (som, som nevnt, fortsatt pigmentert i Ednrb−/− mus i motsetning til den tilbake). Som vist i Fig., 5A, på dag 5 etter epilering, hår pærer og håret sjakter Ednrb−/− mus ble som normalt finnes i hodebunnen, men var hypopigmented sammenlignet med de av villtype-mus, noe som tyder på at tap av EDNRB påvirker ikke hår syklus, men minsker melanocyte tall eller syntesen av melanin i pære. Faktisk, 7 dager etter epilering, vil den melanosome antall Ednrb−/− mus var mye lavere enn villtype-mus (Fig. 5B)., I tillegg, melanocyte-spesifikke markører for eksempel PMEL17 og TYR ikke kunne oppdages i dermis, kroppsåpninger av håret follicles, eller interfollicular epidermis av Ednrb−/− mus 5 dager etter epilering, selv om de var til stede på lave nivåer i håret pærer (Fig. S7C). Videre McSC markør KIT og pigmentert melanocytter vært umulig å oppdage selv 7 dager etter epilering (Fig. 5C og Fig. S7D). Disse resultatene antydet at EDNRB er nødvendig for epilering-indusert epidermal melanocyte regenerering.,

for Å analysere hvordan tap av EDNRB reduserer melanin nivå av hår-pærer, så vi kvantifisert melanocyte tallene i hver pære hår av villtype og Ednrb−/− mus 7 dager etter epilering., Antall MITF-positive celler ved epilering var lavere i hver hårsekken av Ednrb−/− mus (11.7 ± 2.2) i forhold til hårsekkene i villtype-mus (15.7 ± 1.43) (Fig. S7D). Dette resultatet antyder at tap av EDNRB kunne blokkere epilering-indusert spredning av melanocyte avstamning celler. Nylig, Takeo et al. funnet at under fysiologiske håret gjenfødelse, EDNRB signalering er også nødvendig for McSCs spredning og maintenance29. Likevel, om EDNRB påvirker epilering-indusert McSC spredning var fortsatt ukjent., Siden EDN3 er uttrykt i dermal papilla i umiddelbar nærhet til modne melanocytter i håret pære, vi testet om EDN3/EDNRB signaliserer påvirker McSC spredning i bule eller stimulerer syntesen av melanin i follicular melanocytter. I hodebunnen, anti-KIT og Ki67 immunostaining data viste at 3 dager etter epilering, McSC spredning i hvert hår bule av Ednrb−/− mus (52 ± 5.2%) var lavere enn i tilsvarende buler av villtype-mus (86.2 ± 3.5%) (Fig. 5D). Dette tyder på at EDNRB er også nødvendig for epilering-indusert McSC spredning i håret bule.,

for Å få ytterligere innsikt i de underliggende mekanismer, som vi isolert melanocytter for in vitro-dyrking. Som vist i Fig. 5E, den pigmentering av Ednrb−/− primær melanocytter fra farget hår follicles av P6 Ednrb−/− mus var lavere (0.47 ± 0.1 brett, n = 5) enn villtype primære melanocytter (1.0 ± 0.1 brett, n = 5). Lignende resultater ble oppnådd i celle pellets eller når melanin innholdet ble direkte målt (Fig. 5F). Vi analysert om EDNRB signaliserer ville påvirke uttrykket av melanogenesis-relaterte gener. Som vist i Fig., 5G, på dag 7 etter epilering, uttrykk for melanogenesis-relaterte gener ble redusert i Ednrb−/− skalp, inkludert uttrykk for Pax3 (0.47 ± 0.07 brett, n = 3), Tyr (0.55 ą 0,05 brett, n = 3) og Tyrp1 (0.5 ± 0.02 brett, n = 3). Dette tyder på at EDN3/EDNRB signalering er involvert i både melanocyte spredning og melanogenesis under epilering-indusert regenerativ svar på McSCs. Til sammen utgjør disse funnene tyder på at epilering induserer melanogenesis-relaterte gen uttrykk gjennom EDN3/EDNRB signalering og i sin tur fører til hud og hår hyperpigmentering.