Frontiers i Mikrobiologi

Innledning

Bacillus thuringiensis og de andre 7 arter av spore forming Gram positive bakterier, inkludert B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, og B. mycoidesare, er først og fremst påvist i jord. Fordi disse bakteriene er svært lik i genotype og fenotype, bakterier er klassifisert som B. cereus-gruppen i taksonomi (Park et al., 2007). B., cereus og B. thuringiensis er svært synlig i mat siden de er observert i råstoff fra landbruket jord under dyrking og distribusjon. I tillegg er disse to bakterier er vanligvis ikke diskrimineres i klinisk diagnostikk. B. cereus er en annen risiko prioritert gruppe av foodborne sykdom i ferske landbruksprodukter, og dens forurensning er ett av de store problemene i grønnsaker (Felício et al., 2015). I særdeleshet, B., thuringiensis ble brukt som plantevernmiddel i dyrking av visse avlinger, og det er godt kjent som mikrobiell insektmidler som har vært brukt for å redusere mengden av kjemiske plantevernmidler (Azmi et al., 2015).

B. thuringiensis produserer insecticidal proteiner, som er den viktigste typen av Krystallinsk (Rop) proteiner (Kutasi et al., 2016). I motsatt fall, aktivt voksende vegetative celler som mangler krystall produksjon føre til ikke-toksiske effekter. Den δ-endotoxins inneholder hovedsakelig Cytolytic (Cyt) og Gråte (Elleuch et al., 2015; Rao et al., 2015)., Imidlertid, Cyt og Gråte ha forskjellige sekvenser homologies selv om de består av lignende moduser handling mot cellelysering, noe som fører til permanent skade av insekt midttarmen (Adang et al., 2014).

Den strukturelle variant av fire δ-endotoxins (Cry1, Cry2, Cry3, og Cyt2Ah) ble observert ved X-ray crystallography (Dehury et al., 2013). Disse gener er identifisert i transgene bomull og andre grønnsaker, som er betydelig effektiv i å kontrollere skadedyr., Å designe en biomarkør for den oversatte produktet varierer med de ulike kategoriene av cry proteiner; derav, deteksjon vil være komplisert. 16S rRNA gen sekvenser basert på universelle primere viste høy likhet (>99%) indeks mellom B. cereus og B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), som ikke kan klassifiseres ved hjelp av genetiske og fenotypiske analyser (Peng et al., 2015). Videre har det vært en diskusjon siden 2000 om hvorvidt hele B. cereus-gruppen skal behandles som en kompleks arter av ulike bakterier (Helgason et al., I 2000; Bartoszewicz og Marjańska, 2017). Det er også forslag som fylogeni av disse bakteriene passer bedre til deres økologiske egenskaper (psychrotolerance, virulence) enn å taksonomisk tilhørighet (Drewnowska og Swiecicka, 2013; Bartoszewicz og Marjańska, 2017). For å løse dette problemet, og vi målrettet XRE å oppdage B. thuringiensis, som kontrollerer store type crystal protein produksjon.

Disse to bakterier er svært lik i biokjemiske resultater (Böhm et al., 2015), og genetiske egenskaper (Osman et al., 2015). Cho et al., (2015) rapporterte også at de genetiske og fenotypiske egenskaper mellom disse bakteriene er knapt gjenkjennelig. Videre, Pfrunder et al. rapportert at B. cereus-gruppen artene kan ikke være pålitelig identifisert ved hjelp av klassisk biotyping (Pfrunder et al., 2016). Basert på disse, biokjemiske eksperimenter kan ikke være nok for differensiering. I stedet, tilstedeværelse av en insecticidal crystal protein ble brukt som en fremragende karakteristiske å skille mellom disse bakterier (Ekino et al., 2014; Wei et al., 2018).,

Noen av de faktorene som skiller disse to bakterier er basert på deres pathogenicity i prøvene. B. cereus forårsaker mage lidelse, mens B. thuringiensis har også vært involvert i epidemier av diaré. Som rapportert, skille karakteristikk av B. thuringiensis er tilstedeværelsen av insecticidal crystal proteiner (δ-endotoksin) kryptert av cry-gener (Osman et al., 2015; Albright et al., 2016). Siden metode for identifisering ved hjelp av biomarkører for å skille B., cereus-gruppen er komplisert og tidkrevende, med en svært effektiv biomarkør er stort behov for å erstatte den forrige som ga en lavere effektivitet og noen ganger også viste falske resultater. Basert på de to spesifikke gener, den transcriptional regulator og crystal protein gener for B. thuringiensis (Porcar og Juarez-Pérez, 2003; Han et al., 2006), den aktuelle studien ble utført for å undersøke og sammenligne effektiviteten av designet biomarkør (XRE) med eksisterende crystal protein markør (cry2) i å identifisere B. thuringiensis fra B. cereus-gruppen stammer (Bcg) og ikke-B., cereus-gruppen stammer (non-B) i matvarer. cry2is den vanligste crystal protein til stede i B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma et al., 2014).

Materialer og Metoder

Bakterier Kulturer Forberedelse

Alle de 120 stammer, inkludert 111 av Bcg og 9 ikke-B, ble innhentet fra bakteriell samlinger i Usa og Sør-Korea (Supplerende Tabell 1). Blant samlinger, B. thuringiensis ATCC 10792 (type belastning) ble brukt for optimalisering av eksperimentelle forhold til konvensjonell PCR og real-time PCR., Alle stammer som var tint ved romtemperatur (25°C) og stripete på nærings-agar (Difco, MI, Usa). Etter dyrking for 24 timer ved 35°C i inkubator, et rent kolonien ble plukket og inokulert i tryptic soya buljong (Difco, MI, Usa) og overnatting kulturer ble brukt for påfølgende eksperimenter.

Primer Design og DNA Isolert

De respektive primere målretting XRE for å skille B., thuringiensis (Tabell 1) ble utviklet i henhold til følgende sekvens i Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gen – 3664610-3665047) ved å bruke Primer Express® – Programvare (Versjon 3.0.1) fra Applied Biosystems ligger i CA, Usa og syntetisert av Bioneer Corporation fra Daejeon, – Korea. Resultatene av designet XRE ble sammenlignet med cry2 (Ben-Dov et al., 1997). Etter 24 t i vannmassene i TSB, en delmengde av 1 mL av bakterier ble utsatt til genomisk DNA-ekstraksjon ved hjelp av PrepMan® Ultra Eksempel Forberedelse av Reagens (Applied Biosystems, CA, Usa)., DNA-konsentrasjonene ble målt ved Eppendorf BioSpectrometer® fluorescens (Eppendorf i Hamburg, Tyskland) og justert til 10 ng/µL. DNA-prøvene ble lagret ved -20°C før bruk.

Konvensjonell PCR og Real-Time PCR Analysen

konvensjonell PCR ble forberedt med en C1000 TouchTM Thermal Cycler fra Bio-Rad ligger i Hemel Hempstead, United Kingdom., Reaksjonsrøret for PCR brukes Nøyaktig-Power® Pyro Hot Start Taq-PCR Pre-Mix fra Bioneer Corporation ligger i Daejeon, Korea og et volum på 20 µL, inkludert 1 µL av hver primer (10 pmoL/µL) og 2 µL DNA. Forsterkning forhold til konvensjonell PCR for transcriptional regulator (XRE) var: første denaturering ved 95°C i 5 min, etterfulgt av 35 sykluser av denaturering ved 95°C i 30 s, annealing ved 49°C i 30 sekunder og tøyelighet ved 72°C i 30 sekunder, og en siste strekning på 72°C i 5 min., Amplifikasjoner vilkår for crystal protein (Cry 2) var: første denaturering ved 95°C i 5 min, etterfulgt av 35 sykluser av denaturering ved 95°C i 30 s, annealing ved 55°C i 30 sekunder og tøyelighet ved 72°C i 1 min., og en siste strekning på 72°C i 5 min. Etter DNA-amplifikasjoner, 1.5% (W/V) agarosegel løsning som inneholder RedsafeTM Nucleic Acid Solution 20,000 × (Intron Bioteknologi, Inc.) ble utarbeidet og gel elektroforese ble utført ved bruk av Sub-Celle Modell 192 fra Bio-Rad ligger i Hemel Hempstead, United Kingdom., Båndene ble visualisert ved hjelp av Smart View Pro UVCI-1100 Imager system fra Store Science ligger i CALIFORNIA, Usa. Korrektheten (AC) ble brukt til å evaluere PCR-metoden ved å bruke primere XRE og cry2 i å oppdage B. thuringiensis fra Bcg og ikke-B. Negative avtalen (NA) betyr at de samme negative resultat for ikke-B. thuringiensis ved hjelp av PCR med XRE og cry2. Positiv avtalen (PA) betyr at de samme positive resultat for B. thuringiensis ved hjelp av PCR med XRE og cry2. Korrektheten (AC) er målt ved hjelp av følgende ligning, AC = ×100% (Ma et al., 2014).,

Real-time PCR-eksperimenter ble utført av StepOneTM real-time PCR-System fra Applied Biosystems ligger i CALIFORNIA, Usa. En reaksjon volum av 20 µL bestående av 10 µL av Smelte DoctorTM Høy Oppløsning Smelte (HRM) Master Mix, 2 µL DNA, og 0,5 µL av F/R primer (10 pmoL/µL) (Tabell 2). Forsterkning forhold av qPCR var: første denaturering ved 95°C i 10 min og 40 sykluser på 95°C i 15 s og 60°C i 1 min. Deretter, i den påfølgende smelting curve-analyse, temperaturen ble satt til å øke fra 60 til 95°C ved 0.3°C/sykle til test spesifisiteten av primer.,

Evaluering av Real-Time PCR Analysen

resultatene av XRE og cry2 ble evaluert ved hjelp av 50 B. thuringiensis stammer, mens eksklusivitet ble testet ved hjelp av 70 non-target bakterier, inkludert 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg, og 9 ikke-B (Chelliah et al., 2017). En standard kurve som ble laget ved hjelp av 10-brett fortynninger av DNA ekstrahert fra B. thuringiensis ATCC 10792., DNA-konsentrasjonene ble justert fra 10 ng/µL 100 fg/µL, tilsvarende 2.6 × 106 til 2,6 × 10 CFU, og amplifikasjoner ble utført ved real-time PCR med triplicates. For negative kontroller, destillert vann ble brukt. Negative resultater eller ingen amplifikasjon kurver ble vurdert når syklusen terskel (Ct) verdier ble mer enn 40.

Påvisning av B. thuringiensis Tilsatt i Maten

Salat (Lactucasativa), Kimbab og spinat (Spinaciaoleracea) ble kjøpt fra et lokalt marked i Chuncheon, – Korea., Prøvene ble testet på fravær av mål bakterier i henhold til ISO 7932 (2004). En alikvot av 50 g av hver type mat ble tilberedt i en steril stomacher-vesken fra Nasco Virvel-Pak ligger i WI, Usa. Over natten B. thuringiensis kulturer ble fortynnet i 0,5% peptone vann og brukes for å forberede den kunstig forurensede prøver med grader nivåer fra 103 til 105 CFU/g (Chon et al., 2012; Kim et al., 2013). En alikvot av 1 mL suspensjon av mat prøvene ble overført til en ny sterilisert rør og brukt til DNA-ekstraksjon.,

Resultater og Diskusjon

Påvisning av B. thuringiensis ved Hjelp av cry2 Genet

For 120 stammer, forsterkning produkter av ca 700 bp ble innhentet ved å bruke primere cry2 (Tabell 1). Som vist i Tabell 2 og Figur 1, ved bruk av PCR-målretting cry2, 6 B. cereus-slekter og 36 B. thuringiensis stammer (72%) var forsterket. Ingen andre B. cereus-gruppen eller ikke-B-gruppen ble forsterket. Dette viste en nøyaktighet på 82% av cry2 for å påvise B. cereus grupper. For 120 stammer testet, 100 stammer ga NAs eller PAs, indikerer en samlet nøyaktighet prosent av 83.,3% (Supplerende Tabell 1). Mens Riojas et al. (2015) rapporterte en multiplex PCR av ikke-ribosom-peptid syntase (NRPS) – genet og cry1 å identifisere B. cereus og B. thuringiensis med en spesifisitet på 24,5% i B. cereus og 15% i B. thuringiensis.

Det har blitt rapportert at B. thuringiensis strain kan syntetisere ett eller flere crystal proteiner siden ett eller flere crystal toksin gener har blitt funnet for B. thuringiensis. Den viktigste årsaken til at mangfoldet av toksin gener er overføring av plasmider i B. thuringiensis (Adang et al., 2014). Det er en hyppig prosessen for plasmider overføring av enten tre eller mobilisering (Makart et al., 2017)., Videre utveksling av cry-gener generere B. cereus med en ny binding av rop som fører til likhet i B. cereus og B. thuringiensis (Fiuza, 2015). I tillegg, med en annen isolasjon kilde cry-gener viste en forskjell i mangfold og distribusjoner. For eksempel, en roman gråte genet kan bli funnet i hver habitat som viser ulike insecticidal aktivitet.

Påvisning av B. thuringiensis ved Hjelp av XRE Genet

Potensial kodende sekvenser (CD) ble spådd til å være transcriptional regulatorer., CD-plater inneholder en helix-slå-helix (HTH) motiv i XRE-som protein familie og MerR familie transcriptional regulatorer, tidligere tilsvarende XRE gensekvenser i pBMB28 av B. thuringiensis YBT-020 og pCT281 av B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, som er relatert til HTH-type transcriptional regulator, SinR, var identisk med det tilsvarende elementet pG9842 av B. cereus G9842 (GenBank: CP001187). Den HTH proteiner, sammen med sigma faktorer, delta i et bredt spekter av signalering veier, for eksempel, som repressors som hemmer sporulation (Murawska et al.,, 2014), dannelsen av biofilm (Colledge et al., 2011), og protease sekresjon (Pflughoeft et al., 2011). Bortsett fra Cry1Ab21 og δ-endotoksin som er kodet i toxigenic plasmider pIS56-63, som er ansvarlig for konjugasjon og sporulation (Martinez-Núñez et al., 2010; Deng et al., 2014) i tillegg med 53 forskjellige kodet antatte proteiner.

PCR resultatene med XRE åpenbart at ingen av de 58 B. cereus eller ikke-B ga en forsterkning (Tabell 2 og Figur 1). Totalt ut av 50 stammer fra B. thuringiensis 47 viste positive resultater (94%). Dette viste en nøyaktighet på 97.,3% av XRE for å påvise B. thuringiensis blant testet B. cereus grupper. For 120 stammer testet, 117 stammer ga NAs eller PAs, indikerer en samlet nøyaktighet prosent på 97,5% (Supplerende Tabell 1).

Standard Kurve og Forsterkning Effektivitet

Den real-time PCR analysen ble utført ved hjelp av DNA-ekstrakter fra rene kulturer av B. thuringiensis type stamme ATCC 10792 rettet mot XRE genet. De utviklet real-time PCR analysen var effektiv for å påvise konsentrasjoner fra 2,6 × 10 til 2,6 x 106 CFU/reaksjon, som dekket 6 størrelsesordener., Ligningen av logg kopier nummer versus Ct-verdi for B. thuringiensis var y = -3.853 x+21.244 med en R-kvadrerte verdien av 0.993, som indikerer høy linearitet (Figur 2).

Tilsatt Maten Deteksjon

Nylig, B. thuringiensis har vært rapportert å være oppdaget i matvarer som melk, frukt og korn som har blitt dyrket og høstet fra jorden utenfor landet., Forbruk av rå-og minimalt prosesserte grønnsaker er ansett som naturlig og sunt, men bekymringer angående rester av kjemiske sprøytemidler i friske grønnsaker har vært reist (Chiu et al., 2016). Dermed forbrukerne har slått sin interesse for økologiske grønnsaker (kjemisk fri grønnsaker), og det er spådd at bio-plantevernmidler, herunder B. thuringiensis, kan utgjøre 20% av verdens plantevernmiddel markedet innen 2020 som en erstatning for kjemiske plantevernmidler (Watt og Williamson, 2015)., I denne studien, resultatene av real-time PCR-målretting XRE ble evaluert med 3 typer av kunstig kontaminert mat prøvene (salat, kimbap og spinat). Frisk over natten kulturer av B. thuringiensis var inokulert i hver mat eksempel. Real-time PCR kunne oppdage B. thuringiensis ved en konsentrasjon på 4,8 × 103, 3.4 × 103, og 1,5 × 103 CFU/g salat, kimbap og spinat, henholdsvis (Figur 3). Imidlertid, for kimbap prøvene, Ct-verdier ble høyere, siden det vanligvis inneholder mer komplekse materialer som pølse, egg eller gulrot sammenlignet med grønnsaker.,

Konklusjon

Siden B. cereus-gruppen er svært lik i biokjemiske samt genetiske profiler, en ny biomarkør ble utviklet for å identifisere og skille B. thuringiensis fra nært beslektet gruppe. Resultatene av XRE ble sammenlignet med cry2 genet og kunstig forurensede prøvene ble også testet. Sammenlignet med cry2, XRE genet ble observert å være effektivt og nøyaktig i identifisering av B. thuringiensis. Videre er det utviklet real-time PCR ved hjelp av XRE vellykket identifisert B., thuringiensis, og det kan brukes til å kvantifisere celle tall med generert standard kurve.

Forfatter Bidrag

Midler

Dette forskningsarbeidet ble støttet av Ministry of Agriculture, Food and Drug Safety (Grant Nr 14162MFDS085) Republikken Korea og Kangwon National University i 2015. SW var takknemlig for den økonomiske støtten fra China Scholarship Council (CSC Nei: 201408260054). Forfatterne ønsker å takke Hyun-Ah Lee på Sentralt Laboratorium for Kangwon National University for teknisk støtte., RC er takknemlig for den økonomiske støtten fra National Research Foundation of Korea (NRF) 2018007551.

interessekonflikt Uttalelse

forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller finansielle forhold som kan oppfattes som en potensiell interessekonflikt.

Supplerende Materiale