Frontiers i Pediatri

Innledning

Posterior uretrale ventiler (PUV) er den vanligste medfødte årsaken til pediatric blæren outlet obstruksjon (1). Mens dødeligheten fra PUV har betydelig forbedret med moderne medisinsk behandling, obstruktiv uropathy fortsatt er en betydelig kilde til sykdom i voksen alder (2). Opp til 80% av barn med PUV vise symptomer for inkontinens og urin-skrift infeksjoner (3)., Videre, opp til 50% av barn med PUV vil utvikle nyresvikt, med obstruktiv uropathy de vanligste medfødte forårsake nyre-transplantasjon (4). Obstruktiv ventilen brosjyrer blir kirurgisk behandlet snart etter fødselen, men barn med PUV vil utvikle variasjon i urin blæren funksjon gjennom hele livet. Det har blitt demonstrert at blæren forringelse ofte oppstår etter puberteten, med et økende behov for ren intermitterende kateterisering (5).

Studier utnytte ulike dyremodeller har vist blæren til å være hormonally sensitive., Spesielt testosteron erstatning har vist seg å øke glatt muskel masse og glatt muskulatur til å kollagen-nivået i orchiectomized rotter (6). En modell av delvis blæren outlet obstruksjon i mannlige mus ble undersøkt og det er vist til å produsere blæren detrusor muskelen hypertrofi (7). Testosteron har blitt vist å øke detrusor fibrose i respons til iskemi–reperfusion skade i kastrerte kaniner (8). Men til dags dato effekten av hormonelle endringer på responsen av den mannlige musen blæren til skade produsert av obstruksjon har ennå ikke studert., Derfor kan vi oppfatte hva andre tenker at testosteron deltar i mistilpasset fibrotic endringene som skjer følgende blæren outlet obstruksjon.

Materialer og Metoder

Murin Delvis Blæren Outlet Obstruksjon Modell

Alle kirurgiske prosedyrer ble godkjent av Dyr Omsorg og Bruk Komiteen av Stanley Manne Children ‘ s Research Institute. Åtte – ti-ukers CD1 mannlige mus (Charles River Labs, Chicago, IL, USA) ble plassert i separate bur for å unngå endringer i testosteron nivåer forårsaket av gruppe bolig. Mus ble bedøvet med 3% isofluran og plassert på ryggen., Nedre del av magen ble barbert og forberedt med providone-jod-løsning. Etter å sørge for tilfredsstillende induksjon av anestesi, en midtlinjen lavere abdominal hud snitt ble gjort og ført ned gjennom bukveggen. Blæren outlet obstruksjon ble gjennomført på en måte som likner en tidligere rapport, men med noen forskjeller (delvis obstruksjon eller PO-gruppen) (7). Vær oppmerksom på at delvis obstruksjon er vanligvis referert til som «pBOO,» men vi vil henvise til operasjon og eksperimentell gruppe som PO., Med oppover trekkraft på blæren, stump disseksjon rundt blæren nakke (proksimalt for prostatakreft i mannlige mus) ble gjennomført mens tidvis trekker tilbake blæren caudally for å sikre disseksjon å være anterior til urinlederne. Et klubben 7-0 polypropylen sutur var da gått rundt blæren nakke og bundet ned over en 23-gauge nål plassert ved siden av urinrøret. Nålen ble fjernet., Hvis mannlige dyr var å bli kastrert (castrate delvis obstruksjon eller CPO), samtidig testiklene ble brakt ut av bukhulen snitt, spermatic snorer ligated med 6-0 polypropylen suturer og skarpt delt. I bukveggen og huden ble deretter lukket separat med 5-0 polyglactin suturer i en avbrutt mote. Humbug dyr gjennomgikk samme prosedyre opp til det punktet av blæren mobilisering. Dyr er tillatt å gjenopprette, forutsatt carprofen oppløst i vann, og ofret på 1 eller 4 uker følgende funksjonelle studier som er beskrevet nedenfor., Følgende offer av cervicalcolumna uroa under isofluran anestesi, dyrene ble veid og blærer ble dissekert ut på nivå med ligatur. Hver blæren var tømt av urin og deretter separat veide for 12 humbug, 17 PO, 11 CPO, og 11 CPOT mus.

Testosteron Administrasjon

Testosteron cypionate ble gitt til castrate, delvis hindret gruppe på tidspunktet for kastrering og ukentlig postoperativt ved dose på 10 mg/kg (castrate delvis obstruksjon testosteron eller CPOT gruppe)., For mus gitt testosteron erstatning, blod ble trukket i gang av offer og sendt til kommersielle testosteron-analysen for å sikre at de mottar tilstrekkelig erstatning (Antech Diagnostikk, Irvine, CA, USA).

Ugyldig Flekk på Papir (VSOP)

VSOP ble utført morgenen av post-operative dager 1, 7 og 28 for hver mus. Mus ble opprettholdt i metabolske merder med underliggende Whatman filter papir for 2 h og gitt ubegrenset tilgang til mat og vann. Filter ark ble fotografert., Nummer og mønster av tomrom ble notert, og arealet til hver enkelt å trekke flekken ble målt ved hjelp ImageJ (National Institutes of Health i Bethesda, MD, USA). Ved hjelp av en standard kurve laget fra å trekke flekker fra kjente mengder urin, beiset området ble omgjort til annullert volum. Maks annullert volum var analysert.

Histologiske Analyser

Blærer ble løst i 10% (w/v) formalin (Sigma) for 24 timer, innebygd i parafin og kuttet på tvers med blæren nakke orientert ned for å produsere 4 µm seksjoner. Snitt fra 4 humbug, 4 PO, 4 CPO, og 4 CPOT mus ble farget med Masson er trichrome., Delene ble fotografert på 10× 40× forstørrelse ved hjelp av en Leica oppreist mikroskop er koblet til et kamera og bilder ble digitalt lagret ved hjelp av OpenLab for Mac. Col/SM-forhold ble kvantifisert ved hjelp av Adobe Photoshop, som er beskrevet tidligere, og i gjennomsnitt fra fire 40× snitt per blæren. For immunostaining, blærer ble fiksert på 4% (w/v) formaldehyd laget fra paraformaldehyde (EM Sciences) over natten. Vev ble vasket i DPBS og likevekt i serie i 20% (w/v) og 30% (w/v) sukrose (Sigma) i DPBS., Vev ble frosset i skrelle vekk muggsopp inneholder OCT (Vev Tech) i en tørr is isopentane (Sigma) badekar.

Immunfluorescens-Antistoffer

Tillatte blærene fra 3 humbug, 3 PO, 3 CPO, og 3 CPOT mus ble utnyttet. Deler av 10 µm fra var cut for alle eksperimenter. Seksjonene ble vasket to ganger i PBS, inkubert i 5 min ved romtemperatur i PBS + 0.1% Tween (PBT), og blokkert i 30 minutter ved romtemperatur med 10% esel serum i PBT., Glatt muskulatur myosin (SMM) ble oppdaget på samme måte ved hjelp av kanin anti-glatt muskulatur myosin (Biomedisinsk Teknologi, 1:100) i forbindelse med Alexa Fluor 546 esel anti-kanin sekundært antistoff (Life Technologies, 1:400).

Statistiske Analyser

Grupper ble sammenlignet ved hjelp av ANOVA med post hoc Student–Newman–Keuls analyse. Resultater med P < 0.05 ble vurdert som vesentlig. SPSS v22.0 ble brukt for statistisk analyse. Feilmarginer i tallene gjenspeiler SEM.,

Resultater

PO Fører til Funksjonelle Endringer Fastsatt av Urodynamiske Undersøkelser og Trekke Flekker på Papiret

Delvis blæren outlet obstruksjon ble utført på mannlige CD-1 mus og i forhold til to grupper: mannlige mus gjennomgår humbug kirurgi og mannlige mus gjennomgår delvis blæren outlet obstruksjon med kastrering. Vi målt serum testosteron nivåer i kastrert mus og funnet det falt til nivåer (<20 pg/dL) innen 24 timer etter orchiectomy., Effekten av obstruksjon på blæren funksjon var fast bestemt på å utnytte urodynamiske undersøkelser i disse tre gruppene. Figur 1A viser forhøyet topp trekke presset 1 uke post-obstruksjon i PO og CPO mus i forhold til humbug kirurgi mus. Representant urodynamiske tegninger viser også ustabilitet på 1 uke i PO og CPO mus (Figur 1C). VSOP utført på 1 uke etter obstruksjon reflekterer effekten av obstruksjon på PO og CPO mus som ikke er sett i sham kirurgi mus (Figur 1B,D)., Dermed, vår modell av PO hadde betydelige funksjonelle effekter på micturition i både PO og CPO-mus 1 uke etter operasjonen.

selv Om hindring i CPO mus ble demonstrert på 1 uke, effekter av obstruksjon ble løst av 4 uker. VSOP gjort på 4 uker post-obstruksjon viser at PO mus har vedvarende obstruktiv trekke mønstre med lavere maksimal annullert volumer enn CPO mus. På samme tidspunkt, CPO mus gjenopprette maksimal annullert volumer tilsvarende humbug kirurgi mus (figur 3A–C)., Det generelle mønsteret på VSOP av CPO mus har returnert til det normale, mens PO mus fortsette å demonstrere indiscreet sprøyting av urin som indikerer tap av blære-kontroll.

Blæren Ombygging følgende PO Er endret ved Kastrering

Vi fant at effektene på blæren funksjonen var korrelert med makroskopiske endringer i musen blæren på PO og CPO mus. På den tiden av musen offer på 4 uker følgende PO, humbug blærer dukket normal i størrelsen, men PO og CPO blæren var sterkt forstørret (Figur 2A,C–E)., Følgende disseksjon av blæren distale til blæren nakke ligatur, blærer ble uttrykt av urin og veies. Her fant vi økt blæren vekt i PO mus i forhold til både humbug kirurgi og CPO mus. CPO mus som ikke viser økt vekt i forhold til humbug kirurgi mus (Figur 2B). Histologic evaluering av blærer av disse musene ble utført med H&E farging og blære areal, omkrets, og tykkelsen ble sammenlignet., Både CPO og PO mus viste økt areal og omkrets i forhold til humbug kirurgi mus, noe som gjenspeiler endringer fra forhøyet blæren presset følgende PO (Figur 2F,H). Imidlertid økt blæren tykkelse var bare sett i PO-mus (Figur 2G). Dette er forbundet med lavere blæren vekter i CPO mus, noe som tyder på at økningen i blæren størrelse er først og fremst å «strekke» av blæren muskler i motsetning til ekte blæren muskel hypertrofi eller hyperplasi.

Blæren Fibrose Øker følgende Delvis Blæren Outlet Obstruksjon

for å undersøke om økningen i blæren masse og blære veggtykkelse skyldtes utelukkende muskulær hypertrofi/hyperplasia eller hvis en komponent av fibrose var involvert, histologic undersøkelse av humbug, PO, og CPO musen blærer ble utført på 4 uker følgende obstruksjon. Dette ble gjort for å utnytte både Masson trichrome farging samt fibrose markør-spesifikke immunfluorescens (Figur 4)., Som forventet, i PO mus, følgende hindringen, den blærer ble funnet å ha økt Col/SM-forhold. Med kastrering, økt Col/SM-forhold ble ikke lenger funnet (Figur 4B). Selv om luminal blæren volumet økte i CPO mus, muskuløs lag ikke viser hypertrofi som gjenspeiles av å ha den samme blæren veggtykkelse som humbug kirurgi mus. Videre evaluering av fibrose spesifikke markører Vimentin, Col1a1 og FSP-1 ved immunfluorescens vist økt uttrykk i PO mus i forhold til virkning og mus, med en tilsvarende nedgang i uttrykk i CPO mus., Det ser ut til at kastrering skaper forhold som ikke-fibrotic blæren ombygging oppstår, og argumenterer for en potensiell rolle av testosteron spesielt i formidling en fibrotic svar til blæren skade.

Innføring av Eksogene Testosteron Reverserer den positive Effekten av Kastrering følgende Delvis Blæren Outlet Obstruksjon

Vi har vist at kastrering i innstillingen av IO vil bidra til å dempe post-obstruktiv ombygging i forhold til blæren hypertrofi/hyperplasi og fibrose. For å demonstrere at dette er en testosteron-spesifikk reaksjon, etter kastrering, en kohort av mus gjennomgikk PO og testosteron tilskudd. Her brukte vi enten testosteron eller redusert produktet dihydrotestosteron (DHT)., DHT har 10 ganger tilhørighet til androgen reseptor sammenlignet med testosteron og ikke aromatized til østrogen, noe som reduserer sannsynligheten for at endringene som skjer fra testosteron tilskudd er på grunn av økende østrogen nivåer. Maks annullert volumer som bestemmes av VSOP var betydelig lavere i CPO pluss testosteron (CPOT) eller CPO pluss DHT (CPOD) mus sammenlignet med CPO mus (Figur 5A). Makroskopiske og mikroskopiske endringer sett i PO-mus (men ikke CPO mus) dukket opp igjen i CPOT og CPOD blærer., Blæren vekter ble vesentlig økt i CPOT og CPOD mus i forhold til CPO mus (Figur 5B). CPOT og CPOD blærer hadde også økt Col/SM forholdstall i forhold til CPO (Figur 5D). Fibrose markører ble også økt i CPOT og CPOD i forhold til CPO blærer som var reaksjonen til Masson er trichrome flekken (Figur 5C,E). Disse funnene viser at eksogene utskifting av testosteron i kastrert hann mus fullt restaurert patologisk virkninger av obstruksjon til urin blæren., I sum, effekten av kastrering og testosteron erstatning sterkt støtte en rolle for mannlige androgen i patogenesen av blæren obstruksjon.

Diskusjon

Gutter som er født med PUV gjennomgå kirurgisk reseksjon av obstruktiv brosjyrer kort tid etter levering. Imidlertid, til tross for å lindre blæren outlet obstruksjon i disse barna, mange pasienter med PUV gå videre til blæren forverring som krever ren intermitterende kateterisering tilstrekkelig til å tømme blæren (3). Disse endringene ble ofte sett på følgende puberteten., Den kliniske endringer i pasienter med avkappede ventiler tidligere var knyttet til fysiologiske endringer knyttet til oppvekst, slik som økt urin filtrering og ikke til hormonelle endringer (1, 5, 9). Men våre funn tyder på at androgen kan spille en viktigere rolle enn tidligere verdsatt. Vi finner at tilstedeværelsen eller fraværet av androgen spesielt påvirker celleforandringer som oppstår etter at hindringen, spesielt fibrose.,

Informasjon fra studier som testosteron ble supplert i pasienter med lavere urin-skrift sykdom kan gi innsikt om effekter av androgen på blæren sykdom. Disse dataene er relativt sparsom, kommer i stor grad fra retrospektiv eller prospektive observasjonelle studier og studier som testosteron ble administrert til hypogonadal eller eugonadal menn. Men disse studiene tyder på at testosteron tilskudd ikke forverrer LUTS (10, 11)., Spesielt, flere studier har vist en forbedring i IPSS score i menn motta androgen tilskudd, selv om mange av disse ikke spesielt studere menn med kjent blæren outlet hindring, men heller inneholde en kohort behandlet med testosteron tilskudd og ha varierende grader av LUTS ved baseline. En studie ekskludert pasienter med kjent blærehals hindring. Koritsiadis et al., gjorde spesielt sammenligne symptomer og urodynamiske parametere på press-flow studier av hypogonadal og eugonadal menn og funnet serum testosteron nivå til å være negativt korrelert med detrusor press på maks flyt, men ikke IPSS eller andre urodynamiske parametre (12).

effekten av testosteron på blæren detrusor muskelen har også vært studert i dyremodeller. Tek og kolleger fant at testosteron tilskudd av kirurgisk kastrert rotter resultert i en redusert kollagen til glatt muskel-forhold og økt cystometric kapasitet (13). Shortliffe et al., (14) fant at testosteron erstatning i kirurgisk kastrert rotter var også forbundet med økt blæren glatt muskulatur samt økt blæren masse (14). Sammen disse studiene tyder på at uhindret rotter, testosteron stimulerer detrusor glatt muskel vekst gjennom en fortsatt uklart mekanisme. I en iskemi-reperfusion blæren skade modell i male, kaniner, Chuang et al. vist at kastrering var beskyttende ved å redusere blæren fibrose og redusert uttrykk av ulike fibrose-relaterte markører (8)., Testosteron tilskudd av disse kastrerte kaniner førte til økt detrusor fibrose følgende blæren skade. Våre funn speil disse funnene, og representerer den første studien av effekten av testosteron på responsen til blæren skade fra PO i juvenile mus.

På samme tid, paucity av funn i litteraturen gjort oss overrasket ved vårt første funn. En mulig bekymring vi hadde var at musene var ikke i tilstrekkelig grad hindret og at våre funn i kastrert mus representerte en gruppe som obstruksjon rett og slett ikke skje., I enden, vet vi at dette er ikke sant fordi blærer i CPO-gruppen i utgangspunktet hadde trekke flekker som hindret gruppe, hadde unormal presset av cystometry, og hadde remodeled blærer. Faktisk, blærer fra CPO mus var svært annerledes enn shams, noe som indikerer at IO kirurgi produsert dyptgripende virkninger. Vår tolkning av disse funnene er at i timene etter operasjonen, blodtrykket øker i blæren veggen, og at det i normale mus, collagens og andre strammere matriser er konstruert for å hindre rupturing av blæren i magen., Blærene fra CPO mus hadde svært lite nedfall av kollagen i detrusor muskelen, men på samme tid, ble svært store med tynne vegger. Det er mulig at når fibrotic svar er svekket i et høyt trykk blæren, det strekker seg for å imøtekomme urinen som dannes. Dette er typisk for hva vi har observert i CPO, men ikke PO og CPOT blærer. Dermed kan vi oppfatte hva andre tenker at rollen av testosteron kan spesielt være i formidling av fibrose i blæren veggen.,

Mens vårt arbeid spesielt brukt en blære-modellen til å bestemme rollen av testosteron på muskel fibrose i respons til glatt muskel skade, tror vi at denne forskningen vil vise seg å være viktig i mange fibrotic sykdom prosesser som har sex association. Faktisk, dette har blitt støttet av noen få studier i litteratur. Cho et al. vist at orchiectomy svekket nyre-fibrose sett etter ureteral obstruksjon. I en mus modell av ensidig ureteral obstruksjon, nyrer fra mannlige mus viste økt uttrykk av alfa-SMA-og kollagen deponering (15)., Lik vår blæren modell av obstruksjon, dette fibrotic svar ble minimert hvis samtidig orchiectomy ble utført med ureteral obstruksjon. Tilsvarende funn ble rapportert i en mus modell for hjerte fibrose sekundært til press overbelastning. Her, fibrotic endringer i venstre ventrikkel ble oppveid av orchiectomy. Dette inkluderte en blunting av TGFß signaliserer vei, kjent for å være viktig for å fremme myofibroblast differensiering (16). Alder-relaterte hjerte-og nyre fibrose ble også svekket av orchiectomy i mannlige mus (17)., Videre, i en studie av Zhu og kolleger, androgen reseptor på vaskulære glatte muskelceller var innblandet i testosteron-stimulert glatt muskulatur forkalkning. Ved hjelp av en vaskulær glatt muskulatur celler avledet fra en glatt muskel-spesifikke androgen reseptor knockout-mus, forkalkning var avstumpet i respons til testosteron behandling sammenlignet med vill-type glatte muskelceller (18). Dermed er det et økende antall studier, inkludert oss, er å finne en sammenheng mellom testosteron og patologiske forandringer assosiert med fibrose.,

mekanismen bak rollen av testosteron i modulerende detrusor reaksjon på skade er fortsatt uforklart. Videre arbeid med å undersøke nedstrøms effekter av testosteron i detrusor muskelen kunne avsløre roman terapeutiske mål som kan benyttes til å forhindre, eller i det minste forbedre ugunstig vev ombygging sett i innstillingen av PO. I tillegg, dose–respons studier kan gjennomføres for å avgjøre i hvilken serum konsentrasjoner av testosteron fører til ugunstig remodeling. Østrogen har vist seg å dempe vev hypoksi og tilhørende detrusor skade i dyremodeller., Videre studier av samspillet mellom testosteron og østrogen i modulerende detrusor muskelen reaksjon på skade kan også bidra til å ytterligere belyse denne veien.

Konklusjon

Juvenile mannlige mus med delvis blæren outlet obstruksjon har mindre høyt trykk blærer som er fibrotic. Kastrering var assosiert med større annullert volum, lavere blæren vekt, og mindre detrusor fibrose. Utskifting av testosteron i castrate mus reversert disse effektene., Dette indikerer at testosteron spiller en rolle i å endre endringer til detrusor muskelen etter en delvis blæren outlet obstruksjon i mus. Derfor foreslår vi at økte nivåer av testosteron i gutter med PUV kan bidra til redusert blære funksjon.

Etikk Uttalelse

Denne studien ble utført i samsvar med anbefalinger fra kirurgisk retningslinjer, Dyr Omsorg og Bruk Komiteen. Protokollen ble godkjent av Dyr Omsorg og Bruk Komiteen.

Forfatter Bidrag

AF, PF, DB, NK, og GS datainnsamling og analyse., AF, PF, RD, og EG konsept, design, og manus du skriver.

interessekonflikt Uttalelse

forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller finansielle forhold som kan oppfattes som en potensiell interessekonflikt.

Midler

Denne forskningen ble støttet av midler fra Hartwell Tilknytning til F.EKS.