Integrert membranproteiner

Integrert membran proteiner (IMPs) fungere som innfallsport til cellene. Alle celler og organeller er innkapslet i en ugjennomtrengelig lipid bilayer og Smådjevler vi studerer er innebygd i disse membraner. De er oppføring og exit ruter for mange ioner, næringsstoffer, avfallsstoffer, hormoner, medisiner og store molekyler som proteiner og DNA. De er også ansvarlig for mye av kommunikasjonen mellom cellene og deres miljø., Celler kan gjøre en stor rekke av disse proteiner, omtrent 30% av gener i det menneskelige genom koden for membranproteiner, og likevel vet vi relativt lite om disse molekylene.

membranproteiner er dessverre svært vanskelig å håndtere og studier siden de er designet for å sitte i den hydrofobe miljø av lipid bilayer. De har en tendens til å være ustabilt når det ut fra sitt eget miljø, og vi er nødt til å legge vaskemidler til å dekke den hydrofobe overflater., For å forstå og kontrollere funksjonen til disse proteinene er det viktig å ha informasjon om deres tredimensjonale struktur, som er vanligvis oppnås ved X-ray crystallography. Imidlertid problemer med håndtering av disse proteinene har gjort det vanskelig å løse strukturer, og til dags dato er det færre enn 300 strukturer av membranproteiner kjent, mindre enn 0,5 % av alle kjente strukturer. For høyere eukaryotes historien er enda mer utpreget, med bare 20 konstruksjoner av menneskelig Smådjevler og mindre enn 50 mammalske Smådjevler løst., Membranproteiner er derfor en av de viktigste gjenværende frontiers av strukturell biologi forskning. På SGC vi er nå å bruke vår state-of-the-art høy gjennomstrømning metoder for å overvinne flaskehalser i membran protein forskning, slik at vi kan sikkert levere ren membran protein prøver og strukturer av disse fascinerende og medisinsk kritisk molekyler.

Medisinsk betydning

Den medisinske betydningen av denne enorme familie av proteiner kan ikke overvurderes., Mutasjoner i membranproteiner er involvert i mange vanlige sykdommer, blant annet hjerte-og karsykdommer, hvor feil ion-tv er ofte innblandet. Medikamenter rettet mot å kalsium-tv kan kontrollere problemer som høyt blodtrykk og angina. Membranproteiner er involvert i kreft, der feil i samband trasé kan føre til cellene dele ut av kontroll. Ofte bestemt membranproteiner er overproduced i kreftceller, og er derfor et mål for medikamentell behandling. Sykdommer i hjernen som for eksempel migrene, depresjon og Alzheimers er alle knyttet til problemer med transportører og tv., Cystisk fibrose er forårsaket av mutasjoner i cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) gen som koder et klorid ion-kanal.

Siden mange membranproteiner sitter på overflaten av celler, de er lett tilgjengelig for små molekyl legemidler som sirkulerer i blodet. Det er derfor ikke overraskende at over 50% av små molekyl stoffene binder seg til proteiner i membranen. G-protein koblede reseptorer og tv er spesielt viktig i denne sammenheng, men ABC-transportører og oppløst stoff bærere er også mål for medikamentell behandling., Vår forståelse av mange andre sykdommer, og vår evne til å behandle disse sykdommene ville ha stor nytte av mer strukturell og funksjonell informasjon på proteiner som er involvert. Vi håper at ved å løse strukturer av disse proteinene, forstå de underliggende biokjemi og interaksjoner med substrater og hemmere, kan vi gi mer effektive behandlinger for mange sykdommer.

De SGC og integrert membranproteiner

SGC har lang erfaring i å løse strukturer av løselig menneskelige proteiner ved hjelp av svært effektiv, høy gjennomstrømning systemer., I de to siste årene har vi tilpasset disse metodene for å løse strukturer for menneskelig membranproteiner. Vi har vist 186 menneskelige membranproteiner fra ulike familier, velge en serie av konstruksjoner for hvert protein, identifisere egnede rengjøringsmidler for rensing og deretter skalere opp purificaiton og krystallisering disse proteinene. Vi har utkrystallisert 3 membranproteiner og løste vårt første struktur, en prosess som tok mindre enn to år fra første klone til struktur.,

Vi har løst den første strukturen av et menneske ABC transporter, en klasse av proteiner som er involvert i små molekyl transport, multi-resistens og sykdommer som cystisk fibrose og diabetes. Vår første vellykkede målet er den menneskelige mitokondrie ABC transporter, ABCB10, som er innebygd i den indre membranen i mitokondriene. ABCB10 er overexpressed under erythroide differensiering, og den prosessen som danner røde blodlegemer. det er overexpressed i beinmargen, hjerte og lever., Det er nå dokumentert at når ABCB10 uttrykk er redusert i celler, de er mer utsatt for oksidativt stress og at ABCB10 kan være involvert i å beskytte hjertet under et hjerteinfarkt.

Teknologier for å studere Smådjevler

Vi er utvikling av generiske metoder som gjør det mulig for høy gjennomstrømning fastsettelse av strukturer i menneskelig membranproteiner. Vi valgte baculovirus/insekt celle uttrykk system som gir et lipid sammensetning nær det av humane celler og er en påvist høy gjennomstrømning plattform., For hvert mål protein genererer vi en rekke konstruksjoner av varierende lengde og forskjellige affinitet koder, inkludert full lengde genet og en rekke truncations å fjerne potensielt uordnede regioner. En høy gjennomstrømning uttrykk skjermen brukes til å identifisere proteiner som kan brukes til å rense milligram mengder av SMÅDJEVLER for krystallisasjon. Hvert protein er først renset i dodecyl maltoside (DDM) vaskemiddel og er senere vist for stabiliteten i en rekke forskjellige vaskemidler til å identifisere den optimale forhold for stabilitet og krystallisasjon.,

Vi har etablert metoder for høy gjennomstrømning nanodrop krystallisasjon og manipulasjon av skjøre membran protein krystaller. Vi har utviklet effektive systemer for screening av membran protein krystaller for diffraksjon kvalitet som en metode for krystallisasjon tilstand optimalisering. Vi har også optimalisert vår datainnsamling og analyse av diffraksjon data ved hjelp av intens synchrotron microfocus beamlines, tilgjengelig på ressurser som Diamant lyskilde Ltd, i Oxfordshire., Der det er mulig krystallisasjon er utført med bundne ligander og hemmere for å ta et enkelt native konformasjon og gi viktige innsikter i funksjon and drug design. Vi planlegger også å generere antistoffer fragmenter mot våre renset protein for bruk som affinitet reagenser og krystallisasjon av aids.