– Medium-chain-fettsyrer reduserer serum kolesterol via reduksjon av intestinal gallesyre reabsorpsjon i C57BL/6J mus

Dyr og dietter

Mannlige C57BL/6 J mus (4 uker gamle, n = 80) ble kjøpt fra Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (Lisens Nr. SCXK: JING2009–0007) og ligger i et temperert rom (22 ± 2 °C, 40% til 60% luftfuktighet) med en 12-h lys/mørke-syklusen., Dyr Omsorg og Bruk Komiteen av den Kinesiske PLA General Hospital godkjent alle eksperimentelle prosedyrer.

Mus ble fôret med en basal kosthold (AIN-93G kosthold, kjøpt fra Academy of Military Medical Science) i løpet av den første uken for tilpasning. Ti mus ble tilfeldig valgt og matet en basal kosthold som vanlig kontroll, og de resterende mus ble fôret med en kolesterol-rik (CR) kosthold endret fra AIN-96G kosthold. Blodprøver ble samlet inn fra mandibular venøs plexus to uker senere., Mus med serum TC nivå som var 2 standardavvik større enn normal kontroll (som står for 67% av mus matet CR diett) ble randomisert til tre grupper (n = 12 i hver gruppe). Hver gruppe ble matet en annen diett for 16 uker (Tabell 1): kolesterol-rik og medium-chain triglyserider (CR-MCT), kolesterol-rik og lang-chain triglyserider (CR-LCT) eller CR. Nisshin Oillio (Tokyo, Japan) donerte MCTs (C8:0 og C10:0) og LCTs (long-chain triglyserider, soyaolje). Kolesterol ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)., Beijing Institute of Nutrition Ressurser (Beijing, Kina) målt fatty acid komposisjoner av CR-MCT-og CR-LCT-dietter (Tabell 2). Kroppsvekt og fôrinntak ble overvåkes ukentlig.,

Blod, huden, galle og avføring prøvetaking

Fem mus ble valgt ut tilfeldig fra hver gruppe etter 16 uker med fôring å spille inn kosthold inntak og avføring utskillelse ved å bruke en egen metabolske bur for 3 dager., Avføringen var lyofiliserte, veid, pulverisert, og lagret ved − 80 °C for videre analyse. Alle mus ble fastet over natten (ca 12 h) før blodprøve samling fra aorta ventralis under anestesi (xylazine hydroklorid). Serum ble samlet inn etter sentrifugering av blodprøver. En microcapsule ble brukt til å stikke hull i veggen i galleblæren og trekke ut galle, og hver galle eksempel var sentrifugerte på 16 000 g i 30 min. Supernatanten ble samlet inn og lagret ved − 80 °C., Huden vev ble excised og skylles med is-kaldt saltvann, og deler ble umiddelbart lagret ved − 80 °C for videre analyse.

Måling av serum som kalles lipid-profiler

Serum TC og triglyserider (TG) ble fastsatt ved slutten av forsøket ved hjelp av kommersielle kits fra Wako (Osaka, Japan). High-density lipoprotein-kolesterol (HDL-C) og low-density lipoprotein-kolesterol (LDL-C) ble målt ved hjelp av sediment metoder og et kommersielt kit fra Abcam (Cambridge, UK). Serum total gallesyre (TBA) ble målt ved hjelp av et kommersielt kit fra Blue Gene (Shanghai, Kina)., Alle produsentens instruksjoner var strengt fulgt.

Analyse av galle syrer i avføring og galle ved hjelp av HPLC-MS

metodene for utarbeidelse og fastsettelse av galle syrer i avføring og galle ble utført i henhold til våre tidligere studier og rapporter fra Steiner et al. . Et Shimadzu LC-20 AD høy ytelse væske-kromatografi-systemet (Shimadzu, Kyoto, Japan) som er koblet til en Anvendt Biosystecm 3200 Q FELLE mass spectrometer med en electrospray ionisering (ESI) kilde (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) ble brukt. Den HPLC-og MS-systemer ble kontrollert ved hjelp av Analytiker 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., De nevnte materialer ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Primære galle syrer, inkludert CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA og GCDCA, og sekundær galle syrer, inkludert DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA og GDCA, i galle og avføring var bestemt av retensjonstider.

Kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR)

Prøver fra tynntarmen vev (ca 100 mg) ble vasket med iskald PBS og homogeniserte. Total RNA fra vev og celler ble isolert ved hjelp av Trizol reagens (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, nei. R6812). Primere som ble utformet ved hjelp av Primer Express-3.,0 programvare basert på mRNA-sekvenser fra en database (Tabell 3) og syntetisert av Invitrogen (Beijing, Kina). Metoder for RNA-ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR) er beskrevet i våre tidligere publikasjoner. qRT-PCR ble utført ved hjelp av en Trinn SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit (Takara Bioteknologi Co. Ltd., Dalian, Kina). Forsterkning ble utført ved hjelp av en BIO-RAD iCycler Thermal Cycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). I forhold mRNA uttrykk-nivå ble bestemt ved bruk av komparative kritisk terskel (Ct) – metoden (i et eget rør)., Den husholdningsgen β-actin ble brukt som en kontroll for normalisering.

Western blot analysen

Western blot analyser av tynntarmen vev og celler dyrket i kultur ble utført som beskrevet tidligere . Tilsvarende mengder av protein fra hver prøve ble forberedt og separert ved hjelp av SDS-PAGE (12% gels), etterfulgt av electrotransfer til PVDF membran., Membraner ble inkubert med å blokkere løsning (Tris-bufret saltvann, 8% ikke-fett tørr melk) for 2 h etterfulgt av inkubasjon med spesifikke antistoffer ved 4 °C over natten. Membraner ble vasket grundig i TBST (Tris-bufret saltvann med Tween, inneholder 0,5% Tween-20 i TBS) og inkubert med pepperrot peroksidase-conjugated sekundær antistoffer i TBST for 1 h. Membraner ble vasket videre i TBST, og band som ble oppdaget ved hjelp av chemiluminescence deteksjon agenter. Blot densitometry ble utført, og båndene ble analysert ved hjelp av ImageJ programvare., Antistoffer rettet mot apical sodium avhengige av gallesyre transporter (ASBT), ileal gallesyre bindende protein (jeg-BABP) og organisk oppløst stoff transporter α/β (Osta/β) ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK). Sekundær antistoffer mot geit IgG ble innhentet fra Solen Biomedical Technology Co. (Beijing, Kina).

Immunfluorescens

Huden vev fast med 4% bufret paraformaldehyde var innebygd i parafin, og 4-mikrometer tykke seksjoner var forberedt. Seksjonene var deparaffinized ute i 3% H2O2 i 15 min for å blokkere endogene peroksidase., Seksjonene ble vasket i PBS og inkubert med en anti-jeg-BABP antistoff i PBS (1:50 fortynning) for 1 time ved 37 °C. EN FITC-conjugated (fluorescein) antistoff ble lagt på en 1:50 fortynning og inkubert i 0,5 h ved 37 °C. Seksjoner ble vasket, og PI (propidium jodid) ble brukt til å farge kjerner. Jeg-BABP var avbildes ved hjelp av en fluorescens-mikroskop (BX60, Olympus, Ina, Japan). Jeg-BABP ble observert som en grønn fluorescens, og kjernen ble observert som rød fluorescens .,

Caco-2 cellekultur

Caco-2 cellelinje ble innhentet fra Cellen Resource Center, Peking Union Medical College (som er hovedkvarteret til den Nasjonale Infrastrukturen av Celle-Linje Ressurs) i September. 20, 2016. PCR og kultur bekreftet at cellen linje ble sjekket fri for mycoplasma forurensning. Artene som er opphavet til disse cellene ble bekreftet ved hjelp av PCR. Identiteten til den cellen linje ble autentisert bruker STR profilering (FBI, CODIS) . Alle resultatene er tilgjengelig på nettstedet (http://cellresource.cn)., Caco-2 celler ble dyrket i Dulbecco ‘s modified Eagle’ s medium (DMEM) som inneholder 10% foetal bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, og 1% non-essential-amino syrer. Caco-2 celler ble opprettholdt ved 37 °C i en humidified atmosfære som inneholder 5% CO2 og 95% luft. Mediet ble forandret hver 2 dager. Den DMEM, FBS, 1% ikke-essensielle aminosyrer, og andre materialer ble kjøpt fra den Nasjonale Infrastrukturen av Celle-Linje Ressurs (Beijing, Kina) eller Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).,

Caprylic syre permeabilitet analysen gjennom Caco-2 celle monolayers

For gallesyre reabsorpsjon eksperimenter, med henvisning til rapporten fra Y. Wang, et al. cellene ble plantet og dyrket på Millicell Hengende cellekultur Innlegg (0.4 µm, Millipore, Molsheim, Frankrike) for 21 dager å få confluent og svært differensiert celle monolayers. Dannelsen av funksjonelle epithelial monolayers ble overvåket via måling av transepithelial elektrisk motstand (TEER) ved hjelp av en Millicell-ERS meter (Millipore) før eksperimenter., Cellenes morfologi ble observert ved hjelp av et elektronmikroskop, og permeabilitet ble fastsatt ved hjelp av Lucifer Gul (Sigma, MO, USA) som en markør.

utarbeidelse av fettsyrer og CA ble utført som beskrevet av X. Zhang, et al. . Fettsyrer og CA ble målt og oppløst i etanol, så ble fortynnet med cellekultur medium som inneholder 20 mg/L endotoksin-gratis BSA til en endelig konsentrasjon på 50, 100 eller 200 µmol/L (etanol< 0.1%). Oppløst fettsyrer og CA var inkubert i et vannbad ved 37 °C i 1 t før tillegg til cellene., Caprylic syre (C8:0), capric syre (C10:0), stearinsyre (C18:0) og oljesyre (C18:1), ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

apical (AP) og basolateral (BL) sider av monolayer ble vasket med Hank ‘ s Balanced Salt-Løsning (HBSS) og likevekt i serum-gratis komplett medium for 15 min. Mediet i AP ble erstattet med frisk middels inneholder CA (200 µmmol/L) eller blandet med en av fettsyrer (C8:0, C10:0, C18:0 eller C18:1) på 50, 100 eller 200 µmol/L., Celleviabilitet av Caco-2 celler i ulike forhold ble vurdert av WST-1 celle cytotoksisitet analysen (Fig. 1). Medium med en av fettsyrer ble definert som «C8:0, C10:0, C18:0 eller C18:1 gruppe». Den «kontrollgruppen» inneholdt ingen fettsyrer, og «tom gruppe» manglet CA og fettsyrer. Kun ferske medium ble brukt i BL. Media fra AP og BL sider ble fjernet 2 h senere og lagret for analyser av CA ved hjelp av HPLC-MS, Relativ permeabilitet (Papp) ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ er sammensatt utseende i mottakeren rom, dt er tiden, C0 er konsentrasjonen i donor-kupé, og A er arealet av sett inn).

jeg-BABP uttrykk nivåer i Caco-2 celler

Caco-2 celler ble seedet inn i en 6-brønns plate (Corning, NY, USA) og kultivert til total samløpet med høy differensiering for å bekrefte virkningene av MCFAs på jeg-BABP . Kultur medium ble erstattet før eksperimenter med medium som inneholder delipidized FBS for 24 h., Cellene ble vasket med iskald fosfat-fosfatbufret saltløsning (PBS) og inkubert med fersk medium som inneholder CA 200 µmol/L (definert som CA-gruppen) eller CA blandet med en av fettsyrer (C8:0, C10:0, C18:0 eller C18:1) ved 200 µmol/L (definert som «C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA eller C18:1+CA konsernet») eller C8:0 eller C10:0 200 µmol/L uten CA (definert som «C8:0-gruppe og C10:0-gruppe») for 24 h. Og tom-gruppen var uten fettsyrer og CA. Mediet ble fjernet, og cellene ble vasket tre ganger med iskald PBS., Total RNA og protein ble isolert og samlet inn for videre analyser av jeg-BABP mRNA og protein uttrykk nivåer.

Statistiske analyser

Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Data ble analysert ved hjelp av en-veis analyse av varians etterfulgt av uavhengig t-test for å fastslå betydningen av forskjell mellom grupper ved hjelp av SPSS programvare versjon 17.0. P < trinn på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.