Utviklingen av Deep-Sea Gulper Ål Mitokondrie Forsikring: omfattende Genet Rearrangements Stammer I Ål

Abstrakt

Nylige studier har vist at avvik fra den typiske virveldyr mitokondrie-genet ordre er hyppigere enn opprinnelig trodde., Slike avvik, men er mindre, med inversjon og/eller translocations av noen gener være involvert og tandem duplisering av genet regioner etterfulgt av sletting av gener har blitt brukt som mekanismer opprinnelse i slike nye genet for., I løpet av molekylære fylogenetisk studier på Elopomorpha (ål og deres allierte), fant vi ut at mitokondrienes genomer (mitogenomes) fra de to deep-sea gulper ål, Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) og Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), viser et identisk gen for noe som i stor grad skiller seg fra alle andre vertebrater. Fylogenetisk analyse ved hjelp av mitogenomic data fra 59 arter av fisk ikke bare bekreftet en single origin av et slikt gen bestill med tillit, men også indikert at det hadde blitt hentet fra den typiske virveldyr genet for., Detaljerte sammenligninger av gulper ål genet for at typiske vertebrater foreslått at forekomsten av et enkelt steg, stor-skala duplisering av genet regionen som strekker seg >12 kb, etterfulgt av slettinger av gener i en felles stamfar av to arter, de fleste parsimoniously kontoer for denne uvanlig genet arrangement.

Innledning

Virveldyr mitokondrie-genet ordren ble i utgangspunktet regnet som konservativ fordi den komplette nukleotide-sekvenser av mitokondrie genomer (mitogenomes) fra pattedyr (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981) og den Afrikanske klorte frosk (Roe et al. 1985) viste en felles gen for. Som komplett mitokondrie DNA (mtDNA) sekvenser har blitt fastsatt for en rekke av vertebrater (269 arter som av 11. juni 2003, Nasjonalt Senter for Bioteknologi Informasjon Web-område: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), det har vært anerkjent at avvik fra den typiske genet for ikke så sjelden i vertebrater (fig. 1; Boore 1999). Med unntak av placental pattedyr, eksempler inkluderer alle store linjene av vertebrater som lampreys (Lee og Kocher 1995), amfibier (Macey et al. 1997; Sumida et al., 2001), reptiler (Kumazawa og Nishida 1995; Quinn og Mindell 1996; Macey et al. 1997), fugler (Desjardins og Morais 1990, 1991; Quinn og Wilson 1993; Mindell, Sorenson, og Dimcheff 1998), marsupials (Pääbo et al. 1991; Janke et al. 1994), og fisk (Miya og Nishida 1999; Inoue et al. 2001b; Miya, Kawaguchi, og Nishida 2001). Slike gen rearrangements, imidlertid, er lokale (særlig innen en klynge av tRNA-gener), og ingen eksempel har blitt funnet som innebærer genom-skala rearrangements.,

Gulper ål er godt kjent deep sea skapninger, inkludert kollektivt fire familier plassert i den rekkefølgen Saccopharyngiformes, som oppstår på bathypelagic dyp (>1000 m) i hele verdens hav (Bertelsen, Nielsen, og Smith 1989). Deres bisarre utseende (fig. 1), som er et resultat av svært forstørret, deformert gapes på tuppen av ål er snake-lignende hode og kropp, har tiltrukket seg mye oppmerksomhet fra mange forskere (f.eks, Bertelsen, Nielsen, og Smith 1989; Robins 1989)., Slike spesialiserte anatomiske trekk har ledet etterforskerne til å anta at den fylogenetisk posisjoner av disse dyrene er utenfor beinfisk (f.eks., Tchernavin 1946), selv om de har generelt blitt ansett for å være nære slektninger av den sanne ål (for Anguilliformes), fordi de har en blad-som leptocephalous larval scenen (Greenwood et al. 1966; Inoue og Miya 2001).,

i Løpet av molekylære fylogenetisk studier av Elopomorpha (ål og deres allierte) ved hjelp av mitogenomic data, vi fant en uvanlig mitokondrie genet for en av de gulper ål, Eurypharynx pelecanoides (fig. 1). Denne artikkelen beskriver romanen genet organisasjon i mitogenomes av to arter av gulper ål, E. pelecanoides og Saccopharynx lavenbergi. Vi ansatt en polymerase chain reaction (PCR)-basert tilnærming som er utviklet av Miya og Nishida (1999) for sekvensering av hele mitogenomes av disse fiskene., Å utforske opprinnelsen av slike unike mitogenomes, vi utsatt den mitogenomic data til fylogenetisk analyse, og vi diskuterer her mulige mekanismer som genererer et slikt gen-arrangement i to gulper ål.

Materialer og Metoder

Prøver

Mitokondrie DNA-sekvenser ble innhentet fra seks personer fra to arter som representerer to familier i den rekkefølgen Saccopharyngiformes (Robins 1989). For monotypic familie Eurypharyngidae, ett individ av E., pelecanoides ble brukt som en prøve for påvisning av komplett mtDNA-sekvens, og de fire andre personer, inkludert to leptocephalous larver, ble brukt for fastsettelse av delvis sekvenser av fire store genet veikryss (fig. 2) for å bekrefte genet for i E. pelecanoides mitogenome. For familien Saccopharyngidae, et enkelt individ av S. lavenbergi ble brukt som en prøve for påvisning av komplett mtDNA-sekvens., Kupong prøver ble avsatt i fisk samlingene ved naturhistorisk Museum & Institute, Chiba, Japan (CBM-ZF), og ved University of Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, sørlige Japan; CBM-ZF 10312, 10313, 10316, og 10317: ekvatorial sentrale Stillehavet) og S. lavenbergi (UW 045633: Østlige Stillehavet).

DNA-Ekstraksjon

En del av epaxial muskulaturen (ca. 0.25 g) ble excised fra friske individer av hver art og umiddelbart bevart i 99.5% etanol., Totalt genomisk DNA ble ekstrahert ved bruk av Qiagen QIAamp tissue kit følge produsentens protokollen.

– Polymerase Kjede Reaksjon og Sekvensering

hele mitogenomes av to gulper ål ble amplifisert ved hjelp av en lang-PCR-teknikken (Cheng, Higuchi, og Stoneking 1994). Fem fisk-universal og tre arter-spesifikke lang-PCR-primere (S-LA-16S-L + H12293-Leu og L12321-Leu + S-LA-16S-H for E. pelecanoides; L2508–16S + Sala-ND4-H og Sala-CO1-L + Sala-ND1-H for S. lavenbergi; fig. 1) ble brukt til å forsterke hele mitogenome av hver ål i to reaksjoner., Hele mitogenomes av de andre fire E. pelecanoides personene var forsterket med tre fisk-universal primere og en art-spesifikke lang-PCR-primer (L2508–16S + Eupe-ND2-H og L12321-Leu + S-LA-16S-H). Fire arter-spesifikke primere (Eupe-ND2-H for E. pelecanoides; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H, og Sala-ND4-H for S. lavenbergi) var alternativt utformet med referanse til delvis nukleotide-sekvenser fra ND2-genet i E. pelecanoides og COI, ND1, og ND4 gener av S. lavenbergi bestemt fra hver totale DNA ved hjelp av fish-universal primere.,

Den lange-PCR-produktene ble fortynnet med TE-buffer (1:20) for senere bruk, så PCR maler, bortsett fra en region mellomliggende mellom de to lange-PCR-primere (mellom S-LA-16S-H og S-LA-16S-L, og H12293-Leu og L12321-Leu for E. pelecanoides; fig. 1), hvor total genomisk DNA ble brukt alternativt.

En total av 82 fisk-universal primere (Miya og Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d; Ishiguro, Miya, og Nishida 2001; Kawaguchi, Miya, og Nishida 2001) ble brukt i forskjellige kombinasjoner for å forsterke sammenhengende, overlappende segmenter av hele mitogenome for hver av de to artene. Arter-spesifikke primere som ble utformet i tilfeller der det ikke er hensiktsmessig fisk-universal primere var tilgjengelig. En liste av PCR-primere som brukes for en bestemt art er tilgjengelig fra J. G. I. på forespørsel. Lang-PCR og påfølgende PCR-reaksjoner ble utført som beskrevet tidligere (f.eks., Miya og Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

Dobbel-strandet PCR-produkter, renset ved hjelp av en Pre-Sekvensering Kit (USB), ble senere brukt til direkte syklus sekvensering ved å bruke farge-merket terminators (Applied Biosystems). Primerne som ble brukt var de samme som for PCR. Alle sekvensering reaksjoner ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Merket fragmenter ble analysert ved hjelp av en Modell 377 DNA sequencer (Applied Biosystems).

Sekvens Analyse

DNA-sekvenser ble analysert ved hjelp av dataprogrammet pakke program DNASIS versjon 3.2 (Hitachi Software Engineering)., Plasseringen av de 13 protein-kodende gener ble fastsatt ved sammenligninger av DNA eller aminosyre sekvenser av beinfisk mitogenomes. 22 tRNA-gener ble identifisert av sine cloverleaf sekundære strukturer (Kumazawa og Nishida 1993) og anticodon sekvenser. De to rRNA gener ble identifisert av sekvensen likhet og sekundær struktur (Gutell, Grå, og Schnare 1993). Sekvensen data er tilgjengelig fra DDBJ/EMBL/GenBank med tiltredelse tall AB046473 og AB046475–AB046490 for E. pelecanoides, og AB047825 for S. lavenbergi.,

Fylogenetisk Analyse

data-matriser fra Inoue et al. (2001d) og Miya, Kawaguchi, og Nishida (2001) ble kombinert og overflødig taksa ble eliminert. Mitogenomic sekvenser fra de to gulper ål og to teleosts (Gymnothorax kidako, AP002976 og Salmo salar, U12143 ) ble lagt til. Fordi entydig justeringer av de to rRNA gener på grunnlag av sekundær struktur modeller var ikke mulig (Miya og Nishida 2000), de ble ikke brukt i analysene., Den ND6 genet ble ikke brukt i fylogenetisk analyse på grunn av sin heterogene base sammensetning og konsekvent dårlig fylogenetisk ytelse (f.eks., Zardoya og Meyer 1996; Miya og Nishida 2000). Også, tRNA looper, tRNASer(AGY) (ustabil utledes sekundære strukturer i noen arter), og andre ambiguously justert regioner, slik som de 5′ og 3′ endene av flere protein-kodende gener, ble ekskludert form analysene., I tillegg, 3. codon posisjoner i protein-kodende gener som kan positivt villede en analyse av høyere nivå relasjoner av actinopterygians (Miya og Nishida 2000) ble ekskludert fra analysene, forlater 7,984 tilgjengelig nukleotid stillinger fra 12 protein-kodende gener og 21 tRNA-gener.

Bayesiansk fylogenetisk analyser ble utført ved bruk av MrBayes 2.01 (Huelsenbeck og Ronquist 2001)., Den generelle tid vendbar modell med enkelte områder som antas å være uforanderlige og med variabel områder antas å følge en diskret gamma fordeling (GTR + I + Γ; Yang 1994) ble valgt som den beste-fit-modellen av nukleotid substitusjon (ModelTest versjon 3.06; Posada og Crandall 1998). Vi satt maximum likelihood-parametere i MrBayes som følger: «lset nst = 6» (GTR), «priser = invgamma» (I + Γ), og «basefreq = estimat (antatt andel av base typer fra data). Den Markov chain Monte Carlo prosessen ble satt slik at fire kjeder (tre oppvarmet og en kald) gikk samtidig., Vi har gjennomført to uavhengige går for 1 million generasjoner, med trær blir samplet hver 100 generasjoner, som hver gang fra en tilfeldig treet. To uavhengige analyser konvergerte på lignende log-likelihood-score og nådd «stationarity» (manglende forbedring i ML score) på ikke senere enn 120,000 generasjoner., Dermed, den første 1,200 trær ble forkastet fra hver analyse, og de resterende 17,602 kombinert prøver fra to uavhengige analyser ble brukt for å generere en 50% flertallsstyre konsensus treet, med andelen av prøver å gjenopprette en bestemt clade som representerer den clade er posterior sannsynlighet (Huelsenbeck og Ronquist 2001).

Resultater

Genom Organisasjoner

Den totale lengde av E. pelecanoides og S. lavenbergi mitogenomes er 18,978 bp og 18,495 bp (med unntak for en del av den antatte kontroll regionen for S., lavenbergi), henholdsvis (se Utfyllende Materiale på internett). Den genom innhold av disse to gulper ål inneholder to rRNA, 22 tRNA, og 13 protein-kodende gener, som er funnet i andre vertebrater (fig. 2). Også som i andre vertebrater, er de fleste gener av disse to artene er kodet på H-strand, bortsett fra ND6 og åtte tRNA-gener. Alle funksjoner er like i lengden til de andre benete fisk med unntak av genet COI og kontroll regionen for E. pelecanoides og COI og cyt b gener for S., lavenbergi (ca 100, 800, 150, og 30 bp lenger enn de i andre benete fisk, henholdsvis).

E. pelecanoides mitogenome inneholder tre noncoding regioner lenger enn 200 bp (fig. 2, se også Supplerende Materiale på nettet; noncoding regionen og kontroll region ). Den nc1, som ligger mellom tRNASer(UCN) og tRNAAsp gener, og nc2, som ligger mellom tRNAAsp og COII gener, inneholder to og fire pseudogenes tilsvarende dårligere kopier av tRNAAsp genet, henholdsvis., En noncoding regionen (1,818 bp) ligger mellom cyt b og tRNAPhe gener ser ut til å svare til kontroll-regionen. S. lavenbergi mitogenome inneholder også tre noncoding regioner lenger enn 200 bp (noncoding regionen og kontroll regioner ). Nc, som ligger mellom tRNALeu(CUN) og ND5 gener, inneholder minst to pseudogenes tilsvarende dårligere kopier av tRNALeu(CUN) – genet., CR1 (992 bp), som ligger mellom to tRNA-genet klynger (TP og CHAT-områder), og CR2 (> 837 bp), som ligger mellom cyt b og tRNAPhe gener, ser ut til å svare til kontroll-regionen, og de har helt identiske sekvenser over 800 bp, noe som indikerer at de er under samordnet utvikling (se Kumazawa et al. 1998).

Med unntak av de to duplisert kontroll regioner (CR1 og CR2) i S. lavenbergi mitogenome, den mitogenomes fra de to deep-sea gulper ål har en identisk gen for (fig. 2)., Men, mitokondrie-genet rekkefølgen på de to gulper ål skiller seg sterkt fra alle andre vertebrater kjent for å date. Når noen tRNA-gener ble ekskludert fra sammenligninger (fig. 2), har vi identifisert fem genet blokker (A, tRNAGlu–tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; og E, tRNAArg–tRNASer(AGY) – genet regioner), genet rekkefølgen som er identisk med den som er typisk for vertebrater.,

Fylogenetisk Posisjoner av To Gulper Ål

Figur 3 er en 50% flertallsstyre konsensus tre av 17,602 kombinert prøver fra to uavhengige Bayesiansk analyse av 59 mitokondrie nukleotide-sekvenser fra sammensatte 12 protein-kodende (ingen 3. codon stillinger), pluss 21 tRNA-gener (stilk regioner) med GTR + I + Γ modell av sekvensen evolusjon (Yang 1994). Med unntak av noen få noder innenfor Neoteleostei, de fleste interne avdelinger ble støttet av høy Bayesiansk posterior sannsynligheter (≥95%)., Det bør bemerkes at den resulterende treet eksplisitt viser ikke bare at de to gulper ål danne en søster-gruppe forhold med en høy posterior sannsynlighet (100%), men også at de er dypt nestet innenfor Anguilliformes (sann ål), sterkt tyder på at de har blitt avledet fra en ål-som stamfar.

Diskusjon

Nylig, mer enn 140 komplett mtDNA sekvenser fra actinopterygian fisk har blitt fastsatt (f.eks., Miya og Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya, og Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya, og Nishida 2001; Miya, Kawaguchi, og Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003), og flere eksempler på genet rearrangements har blitt rapportert (fig. 1). Det bør bemerkes at slike gen omorganisering hendelser innebære noen gener og at genet arrangement av gulper ål mitogenomes skiller seg sterkt fra andre vertebrater.,

Fylogenetisk Implikasjoner på Opprinnelsen av nye Genet For

for Å utlede utviklingen av genet ordninger i de to gulper ål, slutning for forfedrenes organisasjon basert på en pålitelig fylogenetisk rammeverk er nødvendig. Selv om de gulper ål har blitt inkludert i Elopomorpha basert utelukkende på en tydelig pelagisk larval form, kalt leptocephalus, ingen har bekreftet at deres fylogenetisk plassering ved hjelp karakter matriser avledet fra morfologiske eller molekylære data (Inoue og Miya 2001).,

Bayesiansk analyse ved hjelp av mitogenomic data fra 59 arter som fullt ut representerer teleostean fisk mangfold (fig. 3) ikke bare bekreftet at romanen genet rekkefølgen på de to gulper ål har sitt utspring i en felles stamfar av de to artene, men også vist at deres opprinnelse ble uavhengig fra de andre roman genet bestillinger. Det ser også ut til at romanen genet for av havål titter myriaster, et annet medlem av Elopomorpha, har en origin-uavhengig av gulper ål., Det bør bemerkes at Anguilla japonica, som har den typiske virveldyr genet for, ble trygt plassert som en søster arter av to gulper ål. Den mest parsimonious rekonstruksjon av genet omorganisering hendelser på fylogenetisk tre indikert at den avvikende genet rekkefølgen på de to gulper ål er avledet fra det som er typisk for vertebrater.

Mulig Mekanisme for Genet Omorganisering i Gulper Ål

To viktige mekanismer har blitt foreslått for å forklare genet rearrangements i virveldyr mitogenomes (Lee og Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Den ene er tandem duplisering av genet regioner, som et resultat av sklei strand mispairing, etterfulgt av sletting av gener (Moritz og Brown, 1986; Levinson og Gutman 1987). Selv om dynamikken i mitokondrie-genet ordninger har ikke blitt forklart i noen virvelløse dyr (f.eks., Kurabayashi og Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et al. 2002), virveldyr mitokondrie-genet rearrangements kan vel forklares med en slik mekanisme (Desjardins og Morais 1990; Quinn og Wilson 1993; Kumazawa og Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson, og Dimcheff 1998; Miya og Nishida 1999; Inoue et al. 2001b), og dets gjennomførbarhet er også støttet av hyppige polymorf duplikasjoner av mtDNA sekvenser (f.eks., Stanton et al. 1994; Gach og Brown, 1997; Mindell, Sorenson, og Dimcheff 1998; Miya og Nishida 1999). De andre foreslåtte mekanismer påberope seg den illegale priming av replikering av tRNAs og den resulterende integrering av tRNA-gener rundt kontrollområdet (Cantatore et al. 1987; Jacobs et al. 1989).,

Selv om den andre modellen er ikke utelukket på dette punktet, er den første modellen er begunstiget som mekanismen av genet omorganisering i gulper ål mitogenomes. Forutsatt at et langt DNA-fragment i tRNAIle–CR-regionen i den typiske organisasjon er duplisert (fig. 4), påfølgende sletting av overflødig gener ville gi opphav til omorganisert genet organisasjon i gulper ål. Slik tandem duplisering og påfølgende sletting mest parsimoniously resulterte i den observerte genet for og tilhørende intergenic avstandsstykker i disse to gulper ål.,

Flere slettinger av overflødige gener syntes å være ufullstendig i de to gulper ål, på grunn av flere strekninger av noncoding sekvenser (fig. 2) oppstår rundt gener som er involvert i omorganisering (fig. 4). Selv om nc1 og nc2 i E. pelecanoides og nc i S. lavenbergi er sammensatt av gjentakende pseudogenes tilsvarende dårligere kopier av tilstøtende tRNA-genet, CR1 og CR2 i S. lavenbergi mitogenome har identiske sekvenser over 800 bp, og CR1 ligger på den antatte duplisert posisjon mens CR2 ligger på den opprinnelige plasseringen av kontroll-regionen., Denne observasjonen i S. lavenbergi mitogenome støtter konseptet av tandem duplisering og påfølgende sletting av hendelser som har forekommet i tRNAIle–CR-regionen (fig. 4).

Hvis fire av fem sammenhengende genet blokker ble duplisert sammen i en felles stamfar av de to artene, og hvis påfølgende sletting av gener som er oppstått før speciation, antatt duplisert deler av gulper ål, alt fra tRNAIle genet til CR av de typiske organisasjon, var strekker seg utover 12 kb (fig. 1)., Før denne studien, den antatte duplisert regioner av stadig kjent virveldyr omorganisering var 4 kb i beste fall. Dessuten, alle de kjente tandemly gjentatt kodende sekvenser var begrenset til områder i tilknytning til CR, IQM, eller WANCY regioner, muligens gjenspeiler sporadisk upresis avslutning av gjennomkjøringer utover deres opprinnelse. Det dupliserte regionen i gulper ål mitogenome var mye større enn noen gang-kjent virveldyr rearrangements og omfattet nesten hele mitogenome (fig. 1).

Vi takker kapteiner, offiserer, mannskap, forskere og studenter på styret i løpet av KT97-10 cruise<– –> R/V Tansei Maru og KH00-1 cruise-R/V Hakuho Maru for sin assistanse i å samle inn prøver. Denne studien kunne ikke ha vært mulig uten den sjenerøs donasjon av S. lavenbergi vevet materiale, som vi oppriktig takk E. O. Wiley. Vi vil også takke to anonyme lesere for deres verdifulle kommentarer til manuskriptet. Takk også på grunn av Y., Fukuyo, K. Furuya, K. Nanba, og høyere grads studenter ved Fiskeri Oseanografi Laboratory, University of Tokyo, for sjenerøst som lar oss bruke deres eksperimentelle fasiliteter, og Marshall Utgaver Ltd.; Andromeda Oxford Ltd.; og Tokai University Press for tillatelse til å bruke illustrasjoner og fotografier. K. Pearson ber gitt relevante opplysninger om identitet «S. lavenbergi» prøven. Denne studien ble støttet i en del av gir-i-bistand fra Departementet for Utdanning, Vitenskap og Kultur i Japan (Nr., 09740644, 10460081, 10660189, 11640705, 11691177, 12460083, og 12NP0201) og «Forskning for Fremtiden» Program Nr. Jsp-er-RFTF 97L00901 fra Japan Society for the Promotion of Science. K. T. ble støttet av Research Foundation fra Touwa Shokuhin Shinkoukai og Ål Research Foundation fra Nobori-kai.

Sitert Litteratur