conventionele antilichamen

antilichamen zijn immunoglobuline (IG) glycoproteïnen geproduceerd door plasmacellen (B-cellen) als reactie op vreemde antigene moleculen (immunogenen). De primaire functie van antilichamen moet specifiek aan deze vreemde antigenen binden om hen onbruikbaar te maken en/of hen voor vernietiging door het immuunsysteem te merken, waardoor de gastheer tegen besmetting wordt beschermd. Er zijn verscheidene klassen van antilichamen., Het eerste gedeelte van deze samenvatting concentreert zich op conventionele antilichamen op ware grootte, IgG en IgM-klasseantilichamen, die zwaar in een veelheid van onderzoek, kenmerkende en therapeutische biomedische toepassingen worden gebruikt.

de basiseenheid van een conventioneel antilichaam is een vier polypeptide-eenheid bestaande uit twee identieke zware ketens en twee identieke lichte ketens die door disulfidebindingen bij elkaar worden gehouden. De lichte kettingen zijn korter, met een lager molecuulgewicht dan de zware kettingen., De algemene vorm van een antilichaam is een Y, met een flexibel scharnier (interdomain) gebied bij het centrum van Y. de flexibiliteit van het interdomain scharniergebied is belangrijk voor de bivalente band van een antilichaam , toestaand de twee bindende zakken om met antigenic plaatsen bij veranderlijke afstanden in wisselwerking te staan. Elke polypeptideketen heeft een constant gebied, dat niet beduidend onder antilichamen varieert, en een veranderlijk gebied, dat Voor elk bepaald antilichaam specifiek is. De gemeenschappelijke notatie voor het veranderlijke gebied van de lichte keten is VL en voor het constante gebied van de lichte keten is CL (figuur 1)., De notatie is vergelijkbaar voor de variabele zware keten (VH) en constante gebieden (CH) met CH1, CH2 en CH3 die de verschillende constante gebieden van de zware keten aangeven. Koolhydraten zijn normaal verbonden aan de CH2 domeinen van de zware ketens. Het gebied van fragment kristallizable (Fc) bevat slechts constante gebieden van de zware kettingen (CH), maar het gebied van fragment antigeen-bindend (Fab) omvat zowel een constant domein als de veranderlijke domeinen van zowel de zware als lichte kettingen (VH en CL). De fragment variabele regio FV regio bevat alleen de twee variabele domeinen (figuur 1)., Zie muizenantilichaam voor discussie over immunoglobulin ISO-types, subklassen, en het aantal immunoglobulin domeinen.

figuur 1. De basisstructuur van een conventioneel antilichaam op ware grootte (linkerpaneel) en van gemeenschappelijke antilichaamfragmenten (rechterpaneel). Van

elk compleet antilichaam heeft twee antigeenbindende zakken, gelegen in de FV-regio ‘ s, en kan binden aan twee antigenen (bivalente binding)., Nochtans, als de twee antigenen te dichtbij (≤3 nm), of te ver uit elkaar (≥29nm) zijn, kan het antilichaam slechts aan één antigeen binden (monovalente band). Er is een significante affiniteitsverandering tussen monovalente en bivalente bindingen met een 1.500-voudige verandering in kd waarden .

de structuur van specifieke antilichamen is beschikbaar in de Structural antilichaam Database (SAbDab), een gecureerde database van publiek beschikbare antilichaamstructuren, alsook in de structural modelling tools, die wekelijks wordt bijgewerkt via de proteïne Data Bank (PDB) .,

conventionele Full-size antilichamen worden al tientallen jaren gebruikt in onderzoek voor eiwitdetectie via Western blot analyses , immunohistochemie en enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). De antilichamen op ware grootte zijn ook ontwikkeld voor kenmerkende toepassingen zoals zwangerschapstesten en opsporing van bacteriën en virussen in bloed, zoals een ELISA die HIV ontdekt. Daarnaast worden conventionele Full-size antilichamen algemeen gebruikt in ziektetherapeutics., Bijvoorbeeld, Infliximab is één antilichaam van vele beschikbare Die alpha van de tumornecrosefactor (TNFa) erkennen en het wordt gebruikt in de behandeling van de ziekte van Crohn en reumatoïde artritis . Trastuzumab, of Herceptin, is een antilichaam dat bindt aan epidermale groeifactor receptor 2 en wordt gebruikt bij de behandeling van gemetastaseerde borstkanker . Er zijn ook verschillende op antilichamen gebaseerde therapieën, waaronder Muromonab, gegeven aan transplantatieontvangers om afstoting van allograft te voorkomen.,

hoewel conventionele Full-size antilichamen beide kunnen worden gebruikt voor therapeutische toepassingen, zijn er voor-en nadelen aan het gebruik van het complete antilichaam. Een belangrijk voordeel van conventionele antilichamen is het feit dat het gebied Fc de immune reactie van het lichaam in dienst neemt, en kan bindende antigenen voor vernietiging richten. Dit Fc-gebied kan ook een nadeel in sommige klinische toepassingen zijn omdat de immune reactie die het typisch aan de gezondheid van de patiënt ontlokt kan zijn., Bovendien, kunnen de antilichamen op ware grootte niet goed in bepaalde weefsels doordringen toe te schrijven aan hun vrij grote grootte . In sommige gevallen, wanneer het gebruiken van antilichamen op ware grootte voor kenmerkende toepassingen kan het Fc-domein significante niet-specifieke band veroorzaken, die opsporingstoepassingen kan aantasten.

voor veel toepassingen hebben antilichaamfragmenten de voorkeur. De fragmenten van het antilichaam kunnen door chemische of genetische mechanismen worden geproduceerd., De chemische fragmentatie gebruikt verminderende agenten om de disulfidebanden binnen het scharniergebied en de spijsvertering van het antilichaam met proteases met inbegrip van pepsine, papain, en ficin te breken. De genetische bouw van fragmenten biedt de capaciteit aan om een veelheid van fragment-bevattende molecules te creëren, elk met unieke band en functionele kenmerken.

chemische en protease spijsvertering van full-size IgG-of IgM-antilichamen levert antigeen-bindende fragmenten op (Fab; figuur 1), en Fc-fragmenten, die alleen bestaan uit de zware keten CH2 en CH3-domeinen., De biochemische methodes om antilichaamfragmenten te produceren produceren nuttige hulpmiddelen voor kenmerkende en therapeutische toepassingen, maar het is vrij arbeidsintensief en vereist een grote hoeveelheid antilichaamgrondstof.

De antigeenbindingsfragmenten geproduceerd door biochemische spijsvertering omvatten Fab, (Fab’)2, Fab’ en FV, die allemaal het Fc-gebied ontberen. Monovalente F (ab) fragmenten hebben één antigeen-bindende plaats, terwijl divalente (Fab’)2 fragmenten twee antigeen-bindende gebieden hebben die door disulfidebindingen worden verbonden., Twee afzonderlijke fragmenten van F(ab) worden geproduceerd wanneer een volledig antilichaam met papaïneenzym wordt verteerd. Een fragment van F (ab’)2, dat een deel van het scharniergebied behoudt, wordt geproduceerd door pepsinevertering van IgG-of IgM-antilichamen. Reductie van F (ab’)2 fragmenten produceert 2 monovalente Fab ‘ fragmenten, die een vrije sulfhydrylgroep hebben die nuttig is voor conjugatie aan andere moleculen. FV fragmenten zijn het kleinste fragment gemaakt van enzymatische splitsing van IgG en IgM klasse antilichamen (figuur 1)., De fragmenten van FV hebben de antigeen-bindende plaats die van de gebieden van VH en VL wordt gemaakt, maar zij missen de constante gebieden van de gebieden van Fab (CH1 en CL) (figuur 1, juist Paneel). VH en VL worden bij elkaar gehouden in FV fragmenten door niet-covalente interacties. De fragmenten kunnen worden gegenereerd door middel van in de handel verkrijgbare kits, bijvoorbeeld F (ab’)2 Fragmentatiekit van G-Biowetenschappen .,

genetische manipulatiemethoden maken de productie mogelijk van single chain variable fragments (scFv), die fragmenten van het FV-type zijn die bestaan uit de VH-en VL-domeinen die verbonden zijn door een geconstrueerd flexibel linkerpeptide (figuur 1) . Manipulatie van de oriëntatie van de V-domeinen en de linkerlengte creëert verschillende vormen van FV moleculen . Wanneer de linker ten minste 12 residuen lang is, zijn de scfv-fragmenten voornamelijk monomeer (zoals weergegeven in Figuur 1) ., Linkers die 3-11 de molecules van de residuen lange opbrengst scFv zijn die niet in een functioneel FV-domein kunnen vouwen. Deze molecules associëren met een tweede molecule scFv, die een bivalente diabody tot stand brengt . Als de linkerlengte minder dan drie residu ‘ s is, associëren scfv-moleculen met triabodieën of tetrabodies . Bijvoorbeeld, Tao Y et al genereerde een VH-VL diabody met een korte ggggs linker en scFv met een lange GTTAASGSSGGSSSGA linker ., Multivalent scFvs bezitten grotere functionele bindende affiniteit aan hun doelantigenen als resultaat van het hebben van twee meer de bandplaatsen van het doelantigeen, die het off-rate van het antilichaamfragment vermindert . Minibodies zijn scfv-CH3 fusieproteã nen die in bivalente dimeren assembleren . De kleine fragmenten van scFv met twee verschillende veranderlijke domeinen kunnen worden geproduceerd om bisspecific bis-scFv fragmenten te produceren geschikt om twee verschillende epitopes gelijktijdig te binden . De genetische methodes worden ook gebruikt om bisspecific Fab dimers (Fab2) en trispecific Fab trimers (Fab3) te creëren ., Deze antilichaamfragmenten kunnen gelijktijdig 2 of 3 verschillende antigenen, respectievelijk binden.

naast conventionele antilichamen bevatten soorten van kameliden en haaien (squalidae) een subset van eigenaardige antilichamen tegen zware kettingen (hcAb) die uitsluitend bestaan uit homodimers met zware kettingen zonder lichte kettingen . De Fab delen van deze antilichamen, genaamd VHH in kameliden en vnar in haaien, zijn de kleinste antigeen-bindende gebieden natuurlijk gevonden ., Nanobodies is VHH-afgeleide recombinante domeinen bekwaam om antigenen te binden, vaak gekloond van vhhfaagbibliotheken zoals die tegen de proteã nen van betacoronarivus s . Hun binding thermodynamica en structuren zijn bestudeerd ( en referentie daarin)., Nanobodies is zeer stabiel en kan gemakkelijk in reusachtige hoeveelheid worden veroorzaakt door gemeenschappelijke eenvoudige eiwituitdrukkingssystemen zoals bacteriën te gebruiken (de functionele conventionele antilichamen op ware grootte zijn moeilijk om behoorlijk in een bacterieel systeem uit te drukken), waarbij een veelbelovend hulpmiddel voor onderzoek en therapeutische doeleinden, vooral op de gebieden van Super-resolutiemicroscopie, massaspectrometrie, en gerichte eiwitdegradatie wordt vertegenwoordigd . Nanobodies kan ook binnen levende cellen worden geleverd door vervoegd met peptides, of in vivo , of uitgedrukt direct in vivo en zijn doelstellingen in vivo erkennen., Nanobodies tegen RFP of GFP, wanneer vervoegd met ver-rode Atto kleurstoffen, bereikte 118-vouwen vergroting van fluorescente signalen over GFP of RFP, en werden gebruikt om neuronale connectiviteit van de gehele lichaamsmuis te produceren . Zij zijn ook gebruikt om de actieve staat van proteã nen in structurele studies te stabiliseren . Een uitdrukkingssysteem met veelvoudige aaneengeschakelde nanobodies tegen verschillende influenzastammen wordt onderzocht als middel om een universeel griepvaccin te produceren ., Recombinante anti-IgG secundaire nanobodies heeft groot potentieel om wijd gebruikte polyclonal secundaire die antilichamen te vervangen gebruikend dieren worden geproduceerd .

Nanobodies hebben het unieke vermogen om de bloed-hersenbarrière te passeren; nanobodies worden echter vaak zeer snel uit het lichaam verwerkt en verwijderd . Nanobodies kan voor methodes zoals immunoprecipitation, bijvoorbeeld, RFP-Val MA van Chromotek worden gebruikt, of aan fluorescente proteã nen worden gekoppeld om intracellular doelstellingen in levende cellen in real-time te volgen .,

ongeveer 10% van de boviene immunoglobulinen bevat een ongewoon lange, complementaire derde keten (CDR 3H) met een groot aantal cysteïneresiduen . Deze cysteinenpaar om disulfidebanden te vormen die tot een stalk-en-knoop zoals structuur in het antigeen bindende domein leiden . Dit uitzonderlijk lange cdr3h domein met de lange steel draagt bij aan de diversiteit van boviene antilichaamspecificiteit.,

Intrabodies of intracellulaire antilichamen zijn antilichamen of fragmenten daarvan (meestal van scFv-ontwerp) die rechtstreeks in cellen of in dieren in vivo via een expressievector tot expressie worden gebracht. Bijvoorbeeld, ontwikkelden Dong JX et al verscheidene nanobodies tegen neuronale proteã nen voor intracellular uitdrukking als intrabodies . Één belangrijke overweging / voorbehoud is het verminderende intracellular milieu dat de affiniteit van een antilichaam of antilichaamfragment vermindert waarvan de band met het antigeen van intradomaindisulfidebindingen afhankelijk is., Een andere overweging is dat intra-lichamen de neiging om samen te voegen. Kabayama h et al ontwierp intrabodies met een netto-engatieve lading zelfs bij de laagste cytoplasmatische pH 6.6 om ultra-stabiele cytoplasmatische antilichamen te genereren . Intrabodies worden gebruikt als alternatieven voor farmacologische inhibitors om specifieke endocytische deelnemers te richten., Voor gevallen, bevorderde de uitdrukking van één-keten veranderlijk fragment (scFv) uit het monoklonale antilichaam van 3b12a tegen het nucleaire de uitvoersignaal van TDP-43 in hek293a cellen of na in utero elektroporatie van zijn uitdrukkingsvector de proteolyse van TDP-43 aggregaten in gekweekte cellen en embryonale muizenhersenen ., Virus-gemedieerde levering in het zenuwstelsel van een scfv antilichaam tegen het RNA herkenningsmotief 1 van TDP-43 verminderde microgliose in een muismodel van acute neuroinflammation en mitigated cognitive impairment, motorische defecten, tdp-43 proteïnopathie, en neuroinflammation in transgene muizen die tdp-43 mutaties uitdrukken gekoppeld aan amyotrofe laterale sclerose . Het potentieel van intrabodies als therapeutische modaliteit moet nog naar voren komen.

een antilichaamfragment kan ook worden gekoppeld aan een cell-import tag, zoals een iptd tag , om de toegang tot cellen te vergemakkelijken.,

antilichaamfragmenten bieden voor sommige toepassingen bepaalde voordelen ten opzichte van een volledig antilichaam. Dit onderwerp werd beoordeeld door Nelson . Één voordeel van fragmenten over antilichamen van volledige grootte is dat de antilichaamfragmenten kleiner zijn dan conventionele antilichamen en over het algemeen glycosylation missen, die hun productie in prokaryotic uitdrukkingssystemen toestaan, die tijd en kostenbesparingen verstrekken., Bovendien, zijn de fragmenten klein genoeg om in sommige weefsels te infiltreren dat de antilichamen op ware grootte niet kunnen doordringen, wat in vele therapeutische en immunohistochemische procedures helpt . Voorts is het gebrek aan Fc-domein een wezenlijk voordeel voor primaire die antilichamen in immunohistochemistry en andere opsporingstoepassingen worden gebruikt omdat zij niet-specifieke band aan de Fc-receptor zeer hebben verminderd. Een scFv die algemeen wordt gebruikt in de diagnostiek is het NC10 antilichaam tegen influenza neuraminidase., De Moc-31 antilichaam tegen epitheliale cel adhesiemolecuul Ep-CAM is een scFv vaak gebruikt in als een kankertherapie. Diabodieën, triabodieën en tetrabodies hebben potentiële toepassingen in toepassingen zoals radioimmunotherapie en diagnostische in vivo beeldvorming . Nochtans, worden de fragmenten die het Fc-domein niet hebben gedegradeerd in het lichaam veel sneller dan conventionele antilichamen , en kunnen Fc-bemiddelde cytotoxische processen niet opwekken tenzij zij aan een effectorgroep worden vervoegd , die verdere optimalisatie voor antilichaamfragment-gebaseerde therapeutics vereist.,

hoewel verschillende antilichaamfragmenten bepaalde voordelen bieden, worden ze niet algemeen gebruikt in experimenten. In de meer dan 60.000 artikelen handmatig samengesteld door Labome slechts een paar artikelen geciteerde toepassingen van de fragmenten van antilichaamfab. De Roche anti-digoxigenine Fab antilichaamfragmenten (11093274910) en anti-fluoresceïne Fab antilichaamfragmenten ( 11426338910) worden gegenereerd in schapen en geproduceerd door vertering met papaïne. De fragmenten van anti-digoxigenin Fab werden gebruikt voor kruisingen in situ aangezien de sondes van RNA met digoxigenin worden geëtiketteerd ., Zij werden ook gebruikt om eiwit vouwende analyse uit te voeren om het proces van enige calmodulin molecuul uit te voeren die door de spectroscopie van de enig-molecuulkracht vouwen . F (ab) fragmenten van anti-muis secundaire antilichamen worden vaak gebruikt om endogene muis IG tijdens immunostaining te blokkeren, bijvoorbeeld, AffiniPure Fab fragment Donkey antimouse IgG van Biozol (JIM-715-007-003).,

Invitrogen Alexa Fluor 546-conjugated goat anti-rabbit IgG F (ab’) 2 fragment werd gebruikt om immunohistochemie uit te voeren om de rol van sFLT-1 in het behoud van de avasculaire fotoreceptorlaag in muismodellen te onderzoeken en Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2 fragment van konijn anti-goat IgG (H+L) werd gebruikt in immunohistochemie om het mechanisme van tip link regeneratie in auditieve haarcellen te onderzoeken .,

Fc-receptoren (FCR ‘ s) zijn moleculen die voornamelijk tot expressie komen op/in aangeboren immuuncellen, die het Fc-domein van antilichamen herkennen en binden en zo een op cellen gebaseerde immuunrespons initiëren. De diverse functies van FcRs weerspiegelen de brede waaier van beschermende of modulerende rollen van antilichamen, met inbegrip van het bemiddelen van de neutralisatie en de klaring van gerichte substraten, evenals de programmering van aanpassingsimmuniteit ., De biologische functies van FCR ‘ s worden gereguleerd door op immunoreceptor-tyrosine-gebaseerde activatiemotieven (ITAMs) en op immunoreceptor-tyrosine-gebaseerde remmende motieven (ITIMs), die respectievelijk fungeren als de interface van de receptor met activerende en remmende signaalwegen. Aldus, kan het signaleren door ITAMs celactivering, fagocytose en endocytose opwekken, terwijl het signaleren door ITIMs een remmend effect op celactivering heeft . FCR ‘ s zijn beschreven voor alle klassen van immunoglobulinen en sommige van hen worden hieronder besproken.,

Deze familie omvat FcyRI, FcyRII, FcyRIII en hun isovormen. Zij zijn verantwoordelijk voor antilichaam-afhankelijke cel-gemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) en antilichaam-afhankelijke cel-gemedieerde fagocytose (ACDP).

een andere receptor die IgG bindt is neonatale Fc-receptor (FcRn), die betrokken is bij de overdracht van passieve humorale immuniteit van een moeder op haar foetus. FcRn beschermt IgG ook tegen degradatie in vivo, wat hun lange halfwaardetijd in het serum verklaart ., Dit fenomeen heeft geleid tot de ontwikkeling van betere therapeutische antilichamen door wijzigingen in het Fc-gebied te introduceren om de Fc-FcRn interactie te bevorderen.

zij omvatten de hoge-affiniteit FceRI, die monomeer IgE kan binden, en de lage-affiniteit C-type lectine FceRII, die bij voorkeur interageert met complexe IgE. FceRI bemiddelt de onmiddellijke overgevoeligheidsreactie van vele allergische reacties door de degranulatie en de afgifte van een reeks ontstekingsmediatoren op mestcellen en basofielen te stimuleren ., FceRII bestaat zowel in een membraan-gebonden vorm die een downregulating signaal voor ige-synthese levert, evenals oplosbare fragmenten die een tegengestelde upregulation op ige-synthese produceren . Zijn rol in transcytose van IgE-allergeencomplexen in menselijke luchtwegen en het intestinale epitheel wordt actief onderzocht als potentieel doelwit voor allergische luchtwegontsteking als gevolg van voedselallergieën .

Het enige lid van de IGA-receptorgroep, FcaRI, wordt alleen uitgedrukt in cellen van de myeloïde afstamming., Het speelt een rol in zowel pro – als anti-inflammatoire reacties afhankelijk van de toestand van de IGA-binding. Terwijl de binding van secretoire Iga (SIgA) huidig op mucosal plaatsen anti-inflammatoire gevolgen met inbegrip van preventie van ziekteverwekkerinvasie heeft, leidt de binding van serum IgA tot ontstekingsreacties. FcaRI reguleert ook neutrofiel levensvatbaarheid afhankelijk van de inflammatoire micro-omgeving .

TRIM21 kan van andere FCR ‘ s worden onderscheiden omdat het een brede antilichaamspecificiteit vertoont. Het kan IgG, IgM en IgA binden . Het wordt ook uitgedrukt door cellen van de meeste histogene geslachten ., TRIM21 neemt deel aan antilichaam-gemedieerde interferentie van virale replicatie door zich te richten op cytosolische virus-antilichaamcomplexen voor proteasomale degradatie.

Binding van Fc-domeinen aan FCR ‘ s kan ongewenste effecten hebben in monoklonale antilichaamgebaseerde analysemethoden zoals immunohistochemie (IHC), fluorescentiegeactiveerde celsortering (FACS) en chromatine-immunoprecipitatiechips (ChIP). Niet-specifieke binding aan FCR ‘ s kan achtergrondruis veroorzaken die kan leiden tot detectie van valse positieven., Oplossingen om dit probleem aan te pakken omvatten het gebruik van (i) isotype controles voor gating, (ii) serum om breed te concurreren voor de receptoren betrokken bij niet‐specifieke binding, of (iii) gezuiverd IgG om Fc receptoren specifiek te blokkeren . Innovex Fc receptorblokker # NB309 kan worden gebruikt om paraffine of bevroren secties tijdens IHC of IC experimenten of BD Biosciences #553142 , Miltenyi Biotec Fc receptorblok voor cytometrie stroom te blokkeren. Bijvoorbeeld, blokkeerden Chopra s et al fcyr binding met 5 µg/ml TruStain fcX (anti-muis CD16 / 32, kloon 93) van BioLegend tijdens flowcytometrie en cel Sorteren .,

Dr. Macarena Fritz Kelly van São José dos Campos, SP, Brazilië, droeg in September 2018 de sectie Over Fc-receptoren bij.