Evolutie van de Deep-Sea Ruwe Paling Mitochondriale Genoom: Grote-Schaal-Gen Herschikkingen is Ontstaan Binnen de Paling

Abstracte

Recente studies hebben aangetoond dat bij afwijkingen van de typische gewervelde mitochondriale gen-om zijn vaker dan aanvankelijk gedacht., Dergelijke afwijkingen zijn echter gering, waarbij inversies en / of translocaties van enkele genen betrokken zijn en duplicatie van de genregio ‘ s in tandem gevolgd door schrappingen van genen als mechanismen die uit een dergelijke nieuwe genorde voortkomen., In de loop van moleculaire fylogenetische studies op de Elopomorpha (paling en hun bondgenoten), vonden we dat mitochondriale genomen (mitogenomen) van de twee diepzee gulper pelecanoides (Eurypharyngidae) en Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), vertonen een identieke gen orde die sterk verschilt van die van alle andere gewervelde dieren. De fylogenetische analyse gebruikend de mitogenomic gegevens van 59 vissoorten bevestigde niet alleen één enkele oorsprong van zulk een genorde met vertrouwen maar gaf ook aan dat het uit de typische gewervelde genorde was afgeleid., Gedetailleerde vergelijkingen van de gulper paling genorde met die van typische gewervelde dieren suggereerden dat het voorkomen van een enkele stap, grootschalige duplicatie van Gen regio uitbreiding >12 kb, gevolgd door schrappingen van genen in een gemeenschappelijke voorouder van de twee soorten, de meest parsimoniousrekening van deze ongebruikelijke genenindeling.

Inleiding

gewervelde mitochondriale genorde werd aanvankelijk als conservatief beschouwd omdat de complete nucleotidesequenties van de mitochondriale genomen (mitogenomen) van zoogdieren (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981) en de Afrikaanse geklauwde kikker (Roe et al. 1985) toonde een gemeenschappelijke genorde. Aangezien de volledige mitochondriale DNA (mtDNA) sequenties zijn bepaald voor een aantal gewervelde dieren (269 soorten per 11 juni 2003; National Center for Biotechnology Information Web site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), is erkend dat afwijkingen van de typische genorde niet zo zeldzaam zijn bij gewervelde dieren (fig. 1; Boore 1999). Met uitzondering van placentale zoogdieren, omvatten voorbeelden alle belangrijke geslachten van gewervelde dieren zoals lampreys (Lee and Kocher 1995), amfibieën (Macey et al. 1997; Sumida et al., 2001), reptielen (Kumazawa and Nishida 1995; Quinn and Mindell 1996; Macey et al. 1997), birds (Desjardins and Morais 1990, 1991; Quinn and Wilson 1993; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998), buideldieren (Pääbo et al. 1991; Janke et al. 1994), en fish (Miya en Nishida 1999; Inoue et al. 2001b; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001). Dergelijke genherschikkingen, echter, zijn lokaal (het meest in het bijzonder binnen een cluster van tRNA-genen), en geen voorbeeld is gevonden dat genomic-schaalherschikkingen impliceert.,= = verspreiding en leefgebied = = deze soort komt voor op bathypelagische diepten (>1000 m) in de oceanen van de wereld (Bertelsen, Nielsen, and Smith 1989). Hun bizarre verschijning (fig. 1), die het gevolg is van extreem vergrote, misvormde gapen aan het uiteinde van de slangachtige kop en het lichaam van de paling, heeft veel aandacht getrokken van veel onderzoekers (bijvoorbeeld Bertelsen, Nielsen, and Smith 1989; Robins 1989)., Dergelijke gespecialiseerde anatomische kenmerken hebben geleid onderzoekers om te veronderstellen dat de fylogenetische posities van deze dieren zijn buiten de benige vissen (bijvoorbeeld, Tchernavin 1946), hoewel ze over het algemeen worden beschouwd als naaste verwanten van de echte paling (orde Anguilliformes), omdat ze een blad-achtige leptocefale larve Stadium (Greenwood et al. 1966; Inoue and Miya 2001).,

in de loop van moleculaire fylogenetische studies van de Elopomorpha (eels en hun bondgenoten) met behulp van mitogenomische gegevens, vonden we een ongewone mitochondriale genorde voor een van de gulper pelecanoides, Eurypharynx Pelecanoides (fig. 1). Dit artikel beschrijft nieuwe genorganisatie in de mitogenomen van twee soorten gulper pelecanoides en Saccopharynx lavenbergi. Wij gebruikten een polymerasekettingreactie (PCR)-gebaseerde benadering die door Miya en Nishida (1999) voor het rangschikken van de volledige mitogenomes van deze vissen wordt ontwikkeld., Om de oorsprong van dergelijke unieke mitogenomen te onderzoeken, hebben we de mitogenomic gegevens onderworpen aan fylogenetische analyse, en we bespreken hier de mogelijke mechanismen die een dergelijke genregeling in de twee gulper paling genereren.

materialen en methoden

Specimens

mitochondriale DNA-sequenties werden verkregen van zes individuen van twee soorten die twee families vertegenwoordigen in de orde Saccopharyngiformes (Robins 1989). Voor de monotypische familie Eurypharyngidae, één individu van E., pelecanoides werd gebruikt als een specimen voor de bepaling van de volledige mtDNA-sequentie, en de andere vier individuen, waaronder twee leptocefale larven, werden gebruikt voor de bepaling van partiële sequenties van vier belangrijke genknooppunten (fig. 2) om de genorde in het E. pelecanoides mitogenome te bevestigen. Voor de familie Saccopharyngidae werd een enkel individu van S. lavenbergi gebruikt als specimen voor de bepaling van de volledige mtDNA-sequentie., Specimens van vouchers werden gedeponeerd in de viscollecties van het Natural History Museum & Institute, Chiba, Japan (CBM-ZF), en aan de Universiteit van Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, zuidelijk Japan; CBM-ZF 10312, 10313, 10316 en 10317: equatorial central Pacific Ocean) en S. lavenbergi (uw 045633: Eastern Pacific Pacific)).

DNA-extractie

een deel van de epaxiale musculatuur (ca. 0,25 g) werd uit verse exemplaren van elke soort verwijderd en onmiddellijk bewaard in 99,5% ethanol., Totaal genomisch DNA werd geëxtraheerd met behulp van de QIAGEN QIAamp weefselkit volgens het Protocol van de fabrikant.

polymerasekettingreactie en Sequencing

de volledige mitogenomen van twee gulperalen werden versterkt met behulp van een long-PCR-techniek (Cheng, Higuchi, and Stoneking 1994). Vijf vissen-universele en drie soorten-specifieke lange-PCR primers (s-LA-16S-l + H12293-Leu en L12321-Leu + s-LA-16S–H Voor E. pelecanoides; l2508-16S + Sala-ND4-H en Sala-CO1-l + Sala-ND1-H voor S. lavenbergi; fig. 1) werden gebruikt om het gehele mitogenoom van elke paling in twee reacties te versterken., De volledige mitogenomen van de andere vier E. pelecanoides individuen werden versterkt met drie fish-universal primers en een soortspecifieke long-PCR primer (L2508-16S + Eupe–ND2-H en L12321-Leu + S-LA-16S-H). Vier soortspecifieke primers (Eupe-ND2-H voor E. pelecanoides; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H en Sala-ND4-H voor S. lavenbergi) werden als alternatief ontworpen met verwijzing naar de partiële nucleotidesequenties van het ND2-gen van E. pelecanoides en de coi -, ND1-en ND4-genen van S. lavenbergi, bepaald uit elk totaal DNA met behulp van fish-universal primers.,

De Lange-PCR-producten werden verdund met te-buffer (1: 20)voor later gebruik als PCR-sjablonen, behalve voor een gebied tussen de twee lange-PCR-primers (tussen S-LA-16S-H en S-LA-16S-L, en h12293-Leu en L12321-Leu voor E. pelecanoides; fig. 1), waarin totaal genomic DNA alternatief werd gebruikt.

in totaal 82 vis-universele primers (Miya and Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d; Ishiguro, Miya, and Nishida 2001; Kawaguchi, Miya, and Nishida 2001) werden gebruikt in verschillende combinaties om aaneengesloten, overlappende segmenten van het gehele mitogenoom voor elk van de twee soorten te versterken. Soortspecifieke primers werden ontworpen in gevallen waarin geen geschikte vis-universele primers beschikbaar waren. Een lijst van PCR-primers die voor een specifieke soort worden gebruikt, is op verzoek verkrijgbaar bij J. G. I. Lange-PCR en daaropvolgende PCR reacties werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (bijv., Miya en Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

Double-stranded PCR producten, gezuiverd met behulp van een Pre-Sequencing Kit (USB), werden vervolgens gebruikt voor directe cyclus sequencing met behulp van dye-label terminators (Applied Biosystems). De gebruikte primers waren hetzelfde als die voor PCR. Alle sequentiereacties werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Geëtiketteerde fragmenten werden geanalyseerd door middel van een model 377 DNA sequencer (Applied Biosystems).

Sequentieanalyse

DNA-sequenties werden geanalyseerd met behulp van het softwarepakket dnasis Versie 3.2 (Hitachi Software Engineering)., Locaties van de 13 eiwitcoderende genen werden bepaald door vergelijkingen van DNA of aminozuursequenties van benige vis mitogenomen. De 22 tRNA genen werden geïdentificeerd door hun Klaverblad secundaire structuren (kumazawa en Nishida 1993) en anticodon sequenties. De twee rRNA genen werden geà dentificeerd door opeenvolgings gelijkenis en secundaire structuur (Gutell, Gray, en Schnare 1993). Sequentiegegevens zijn beschikbaar bij DDBJ/EMBL / GenBank met toetredingsnummers AB046473 en AB046475–AB046490 voor E. pelecanoides, en AB047825 voor S. lavenbergi.,

fylogenetische analyse

De gegevensmatrices van Inoue et al. (2001d) en Miya, Kawaguchi en Nishida (2001) werden gecombineerd en overtollige taxa werden geëlimineerd. Mitogenomic opeenvolgingen van de twee gulper paling en twee teleosts (Gymnothorax kidako, AP002976 en Salmo salar, U12143 ) werden toegevoegd. Omdat eenduidige uitlijningen van de twee rRNA genen op basis van secundaire structuurmodellen niet haalbaar waren (Miya en Nishida 2000), werden ze niet gebruikt in de analyses., Het ND6 gen werd niet gebruikt in de fylogenetische analyses vanwege zijn heterogene basesamenstelling en consistent slechte fylogenetische prestaties (bijv. Zardoya and Meyer 1996; Miya and Nishida 2000). Ook, tRNA loops, tRNASer(AGY) (onstabiele afgeleide secundaire structuren in sommige species), en andere dubbelzinnig uitgelijnde gebieden, zoals 5′ en 3′ einden van verscheidene eiwit-codeert genen, werden uitgesloten van de analyses., Bovendien werden derde codonposities in de eiwitcoderende genen die een analyse van hogere relaties van actinopterygiërs (Miya en Nishida 2000) positief konden misleiden, uitgesloten van de analyses, waardoor 7.984 beschikbare nucleotideposities van de 12 eiwitcoderende genen en 21 tRNA-genen overbleven.

Bayesiaanse fylogenetische analyses werden uitgevoerd met MrBayes 2.01 (Huelsenbeck and Ronquist 2001)., Het general time reversible model met een aantal locaties waarvan wordt aangenomen dat ze onveranderlijk zijn en met variabele locaties waarvan wordt aangenomen dat ze een discrete gammadistributie volgen (GTR + I + Γ; Yang 1994) werd geselecteerd als het best passende model van nucleotide substitutie (ModelTest Versie 3.06; Posada and Crandall 1998). We stellen de maximale waarschijnlijkheidsparameters in MrBayes als volgt in:” lset nst = 6 “(GTR),” rates = invgamma “(i + Γ), en” basefreq = estimate ” (geschat aandeel van basistypen uit de gegevens). Het Markov chain Monte Carlo proces werd zo ingesteld dat vier ketens (drie verwarmd en één koud) gelijktijdig liepen., We voerden twee onafhankelijke runs uit voor 1 miljoen generaties, waarbij elke 100 generaties bomen werden bemonsterd, die elk van een willekeurige boom begonnen. Twee onafhankelijke analyses kwamen overeen op vergelijkbare log-waarschijnlijkheid scores en bereikten “stationariteit” (gebrek aan verbetering in ML scores) op niet later dan 120.000 generaties., Zo werden de eerste 1.200 bomen uit elke analyse verwijderd en de resterende 17.602 gecombineerde monsters uit twee onafhankelijke analyses werden gebruikt om een 50% meerderheid regel consensus boom te genereren, waarbij het percentage Monsters dat een bepaalde clade terugvind, de posterieure waarschijnlijkheid van die clade weergeeft (Huelsenbeck and Ronquist 2001).

resultaten

Genoomorganisaties

de totale lengte van de E. pelecanoides en de S. lavenbergi mitogenomen is 18.978 bp en 18.495 bp (behalve voor een deel van het vermeende controlegebied voor S., lavenbergi), respectievelijk (zie aanvullend materiaal online). Het genoomgehalte van deze twee gulper paling omvat twee rRNA, 22 tRNA, en 13 eiwit-coderende genen, zoals gevonden in andere gewervelde dieren (fig. 2). Net als bij andere gewervelde dieren zijn de meeste genen van deze twee soorten gecodeerd op de H-streng, behalve de ND6-en acht tRNA-genen. Alle kenmerken zijn in lengte vergelijkbaar met die van andere benige vissen, met uitzondering van het COI-gen en het controlegebied voor E. pelecanoides en de coi-en cyt-B-genen voor S., lavenbergi (ongeveer 100, 800, 150 en 30 bp langer dan die in andere benige vissen, respectievelijk).

Het E. pelecanoides mitogenoom bevat drie niet-coderende gebieden langer dan 200 bp (fig. 2; zie ook aanvullende materialen online; noncoding regio en controle Regio). De NC1, gelegen tussen tRNASer(UCN) en tRNAAsp genen, en de nc2, gelegen tussen de trnaasp en COII genen, bevatten twee en vier pseudogenes die respectievelijk overeenkomen met degenererende kopieën van trnaasp gen., Een niet-coderend gebied (1.818 bp) tussen de genen cyt b en tRNAPhe lijkt met het controlegebied overeen te komen. De S. lavenbergi mitogenome bevat ook drie noncoding regio ’s langer dan 200 bp (noncoding regio en controle regio’ s). De nc, gelegen tussen de genen tRNALeu(CUN) en ND5, bevat ten minste twee pseudogenes die overeenkomen met degenererende kopieën van het tRNALeu(Cun) gen., CR1 (992 bp), gelegen tussen twee tRNA-genclusters (TP-en IM-gebieden), en CR2 (> 837 bp), gelegen tussen cyt-B-en tRNAPhe-genen, lijken overeen te komen met het controlegebied, en ze hebben volledig identieke sequenties boven 800 bp, wat erop wijst dat ze een gecoördineerde evolutie ondergaan (zie Kumazawa et al. 1998).

met uitzondering van de twee gedupliceerde controlegebieden (CR1 en CR2) in het S. lavenbergi mitogenoom vertonen de mitogenomen van de twee diepzeeaalalen een identieke genorde (fig. 2)., Echter, de mitochondriale genorde van de twee gulper paling verschilt sterk van die van alle andere gewervelde dieren bekend tot op heden. Wanneer sommige tRNA genen werden uitgesloten van de vergelijkingen (fig. 2), identificeerden we vijf genblokken (a, tRNAGlu–tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; en E, tRNAArg–tRNASer(AGY) gengebieden), waarvan de genvolgorde identiek is aan die van typische gewervelde dieren.,

fylogenetische posities van twee Gulperalen

Figuur 3 is een 50% meerderheid regel consensus boom van de 17.602 gecombineerde monsters van twee onafhankelijke Bayesiaanse analyses van de 59 mitochondriale nucleotide sequenties uit de concatenated 12 eiwit-codering (geen 3e codon posities), plus 21 tRNA genen (alleen stam regio ‘ s) met behulp van het GTR + I + Γ model van sequentieevolutie (Yang 1994). Met uitzondering van een paar knooppunten binnen de Neoteleostei, werden de meeste interne takken ondersteund door high Bayesian posterior probabilities (≥95%)., Opgemerkt moet worden dat de resulterende boom niet alleen expliciet aantoont dat de twee gulper paling een zustergroeprelatie vormen met een hoge posterieure waarschijnlijkheid (100%), maar ook dat ze diep genest zijn in de Anguilliformes (echte paling), wat sterk suggereert dat ze zijn afgeleid van een aal-achtige voorouder.

discussie

onlangs zijn meer dan 140 complete mtDNA sequenties van de actinopterygische vissen bepaald (bijv. Miya and Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya en Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya en Nishida 2001; Miya, Kawaguchi, en Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003), en verschillende voorbeelden van Gen herschikkingen zijn gemeld (fig. 1). Opgemerkt moet worden dat dergelijke gen herschikkingen weinig genen omvatten en dat de genindeling van de gulper paling mitogenomen sterk verschilt van die van andere gewervelde dieren.,

fylogenetische implicaties op de oorsprong van nieuwe Genorde

om de evolutie van de genarrangementen in de twee gulper palen af te leiden, is gevolgtrekking voor de voorouderlijke organisatie op basis van een betrouwbaar fylogenetisch kader vereist. Hoewel de gulper paling zijn opgenomen in de Elopomorpha uitsluitend gebaseerd op een afzonderlijke pelagische larvale vorm, genaamd de leptocephalus, heeft niemand hun fylogenetische positie bevestigd met behulp van karaktermatrices afgeleid van morfologische of moleculaire gegevens (Inoue en Miya 2001).,

Bayesiaanse analyse met behulp van de mitogenomische gegevens van 59 soorten die de teleosteaanse visdiversiteit volledig vertegenwoordigen (fig. 3) bevestigde niet alleen dat de nieuwe genorde van de twee gulper paling ontstond in een gemeenschappelijke voorouder van de twee soorten, maar toonde ook aan dat hun oorsprong onafhankelijk was van die van de andere nieuwe genorden. Het lijkt er ook op dat de nieuwe genorde van Conger myriaster, een ander lid van de Elopomorpha, een oorsprong heeft die onafhankelijk is van die van gulper paling., Opgemerkt moet worden dat Anguilla japonica, die de typische gewervelde gen orde heeft, met vertrouwen werd geplaatst als een zustersoort van de twee gulper paling. De meest spaarzame reconstructie van de gebeurtenissen van de genherschikking op de fylogenetische boom wees erop dat de afwijkende genorde van de twee gulper Alen is afgeleid van die van typische gewervelde dieren.

mogelijk mechanisme voor de Genherschikking bij Gulperalen

twee belangrijke mechanismen zijn voorgesteld om de genherschikkingen bij gewervelde mitogenomen te verklaren (Lee and Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Een daarvan is de tandem duplicatie van Gen regio ‘ s als gevolg van gleed streng mispairing, gevolgd door de schrappingen van genen (Moritz en Brown 1986; Levinson en Gutman 1987). Hoewel de dynamiek van mitochondriale genarrangementen niet zijn verklaard in sommige ongewervelde dieren (bijvoorbeeld Kurabayashi en Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et al. 2002), gewervelde mitochondriale gen herschikkingen kunnen goed worden verklaard door een dergelijk mechanisme (Desjardins and Morais 1990; Quinn and Wilson 1993; Kumazawa and Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999; Inoue et al. 2001b), en de haalbaarheid ervan wordt ook ondersteund door de frequente polymorfe duplicaties van mtDNA-sequenties (bijv., Stanton et al. 1994; Gach and Brown 1997; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999). De andere voorgestelde mechanismen beroepen op de illegale priming van replicatie door tRNAs en de daaruit voortvloeiende integratie van tRNA-genen rond het controlegebied (Cantatore et al. 1987; Jacobs et al. 1989).,

hoewel het tweede model op dit punt niet is uitgesloten, wordt het eerste model als het mechanisme van genherschikking in de gulper aal mitogenomen aanbevolen. Aangenomen dat een lang DNA-fragment in het tRNAIle–CR-gebied van de typische organisatie wordt gedupliceerd (fig. 4), zouden latere schrappingen van overtollige genen aanleiding geven tot de herschikte genorganisatie in gulper paling. Dergelijke tandemduplicatie en de daaropvolgende schrappingen resulteerden het meest parsimoniously in de waargenomen genorde en de bijbehorende intergenic spacers in deze twee gulper paling.,

meerdere deleties van overtollige genen leken incompleet te zijn in de twee gulper paling, als gevolg van verschillende reeksen noncoding sequenties (fig. 2) voorkomen rond de genen betrokken bij de herschikking (fig. 4). Hoewel nc1 en nc2 in E. pelecanoides en NC in S. lavenbergi bestaan uit repetitieve pseudogenes die overeenkomen met degenererende kopieën van aangrenzend tRNA-gen, hebben CR1 en CR2 in S. lavenbergi mitogenome identieke sequenties boven 800 bp, en CR1 bevindt zich op de vermeende dubbele positie terwijl CR2 zich op de oorspronkelijke positie van het controlegebied bevindt., Deze observatie in S. lavenbergi mitogenome steunt het concept van de tandemduplicatie en de daaropvolgende schrappinggebeurtenissen zoals die in het tRNAIle–CR gebied hebben plaatsgevonden (fig. 4).

als vier van de vijf aaneengesloten genblokken samen werden gedupliceerd in een gemeenschappelijke voorouder van de twee soorten, en als er vervolgens genen werden verwijderd vóór de speciatie, strekten de veronderstelde gedupliceerde porties gulper paling, variërend van het tRNAIle gen tot CR van de typische organisatie, zich uit tot meer dan 12 kb (fig. 1)., Voorafgaand aan deze studie, waren de vermeende gedupliceerde gebieden van ooit bekende gewervelde herschikking 4 kb op zijn best. Bovendien werden alle bekende tandemly herhaalde codeeropeenvolgingen beperkt tot gebieden die aan de cr, IQM, of WANCY gebieden grenzen, misschien die occasionele onnauwkeurige beëindiging van replicaties voorbij hun oorsprong weerspiegelen. Het gedupliceerde gebied in de gulper aal mitogenome was veel groter dan dat van ooit bekende gewervelde herschikkingen en betrokken bijna het gehele mitogenome (fig. 1).

We danken de kapiteins, officieren, bemanning, wetenschappers en studenten aan boord tijdens de kt97-10 cruise<– –> van de R/V Tansei Maru en de KH00-1 cruise van de R/V Hakuho Maru voor hun hulp bij monsters verzamelen. Deze studie was niet mogelijk geweest zonder de genereuze donatie van S. lavenbergi weefselmateriaal, waarvoor wij E. O. Wiley hartelijk danken. We danken ook twee anonieme recensenten voor hun waardevolle commentaar op het manuscript. Dank zijn ook te danken aan Y., Fukuyo, K. Furuya, K. Nanba, en afgestudeerde studenten aan het Fisheries Oceanography Laboratory, University Of Tokyo, voor het royaal toestaan van ons om hun experimentele faciliteiten te gebruiken, en Marshall Editions Ltd.; Andromeda Oxford Ltd.; en Tokai University druk op voor toestemming om illustraties en foto ‘ s te gebruiken. K. Pearson was zo vriendelijk relevante informatie te verstrekken over de identiteit van het “S. lavenbergi” specimen. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies-in-aid van het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en cultuur van Japan (nos., 09740644, 10460081, 10660189, 11640705, 11691177, 12460083, en 12NP0201) en” onderzoek voor de toekomst ” programma nr. JSPS-RFTF 97L00901 van de Japan Society for the Promotion of Science. K. T. werd ondersteund door de Research Foundation van Touwa Shokuhin Shinkoukai en de Eel Research Foundation van Nobori-kai.

geciteerde literatuur