Frontiers in pediatrie

Inleiding

Posterior urethrale kleppen (PUV) is de meest voorkomende aangeboren oorzaak van obstructie van de blaasuitlaat bij pediatrische Muizen (1). Hoewel het sterftecijfer door PUV aanzienlijk is verbeterd met moderne medische behandeling, blijft obstructieve uropathie nog steeds een belangrijke bron van morbiditeit tot in de volwassenheid (2). Tot 80% van de kinderen met PUV vertonen symptomen van incontinentie en urineweginfecties (3)., Bovendien zal tot 50% van de kinderen met PUV nierfalen ontwikkelen, met obstructieve uropathie de meest voorkomende aangeboren oorzaak van niertransplantatie (4). De blaadjes van de obstructieve klep worden kort na de geboorte chirurgisch behandeld; kinderen met PUV zullen echter gedurende hun hele leven variabiliteit in de urineblaasfunctie ontwikkelen. Er is aangetoond dat blaasverslechtering vaak optreedt na de puberteit, met een toenemende behoefte aan schone intermitterende katheterisatie (5).

Studies waarbij gebruik werd gemaakt van verschillende diermodellen hebben aangetoond dat de blaas hormonaal gevoelig is., Specifiek, is de testosteronvervanging getoond om gladde spiermassa en gladde spier aan collageenverhouding in orchiectomized ratten (6) te verhogen. Een model van partiële blaasuitlaat obstructie bij mannelijke muizen werd bestudeerd en aangetoond dat blaas detrusor spierhypertrofie veroorzaken (7). Het is aangetoond dat testosteron detrusor–fibrose verhoogt als reactie op ischemie-reperfusie-letsel bij gecastreerde konijnen (8). Echter, tot op heden, het effect van hormonale manipulaties op de reactie van de mannelijke muis blaas op letsel veroorzaakt door obstructie moet nog worden bestudeerd., Daarom veronderstellen we dat testosteron deelneemt aan de maladaptieve fibrotische veranderingen die optreden na obstructie van de blaasuitlaat.

materialen en methoden

Murine partial Blaasuitlaat obstructie Model

alle chirurgische ingrepen werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Stanley Manne Children ‘ s Research Institute. Acht-tot tien weken CD1 mannelijke muizen (Charles River Labs, Chicago, IL, USA) werden gehuisvest in aparte kooien om veranderingen in testosteron niveaus veroorzaakt door groepshuisvesting te voorkomen. Muizen werden verdoofd met 3% isofluraan en in rugligging geplaatst., De onderbuik werd geschoren en bereid met providone-jodiumoplossing. Na het verzekeren van bevredigende inductie van anesthesie, werd een middellijn lagere abdominale huidinsnede gemaakt en naar beneden door de buikwand gedragen. Obstructie van de blaasuitlaat werd uitgevoerd op een wijze vergelijkbaar met een vorig rapport, maar met enkele verschillen (gedeeltelijke obstructie of PO-groep) (7). Houd er rekening mee dat gedeeltelijke obstructie wordt meestal aangeduid als “pBOO,” echter, zullen we verwijzen naar de operatie en experimentele groep als PO., Met opwaartse tractie op de blaas, stompe dissectie rond de blaashals (proximaal aan de prostaat bij mannelijke muizen) werd uitgevoerd, terwijl af en toe het intrekken van de blaas caudaal om ervoor te zorgen dissectie te zijn anterieur aan de ureters. Een 7-0 polypropyleen hechting werd vervolgens rond de blaashals doorgegeven en vastgebonden over een 23-gauge naald geplaatst naast de urethra. Daarna werd de naald verwijderd., Als mannelijke dieren moesten worden gecastreerd (castreren partiële obstructie of CPO), gelijktijdig werden de testes uit de buik incisie, de zaadstrikken gelig met 6-0 polypropyleen hechtingen en scherp verdeeld. De buikwand en de huid werden vervolgens afzonderlijk gesloten met 5-0 polyglactine hechtingen op een onderbroken manier. Schijndieren ondergingen een identieke procedure tot aan het punt van blaasmobilisatie. De dieren mochten herstellen, mits carprofen opgelost werd in drinkwater en na 1 of 4 weken na de hieronder beschreven functionele studies werd gedood., Na het offeren door cervicale wervelkolom dislocatie onder isofluraan anesthesie, dieren werden gewogen en blazen werden ontleed op het niveau van de ligatuur. Elke blaas werd leeggemaakt van urine en vervolgens afzonderlijk gewogen voor 12 sham, 17 PO, 11 CPO en 11 CPOT muizen.

toediening van testosteron

toediening van testosteron cypionaat werd toegediend aan de castraat, gedeeltelijk geblokkeerde groep op het moment van castratie en wekelijks postoperatief in een dosis van 10 mg / kg (castraat partiële obstructie testosteron of CPOT groep)., Voor muizen die testosteronvervanging kregen, werd het bloed op het moment van offer getrokken en voor commerciële testosteronanalyse verzonden om ervoor te zorgen dat zij adequate vervanging ontvingen (Antechdiagnostiek, Irvine, CA, DE V. S.).

Voiding Stain on Paper (VSOP)

VSOP werd uitgevoerd op de ochtenden van postoperatieve dagen 1, 7 en 28 voor elke muis. Muizen werden gedurende 2 uur in metabole kooien gehouden met onderliggend Whatman-filterpapier en kregen onbeperkte toegang tot voedsel en water. Filterpapier vellen werden afgebeeld., Aantal en patroon van de holten werd genoteerd en het gebied van elke voiding vlek werd gemeten met behulp van ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Met behulp van een standaard curve gemaakt van voiding vlekken van bekende hoeveelheden urine, vlek gebied werd omgezet in ongeldig volume. Max ongeldig volume werd geanalyseerd.

histologische analyse

blazen werden gedurende 24 uur gefixeerd in 10% (w/v) formaline (Sigma), ingebed in paraffine en dwars gesneden met de blaashals naar beneden gericht om secties van 4 µm te produceren. Secties van 4 sham, 4 PO, 4 CPO en 4 CPOT muizen werden bevlekt met massons trichrome., Secties werden afgebeeld op 10× en 40× vergroting met behulp van een Leica rechtop microscoop aangesloten op een camera en beelden werden digitaal opgeslagen met behulp van OpenLab voor Mac. Col / SM ratio werd gekwantificeerd met behulp van Adobe Photoshop zoals eerder beschreven en gemiddeld van vier 40 × secties per blaas. Voor immunostaining, werden blazen gefixeerd in 4% (w/v) formaldehyde gemaakt van paraformaldehyde (EM Wetenschappen) ‘ s nachts. Weefsel werd gewassen in DPBS en werd sequentieel in evenwicht gebracht in 20% (G/v) en 30% (g/v) sucrose (Sigma) in DPBS., Weefsels werden ingevroren in peel-away mallen met OCT (Tissue Tech) in een droogijsisopentaan (Sigma) bad.

immunofluorescentie antilichamen

vaste blazen van 3 sham -, 3 PO -, 3 CPO-en 3 CPOT-muizen werden gebruikt. Secties van 10 µm van werden gesneden voor alle experimenten. Secties werden tweemaal gewassen in PBS, geïncubeerd gedurende 5 min bij kamertemperatuur in PBS + 0,1% Tween (PBT), en geblokkeerd gedurende 30 min bij kamertemperatuur met 10% donkey serum in PBT., Smooth muscle myosine (SMM) werd op dezelfde manier gedetecteerd met rabbit anti-smooth muscle myosine (Biomedical Technologies, 1:100) in combinatie met het Alexa Fluor 546 donkey anti-rabbit secondary antilichaam (Life Technologies, 1:400).

statistische analyse

groepen werden vergeleken met behulp van ANOVA met post hoc Student–Newman–Keuls analyse. Resultaten met P < 0,05 werden als significant beschouwd. SPSS v22. 0 werd gebruikt voor statistische analyse. Foutbalken in cijfers weerspiegelen SEM.,

resultaten

PO leidt tot functionele veranderingen bepaald door urodynamische Studies en Voiding vlek op papier

partiële blaasuitlaat obstructie werd uitgevoerd op mannelijke CD-1 muizen en vergeleken met twee groepen: mannelijke muizen die een schijnoperatie ondergingen en mannelijke muizen die partiële blaasuitlaat obstructie ondergingen met castratie. We hebben de serumtestosteronspiegels gemeten bij gecastreerde muizen en vonden dat de spiegels binnen 24 uur na orchidectomie waren gedaald tot (<20 pg/dL)., De effecten van obstructie op blaasfunctie werd bepaald met behulp van urodynamische studies in deze drie groepen. Figuur 1A toont verhoogde maximale voiding druk 1 week post-obstructie in de PO en CPO muizen in vergelijking met schijnchirurgie muizen. Representatieve urodynamische tracings vertonen ook instabiliteit na 1 week bij PO-en CPO-muizen (figuur 1C). VSOP uitgevoerd op 1 week na obstructie weerspiegelen het effect van obstructie op PO en CPO muizen die niet wordt gezien in schijnchirurgie muizen (figuren 1B,D)., Zo had Ons model van PO significante functionele effecten op mictie in zowel PO als CPO muizen 1 week na de operatie.

hoewel obstructie bij CPO muizen werd aangetoond na 1 week, verdwenen de effecten van obstructie na 4 weken. VSOP gedaan op 4 weken post-obstructie tonen aan dat PO muizen hebben aanhoudende obstructieve voiding patronen met kleinere maximale voided volumes dan CPO muizen. Op hetzelfde tijdstip, CPO muizen herstellen maximale leeggemaakte volumes vergelijkbaar met schijnchirurgie muizen (figuren 3A–C)., Het algemene patroon op VSOP van CPO muizen zijn teruggekeerd naar normaal terwijl PO muizen blijven indiscreet spuiten van urine wijzen op verlies van blaascontrole vertonen.

remodellering van de blaas na PO is veranderd door castratie

We vonden dat effecten op de blaasfunctie gecorreleerd waren met macroscopische veranderingen in de blaas van de muis op PO-en CPO-muizen. Op het moment van muizenoffer 4 weken na PO, leken schijnblaas normaal in grootte, maar PO en CPO blaas waren grofweg vergroot (figuren 2A,C–E)., Na dissectie van de blaas distale naar de blaas nek ligatuur, blazen werden uitgedrukt van urine en gewogen. Hier vonden we een verhoogd blaasgewicht bij de PO-muizen in vergelijking met zowel de schijnoperatie als de CPO-muizen. CPO muizen vertoonden geen gewichtstoename in vergelijking met schijnchirurgie muizen (figuur 2B). Histologische evaluatie van blazen van deze muizen werd uitgevoerd met H&e kleuring en blaasgebied, omtrek en dikte werden vergeleken., Zowel CPO-als PO-muizen vertoonden een toegenomen oppervlakte en omtrek in vergelijking met schijnchirurgiemuizen, als gevolg van veranderingen als gevolg van verhoogde blaasdruk na PO (figuren 2F,H). Echter, verhoogde blaasdikte werd alleen gezien bij PO muizen (figuur 2G). Dit gecorreleerd met de lagere blaas gewichten bij CPO muizen, wat suggereert dat de toename van de blaas grootte is voornamelijk te wijten aan “stretching” van de blaas spier in tegenstelling tot echte blaas spier hypertrofie of hyperplasie.

Blaasfibrose neemt toe na gedeeltelijke obstructie van de Blaasuitlaat

om te onderzoeken of de toename in blaasmassa en blaaswanddikte uitsluitend te wijten was aan spierhypertrofie / hyperplasie of een component van fibrose betrokken was, werd histologisch onderzoek van schijn -, PO-en CPO-muisbladeren uitgevoerd 4 weken na obstructie. Dit werd gedaan gebruikend zowel Masson trichrome het bevlekken evenals fibrosis marker-specifieke immunofluorescentie (Figuur 4)., Zoals verwacht werd bij PO-muizen, na obstructie, de blaas verhoogde Col/SM ratio ‘ s gevonden. Bij castratie werd de verhoogde Col / SM-verhouding niet meer gevonden (figuur 4B). Hoewel het volume van de luminale blaas bij CPO-muizen was verhoogd, vertoonde de spierlaag geen hypertrofie zoals blijkt uit dezelfde dikte van de blaaswand als schijnchirurgiemuizen. Verder toonde evaluatie van fibrosespecifieke markers vimentin, Col1a1 en FSP-1 door immunofluorescentie een verhoogde expressie aan bij PO-muizen in vergelijking met schijnmuizen, met een overeenkomstige afname in expressie bij CPO-muizen., Het lijkt erop dat castratie omstandigheden creëert waarin niet-fibrotische blaas remodellering optreedt, met het argument voor een potentiële rol van testosteron specifiek in het bemiddelen van een fibrotische reactie op blaasverwonding.

introductie van exogeen testosteron keert de gunstige effecten van castratie na partiële obstructie van de blaas Outlet

we hebben aangetoond dat castratie in de setting van PO de post-obstructieve remodellering met betrekking tot blaashypertrofie/hyperplasie en fibrose zal verminderen. Om aan te tonen dat dit een testosteron-specifieke reactie is, na castratie, onderging een cohort van muizen PO-en testosteronsuppletie. Hier gebruikten we ofwel testosteron of het verminderde product dihydrotestosteron (DHT)., DHT heeft 10 keer de affiniteit voor de androgen receptor in vergelijking met testosteron en kan niet worden aromatized aan oestrogeen, waardoor de kans dat de veranderingen die optreden van testosteron suppletie zijn toe te schrijven aan het verhogen van oestrogeen niveaus. Max ongeldig volumes zoals bepaald door VSOP waren significant lager in CPO plus testosteron (CPOT) of CPO plus DHT (CPOD) muizen in vergelijking met CPO muizen (figuur 5A). Macroscopische en microscopische veranderingen waargenomen bij PO muizen (maar geen CPO muizen) verschenen opnieuw in CPOT en CPOD blazen., Blaasgewichten waren significant verhoogd bij CPOT en cpod muizen in vergelijking met CPO muizen (figuur 5B). CPOT en cpod blazen hadden ook verhoogde Col / SM ratio ‘ s vergeleken met CPO (figuur 5D). Fibrosis markers waren ook verhoogd in CPOT en CPOD in vergelijking met CPO blazen als reactie op Masson ‘ s trichrome vlek (figuren 5C,E). Deze bevindingen tonen aan dat exogene vervanging van testosteron bij gecastreerde mannelijke muizen de pathologische effecten van obstructie van de urineblaas volledig herstelde., Kortom, de effecten van castratie en testosteronvervanging ondersteunen sterk een rol voor mannelijke androgeen in de pathogenese van blaasobstructie.

discussie

jongens met PUV worden kort na de bevalling chirurgisch verwijderd van de obstructieve folders. Echter, ondanks het verlichten van de blaasuitlaat obstructie bij deze kinderen, veel patiënten met PUV vooruitgang naar blaas verslechtering die schone intermitterende katheterisatie om voldoende leeg de blaas (3). Deze veranderingen werden vaak gezien na de puberteit., De klinische veranderingen bij patiënten met geresecteerde kleppen werden eerder toegeschreven aan fysiologische veranderingen in verband met de adolescentie, zoals verhoogde urinefiltratie en niet aan hormonale veranderingen (1, 5, 9). Onze bevindingen suggereren echter dat androgeen een belangrijkere rol kan spelen dan eerder gewaardeerd. We vinden dat de aanwezigheid of afwezigheid van androgeen specifiek de cellulaire veranderingen beïnvloedt die na obstructie, in het bijzonder fibrose optreden.,

informatie uit studies waarin testosteron werd aangevuld bij patiënten met een lagere urinewegaandoening kan inzicht geven in de effecten van androgeen op de blaasziekte. Deze gegevens zijn relatief schaars, voornamelijk afkomstig van retrospectieve of prospectieve observationele studies en studies waarin testosteron werd toegediend aan hypogonadale of eugonadale mannen. Deze studies suggereren echter dat testosteronsuppletie LUTS niet verergert (10, 11)., Specifiek, hebben de veelvoudige studies een verbetering van IPSS-score bij mannen getoond die androgen suppletie ontvangen, hoewel veel van deze niet specifiek studiemensen met bekende obstructie van de blaasuitlaat, maar eerder een cohort omvatten die met testosteronsuppletie wordt behandeld en variërende graden van LUTS bij baseline hebben. In één studie werden patiënten met een bekende obstructie van de blaashals uitgesloten. Koritsiadis et al., vergelijkt specifiek symptomen en urodynamische parameters op druk-flow studies van hypogonadale en eugonadale mannen en vond serum testosteronspiegel negatief gecorreleerd met detrusor druk bij max flow, maar niet IPSS of andere urodynamische parameters (12).

het effect van testosteron op de detrusorspier van de blaas is ook onderzocht in diermodellen. Tek en collega ‘ s vonden dat de testosteronsuppletie van chirurgisch gecastreerde ratten resulteerde in een verminderde collageen aan gladde spierverhouding en verhoogde cystometrische capaciteit (13). Shortliffe et al., (14) vond dat testosteronvervanging bij chirurgisch gecastreerde ratten ook geassocieerd was met een verhoogde gladde spier van de blaas en een verhoogde blaasmassa (14). Samen geven deze studies aan dat in onbelemmerde ratten, testosteron detrusor vlotte spiergroei door een nog onduidelijk mechanisme bevordert. In een ischemie-reperfusie blaasletsel model bij mannelijke konijnen, Chuang et al. aangetoond dat castratie beschermend was door afname van blaasfibrose en verminderde expressie van verschillende fibrosegerelateerde markers (8)., Testosteronsuppletie van deze gecastreerde konijnen leidde tot verhoogde detrusor-fibrose na blaasletsel. Onze bevindingen weerspiegelen deze bevindingen en vertegenwoordigen de eerste studie van het effect van testosteron op de reactie op blaasletsel van PO bij juveniele muizen.

tegelijkertijd maakte het gebrek aan bevindingen in de literatuur ons verrast door onze eerste bevindingen. Een mogelijke zorg die we hadden was dat de muizen niet voldoende belemmerd waren en dat onze bevindingen bij gecastreerde muizen een groep vertegenwoordigden waarin obstructie gewoon niet voorkwam., Uiteindelijk weten we dat dit niet waar is omdat blazen in de CPO-groep in eerste instantie voiding vlekken hadden zoals de geblokkeerde groep, abnormale druk hadden door cystometrie, en remodele blazen hadden. In feite waren de blazen van CPO-muizen heel anders dan shams, wat aangeeft dat de PO-operatie diepgaande effecten veroorzaakte. Onze interpretatie van deze bevindingen is dat in de uren na de operatie de druk in de blaaswand toeneemt en dat bij normale muizen collagenen en andere verstijvingsmatrices worden geconstrueerd om scheuren van de blaas in de buik te voorkomen., Blazen van CPO muizen hadden zeer weinig afzetting van collageen binnen de detrusor spier, maar op hetzelfde moment, werd zeer groot met dunne wanden. Het is mogelijk dat wanneer de fibrotische respons in een hogedrukblaas wordt verminderd, deze zich uitstrekt om de urine die zich ophoopt, op te vangen. Dit is typerend voor wat we zagen in CPO, maar niet PO en CPOT blazen. Zo veronderstellen we dat de rol van testosteron specifiek kan zijn in het bemiddelen van de fibrose in de blaaswand.,hoewel ons werk specifiek een blaasmodel gebruikte om de rol van testosteron op spierfibrose te bepalen in reactie op gladde spierletsel, geloven wij dat dit onderzoek belangrijk zal blijken te zijn in veel fibrotische ziekteprocessen die een geslachtsverband hebben. In feite is dit ondersteund door een paar studies in de literatuur. Cho et al. aangetoond dat orchiectomie verminderde renale fibrose gezien na ureterale obstructie. In een muismodel met unilaterale ureterale obstructie vertoonden de nieren van mannelijke muizen een verhoogde expressie van Alfa-SMA en collageenafzetting (15)., Vergelijkbaar met ons blaasmodel van obstructie, werd deze fibrotische respons geminimaliseerd als gelijktijdige orchidectomie werd uitgevoerd met ureterale obstructie. Analoge bevindingen werden gemeld in een muismodel met cardiale fibrose secundair aan drukoverbelasting. Hier werden fibrotische veranderingen in de linker ventrikel afgezwakt door orchidectomie. Dit omvatte een afzwakking van de tgfß signalerende weg, bekend om belangrijk te zijn voor het bevorderen van myofibroblastdifferentiatie (16). Leeftijdsgerelateerde cardiale en renale fibrose werd ook verzwakt door orchidectomie bij mannelijke muizen (17)., Verder werd in een studie door Zhu en collega ‘ s, de androgen receptor op vasculaire gladde spiercellen betrokken bij testosteron-gestimuleerde gladde spier calcificatie. Met behulp van een vasculaire gladde spiercellen afgeleid van een gladde spier-specifieke androgeen receptor knockout muis, calcificatie werd afgestompt in reactie op testosteron behandeling in vergelijking met wild type gladde spiercellen (18). Aldus, vindt een toenemend aantal studies, met inbegrip van die van ons, een associatie tussen testosteron en de pathologische veranderingen verbonden aan fibrose.,

het mechanisme achter de rol van testosteron bij het moduleren van de detrusor-respons op letsel blijft onverklaard. Het verdere werk die de stroomafwaartse gevolgen van testosteron in detrusor spier onderzoeken kon nieuwe therapeutische doelstellingen onthullen die zouden kunnen worden gebruikt om te verhinderen of op zijn minst het ongunstige Weefsel remodelleren gezien in het plaatsen van PO te verbeteren. Bovendien zouden de dosis-responsstudies kunnen worden uitgevoerd om te bepalen bij welke serumconcentraties van testosteron tot ongunstige remodellering leiden. Het is aangetoond dat oestrogeen weefselhypoxie en geassocieerd detrusor-letsel in diermodellen afzwakt., De verdere studie van het samenspel tussen testosteron en oestrogeen in het moduleren van de detrusor spierreactie op verwonding kan ook helpen om deze weg verder te verduidelijken.

conclusie

juveniele mannelijke muizen met partiële blaasuitlaat obstructie hebben kleinere hogedruk blazen die fibrotisch zijn. Castratie werd geassocieerd met grotere lege volumes, lager blaasgewicht en minder detrusor-fibrose. Vervanging van testosteron in castraatmuizen draaide deze gevolgen om., Dit geeft aan dat testosteron een rol speelt bij het wijzigen van wijzigingen aan detrusor spier na gedeeltelijke blaasafzet obstructie bij muizen. Daarom stellen we voor dat verhoogde niveaus van testosteron bij jongens met PUV kunnen bijdragen aan de verminderde blaasfunctie.

Ethics Statement

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de chirurgische richtlijnen, Animal Care and Use Committee. Het protocol werd goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee.

Auteursbijdragen

AF, PF, DB, NK en GS gegevensverzameling en-analyse., AF, PF, RD, en EG conceptie, ontwerp, en manuscript schrijven.

belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relatie die als een potentieel belangenconflict kon worden opgevat.

financiering

Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van de Hartwell Association aan EG.