Integral membraanproteïnen

Integral membraanproteïnen

Integral membraanproteïnen (IMPs) fungeren als gateways naar cellen. Alle cellen en organellen zijn ingekapseld in een ondoordringbare lipide bilayer en de IMPs die we bestuderen zijn ingebed in deze membranen. Zij zijn de in-en uitgangen voor vele ionen, voedingsstoffen, afvalproducten, hormonen, drugs en grote moleculen zoals eiwitten en DNA. Zij zijn ook verantwoordelijk voor een groot deel van de communicatie tussen cellen en hun omgeving., Cellen kunnen een grote verscheidenheid van deze eiwitten maken, ongeveer 30% van de genen in de menselijke genoomcode voor membraaneiwitten, en toch weten we relatief weinig over deze moleculen.

membraaneiwitten zijn helaas notoir moeilijk te hanteren en te bestuderen, omdat ze zijn ontworpen om binnen de hydrofobe omgeving van de lipide bilayer te zitten. Ze hebben de neiging om onstabiel wanneer gewonnen uit hun inheemse omgeving en we moeten detergenten toe te voegen aan het hydrofobe oppervlak te dekken., Om de functie van deze proteã nen te begrijpen en te controleren is het essentieel om informatie over hun driedimensionale structuur te hebben, die gewoonlijk door röntgenkristallografie wordt verkregen. Nochtans heeft de moeilijkheid om deze proteã nen te behandelen het moeilijk gemaakt om de structuren op te lossen, en tot op heden zijn er minder dan 300 bekende structuren van membraanproteã nen, minder dan 0.5% van alle bekende structuren. Voor hogere eukaryotes is het verhaal nog meer grimmig, met slechts 20 structuren van menselijke GMP ’s en minder dan 50 zoogdier GMP’ s opgelost., Membraanproteã nen zijn daarom één van de belangrijkste resterende grenzen van structureel biologieonderzoek. Bij het SGC passen we nu onze state-of-the-art high-throughput methoden toe om de knelpunten in membraaneiwitonderzoek te overwinnen, zodat we op betrouwbare wijze zuivere membraaneiwitmonsters en structuren van deze fascinerende en medisch kritische moleculen kunnen leveren.

medisch belang

het medisch belang van deze enorme familie van eiwitten kan niet worden overschat., De veranderingen in membraanproteã nen zijn betrokken bij vele gemeenschappelijke ziekten, met inbegrip van hartkwaal, waar slecht werkende ionenkanalen vaak betrokken zijn. Geneesmiddelen gericht op calciumkanalen kunnen problemen zoals hoge bloeddruk en angina controleren. Membraanproteã nen zijn betrokken bij kanker, waar fouten in signalerende wegen kunnen leiden tot cellen die uit controle verdelen. Vaak worden de specifieke membraanproteã nen overgeproduceerd in kankercellen en zijn daarom doelstellingen voor drugtherapie. Ziekten van de hersenen zoals migraine, depressie en Alzheimer zijn allemaal gekoppeld aan problemen met transporters en kanalen., Cystic fibrosis wordt veroorzaakt door mutaties in het cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gen dat codeert voor een chloride ion kanaal.

omdat veel membraaneiwitten aan het oppervlak van cellen zitten, zijn ze gemakkelijk beschikbaar voor geneesmiddelen met kleine moleculen die in het bloed circuleren. Het is daarom niet verwonderlijk dat meer dan 50% van kleine molecuuldrugs aan membraanproteã nen binden. G-eiwit gekoppelde receptoren en kanalen zijn in dit opzicht bijzonder belangrijk, maar ABC-transporters en opgeloste dragers zijn ook doelen voor medicamenteuze therapie., Ons begrip van vele andere ziekten, en ons vermogen om deze ziekten te behandelen zou sterk profiteren van meer structurele en functionele informatie over de betrokken eiwitten. We hopen dat we door het oplossen van de structuren van deze eiwitten, het begrijpen van de onderliggende biochemie en interacties met substraten en remmers, kunnen zorgen voor effectievere behandelingen voor veel ziekten.

de SGC-en integral membraaneiwitten

het SGC heeft uitgebreide ervaring in het oplossen van structuren van oplosbare menselijke eiwitten met behulp van zeer efficiënte systemen met hoge doorvoer., In de afgelopen twee jaar hebben we deze methoden aangepast aan het oplossen van structuren voor menselijke membraaneiwitten. We hebben 186 menselijke membraaneiwitten uit diverse families gescreend, een reeks constructies voor elk eiwit geselecteerd, geschikte reinigingsmiddelen voor zuivering geïdentificeerd en vervolgens het purificaiton opgeschaald en deze eiwitten gekristalliseerd. We hebben 3 membraaneiwitten gekristalliseerd en onze eerste structuur opgelost, een proces dat minder dan twee jaar duurde van de eerste kloon tot de structuur.,

we hebben de eerste structuur van een menselijke ABC transporter opgelost, een klasse van eiwitten die betrokken zijn bij transport van kleine moleculen, multi-drug resistentie en ziekten zoals cystische fibrose en diabetes. Ons eerste succesvolle doel is de menselijke mitochondriale ABC transporter, ABCB10, die is ingebed in het binnenste membraan van mitochondriën. ABCB10 wordt overexpressie tijdens erytroïde differentiatie, het proces dat rode bloedcellen vormt. het is overexpressie in het beenmerg, het hart en de lever., Er is nu bewijs dat wanneer ABCB10 expressie wordt verminderd in cellen, ze gevoeliger zijn voor oxidatieve stress en dat ABCB10 kan worden betrokken bij de bescherming van het hart tijdens een hartaanval.

Technologies for studying IMPs

We ontwikkelen generieke methoden die de hoge doorvoer bepaling van structuren van menselijke membraaneiwitten mogelijk maken. Wij selecteerden het systeem van de de celuitdrukking van baculovirus/insect dat een lipidesamenstelling dicht bij dat van menselijke cellen verstrekt en een bewezen hoog productieplatform is., Voor elke doelproteã ne produceren wij een reeks constructen van variërende lengte en verschillende affiniteitmarkeringen, met inbegrip van het volledige lengtegen en een reeks truncations om potentieel wanordelijke gebieden te verwijderen. Het hoge scherm van de productieuitdrukking wordt gebruikt om proteã nen te identificeren die kunnen worden gebruikt om milligramhoeveelheden IMPS voor kristallisatie te zuiveren. Elk eiwit wordt eerst gezuiverd in dodecyl maltoside (DDM) detergent en vervolgens gescreend op stabiliteit in een reeks verschillende detergenten om de optimale voorwaarden voor stabiliteit en kristallisatie te identificeren.,

we hebben methoden ontwikkeld voor hoge doorvoer nanodrop kristallisatie en manipulatie van fragiele membraaneiwitkristallen. We hebben efficiënte systemen ontwikkeld voor het screenen van membraaneiwitkristallen voor diffractiekwaliteit als methode voor kristallisatieconditonoptimalisatie. We hebben ook onze gegevensverzameling en analyse van diffractiegegevens geoptimaliseerd met behulp van intense synchrotron microfocus beamlines, beschikbaar bij resources zoals Diamond Light Source Ltd, in Oxfordshire., Waar mogelijk wordt de kristallisatie uitgevoerd met gebonden liganden en inhibitors om één enkele inheemse Bouw vast te leggen en belangrijke inzichten in functie en drugontwerp te verstrekken. We zijn ook van plan om antilichaamfragmenten te genereren tegen onze gezuiverde eiwitten voor gebruik als affiniteitsreagentia en kristallisatiehulpmiddelen.