middellange-keten vetzuren verlagen serumcholesterol door vermindering van de intestinale galzuurreabsorptie in C57BL / 6J muizen

dieren en diëten

mannelijke C57BL / 6J muizen (4 weken oud, n = 80) werden gekocht van het Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (License No. SCXK: JING2009-0007) en gehuisvest in een temperatuur gecontroleerde ruimte (22 ± 2 °c, 40% tot 60% vochtigheid) met een 12-h licht/donker cyclus., De Animal Care and Use Committee van het Chinese PLA General Hospital keurde alle experimentele procedures goed.

muizen kregen een basaal dieet (Ain-93G dieet, gekocht van de Academie voor Militaire Medische Wetenschappen) gedurende de eerste week voor aanpassing. Tien muizen werden willekeurig gekozen en kregen een basaal dieet als normale controle, en de overige muizen kregen een cholesterolrijk (CR) dieet aangepast van het Ain-96G dieet. Twee weken later werden bloedmonsters verzameld van de mandibulaire veneuze plexus., Muizen met serum-TC-spiegels Die 2 standaarddeviaties groter waren dan de normale controle (goed voor 67% van de muizen die het CR-dieet kregen) werden willekeurig ingedeeld in drie groepen (n = 12 in elke groep). Elke groep kreeg gedurende 16 weken een ander dieet (Tabel 1): cholesterolrijk en middellangketentriglyceride (CR-MCT), cholesterolrijk en langketentriglyceride (CR-LCT) of CR. Nisshin Oillio (Tokio, Japan) schonk de MCT ’s (C8:0 en C10:0) en LCT’ s (lange keten triglyceriden, sojaolie). Cholesterol werd gekocht bij Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)., Het Beijing Institute of Nutrition Resources (Beijing, China) heeft de vetzuursamenstellingen van de cr-MCT en CR-LCT diëten gemeten (Tabel 2). Het lichaamsgewicht en de voedselinname werden wekelijks gecontroleerd.,

Bloed, ileum, gal en faeces bemonstering

Vijf muizen werden willekeurig gekozen uit elke groep na 16 weken van de voeding opnemen dieet inname en uitscheiding in faeces met behulp van aparte metabole kooien voor 3 dagen., Feces werden gevriesdroogd, gewogen, verpulverd en opgeslagen bij − 80 °C voor verdere analyse. Alle muizen werden ‘ s nachts (ongeveer 12 uur) gevast voordat onder anesthesie bloedmonsters uit de aorta ventralis werden genomen (xylazinehydrochloride). Serum werd verzameld na centrifugatie van de bloedmonsters. Een microcapsule werd gebruikt om de galblaaswand te doorboren en de gal te extraheren, en elk galmonster werd 30 minuten gecentrifugeerd bij 16.000 g. Het supernatans werd verzameld en opgeslagen bij-80 °C., Ileumweefsels werden verwijderd en gespoeld met een ijskoude zoutoplossing, en porties werden onmiddellijk bewaard bij-80 °C voor verdere analyse.

meting van serumlipidenprofielen

Serum TC en triglyceride (TG) werden aan het einde van het experiment bepaald met commerciële kits uit Wako (Osaka, Japan). High-density lipoproteïne-cholesterol (HDL-C) en low-density lipoproteïne-cholesterol (LDL-C) werden gemeten met behulp van sedimentmethoden en een commerciële kit van Abcam (Cambridge, UK). Serum totaal galzuur (TBA) werd gemeten met behulp van een commerciële kit van Blue Gene (Shanghai, China)., Alle instructies van de fabrikant werden strikt opgevolgd.

analyse van galzuren in feces en gal met behulp van HPLC-MS

de methoden voor de bereiding en bepaling van galzuren in feces en gal werden uitgevoerd volgens onze vorige studie en rapporten van Steiner et al. . Een Shimadzu LC-20 AD High-performance liquid chromatography system (Shimadzu, Kyoto, Japan) gekoppeld aan een Applied Biosystecm 3200 Q TRAP massaspectrometer met een electrospray ionisatie (ESI) bron (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) werd gebruikt. De HPLC-en MS-systemen werden gecontroleerd gebruikend analist 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., De bovengenoemde materialen werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). Primaire galzuren, waaronder CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA en GCDCA, en secundaire galzuren, waaronder DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA en gdca, in gal en feces werden bepaald door de retentietijden.

kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)

monsters uit weefsel van de dunne darm (ongeveer 100 mg) werden gewassen met ijskoude PBS en gehomogeniseerd. Totaal RNA uit weefsels en cellen werd geïsoleerd met behulp van Trizol-reagens (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, no. R6812). Primers werden ontworpen met Primer Express 3.,0 software gebaseerd op de mRNA-sequenties uit een database (Tabel 3) en gesynthetiseerd door Invitrogen (Beijing, China). Methoden voor RNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) worden beschreven in onze vorige publicaties. qRT-PCR werd uitgevoerd met behulp van een één-stap SYBR ® PrimeScript ® RT-PCR Kit (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China). Versterking werd uitgevoerd met behulp van een BIO-RAD iCycler Thermal Cycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). De relatieve mRNA-expressieniveaus werden bepaald met behulp van de comparative critical threshold (Ct) – methode (in een afzonderlijke buis)., Het huishoudingsgen β-actin werd gebruikt als controle voor normalisatie.

Western blot assay

Western blot analyses van dunne darmweefsel en gekweekte cellen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven . Equivalente hoeveelheden eiwit van elk monster werden bereid en gescheiden met behulp van SDS-PAGE (12% gels) gevolgd door elektrotransfer naar PVDF-membranen., Membranen werden gedurende 2 uur geïncubeerd met blokkerende oplossing (Tris-gebufferde zoutoplossing, 8% vetvrije droge melk), gevolgd door incubatie met specifieke antilichamen bij 4 °C ‘ s nachts. Membranen werden uitgebreid gewassen in tbst (Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween, met 0,5% Tween-20 in TBS) en geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen in tbst gedurende 1 uur. membranen werden verder gewassen in tbst, en banden werden gedetecteerd met behulp van chemiluminescentiedetectiemiddelen. Blot densitometrie werd uitgevoerd, en de banden werden geanalyseerd met behulp van ImageJ software., Antilichamen gericht op de apicale natrium-afhankelijke galzuur transporter( ASBT), ileale galzuurbindend eiwit (I-BABP) en organische opgeloste transporter α/β (Osta/β) werden gekocht bij Abcam (Cambridge, UK). Secundaire antilichamen tegen geit IgG werden verkregen uit Sun Biomedical Technology Co. (Peking, China).

immunofluorescentie

Ileumweefsel gefixeerd met 4% gebufferd paraformaldehyde werd ingebed in paraffine en 4-µm dikke secties werden bereid. De secties werden gedeparaffiniseerd en gedoofd in 3% H2O2 gedurende 15 minuten om endogene peroxidase te blokkeren., Secties werden gewassen in PBS en geïncubeerd met een anti-I-BABP antilichaam in PBS (1:50 verdunning) gedurende 1 uur bij 37 °C. Een FITC-geconjugeerd (fluoresceïne isothiocyanaat) antilichaam werd toegevoegd bij een 1:50 verdunning en geïncubeerd gedurende 0,5 uur bij 37 °C. secties werden gewassen en PI (propidium jodide) werd gebruikt om de kernen te bevlekken. I-BABP werd afgebeeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Bx60, Olympus, Ina, Japan). I-BABP werd waargenomen als groene fluorescentie, en de kern werd waargenomen als rode fluorescentie .,

Caco-2 celcultuur

De Caco-2 cellijn werd verkregen van het Cell Resource Center, Peking Union Medical College (het hoofdkwartier van de National Infrastructure of Cell Line Resource) op Sept. 20, 2016. PCR en cultuur bevestigden dat de cellijn vrij van mycoplasma besmetting werd gecontroleerd. De species oorsprong van deze cellen werd bevestigd gebruikend PCR. De identiteit van de cellijn werd geverifieerd met behulp van STR-profilering (FBI, CODIS) . Alle resultaten zijn beschikbaar op de website (http://cellresource.cn)., Caco – 2 cellen werden gekweekt in Dulbecco ’s modified Eagle’ s medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren. Caco – 2-cellen werden op 37 °C gehouden in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 en 95% lucht. Het medium werd om de 2 dagen vervangen. De DMEM, FBS, 1% niet-essentiële aminozuren, en andere materialen werden gekocht van de nationale infrastructuur van cellijn Resource (Beijing, China) of Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA).,

caprylzuur permeabiliteit assay door Caco – 2 cel monolagen

voor galzuur reabsorptie experimenten, verwijzend naar het rapport van Y. Wang, et al. , cellen werden gezaaid en gekweekt op Millicell Opknoping celkweek Inserts (0,4 µm, Millipore, Molsheim, Frankrijk) gedurende 21 dagen om samenvloeiende en zeer gedifferentieerde cel monolagen te verkrijgen. De vorming van functionele epitheliale monolagen werd gevolgd door meting van de transepitheliale elektrische weerstand (teer) met behulp van een Millicell-ERS meter (Millipore) voorafgaand aan experimenten., De cellulaire morfologie werd waargenomen met behulp van een elektronenmicroscoop en de permeabiliteit werd bepaald met behulp van Lucifer Yellow (Sigma, MO, USA) als marker.

de bereiding van vetzuren en CA werd uitgevoerd zoals beschreven door X. Zhang, et al. . Vetzuren en CA werden gemeten en opgelost in ethanol en vervolgens verdund met celkweekmedium dat 20 mg/L endotoxinevrij BSA bevat tot een eindconcentratie van 50, 100 of 200 µmol/L (ethanol< 0,1%). De opgeloste vetzuren en CA werden gedurende 1 uur in een waterbad bij 37 °C geïncubeerd alvorens aan de cellen toe te voegen., Caprylzuur( C8: 0), caprinezuur (C10:0), stearinezuur (C18:0) en oliezuur (C18:1) werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA).

de apicale (AP) en basolaterale (BL) zijden van de monolaag werden gewassen met Hank ‘ s Balanced Salt Solution (HBSS) en gelijkmatig verdeeld in serumvrij volledig medium gedurende 15 minuten. Het medium in de AP werd vervangen door vers medium dat CA (200 µmmol/L) bevat of gemengd met een van de vetzuren (C8:0, C10:0, C18:0 of C18:1) bij 50, 100 of 200 µmol/l., De levensvatbaarheid van de cellen van Caco – 2-cellen in verschillende omstandigheden werd beoordeeld met de WST-1 cell cytotoxicity assay (Fig. 1). Het medium met een van de vetzuren werd gedefinieerd als de”C8:0, C10:0, C18:0 of C18: 1 groep”. De “controlegroep” bevatte geen vetzuren, en de “blanco groep” ontbraken CA en vetzuren. Alleen vers medium werd gebruikt in de BL. De media van de AP-en BL-zijden werden 2 uur later verwijderd en opgeslagen voor analyses van CA met behulp van HPLC-MS., De schijnbare permeabiliteit (Papp) werd berekend met de volgende vergelijking: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ is het uiterlijk van de verbinding in het ontvangstcompartiment, dt is de tijd, C0 is de concentratie in het donorcompartiment en A is de oppervlakte van de insert).

I-BABP expressieniveaus in Caco – 2 cellen

Caco-2 cellen werden gezaaid in een 6-Wells plaat (Corning, NY, USA) en gekweekt tot totale samenvloeiing met hoge differentiatie om de effecten van Mcfa ‘ s op I-BABP te bevestigen . Het kweekmedium werd voorafgaand aan experimenten vervangen door medium met delipidized FBS gedurende 24 uur., Werden de cellen gewassen met ijs-koud phosphate buffered saline (PBS) en geïncubeerd met vers medium met CA 200 µmol/L (gedefinieerd als CA-groep) of CA gemengd met een van de vetzuren (C8:0, C10:0, C18:0 of C18:1) op 200 µmol/L (gedefinieerd als de “C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA of C18:1+CA group”) of C8:0 of C10:0 op 200 µmol/L zonder CA (gedefinieerd als “C8:0-groep en C10:0 groep”) voor 24 uur. En de lege groep was zonder vetzuren en CA. Het medium werd verwijderd en de cellen werden drie keer gewassen met ijskoude PBS., Totaal RNA en eiwit werden geïsoleerd en verzameld voor verdere analyses van I-BABP mRNA en eiwitexpressie niveaus.

statistische analyse

alle gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie, gevolgd door de onafhankelijke t-test om de significantie van het verschil tussen groepen te bepalen met behulp van SPSS-softwareversie 17.0. P < 0,05 werd statistisch significant geacht.